本發(fā)明屬于樹木育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法。

背景技術(shù)：

赤松(Pinus densiflora)，主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯東南部及我國(guó)東部，可作庭院、荒山造林的樹種，但易感染松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)而大量死亡，對(duì)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞。由于常規(guī)種苗繁殖系數(shù)低，選育出的抗病材料難以滿足大規(guī)模林業(yè)生產(chǎn)的需求。為了大量快速繁殖已選優(yōu)良抗病基因型，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，對(duì)赤松離體組織培養(yǎng)技術(shù)的研究顯得尤為重要。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有繁殖系數(shù)大、周期短、結(jié)構(gòu)完整、再生率高、不受季節(jié)影響等特點(diǎn)(Gupta et al,1993)，是植物大規(guī)模無性繁殖的一種主要手段(汪小雄等，2006；Stasolla and Yeung,2003)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生成功獲得50多種針葉樹體細(xì)胞胚或體細(xì)胞胚再生植株(孫志強(qiáng)等，2010)，其中火炬松(Pinus taeda)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)和輻射松(Pinus radiata)等樹種體細(xì)胞胚發(fā)生已經(jīng)應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)(張守攻，2004)。Taniguchi(2001)首次對(duì)日本赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行研究，建立了胚性細(xì)胞系和進(jìn)行體細(xì)胞胚胎成熟試驗(yàn)，但轉(zhuǎn)化率非常低；隨后，Maruyama等(2005)、Maruyama和Hosoi(2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈傷組織增殖、體細(xì)胞胚胎成熟、萌發(fā)及轉(zhuǎn)化的影響因子，但存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、胚性愈傷組織能力的喪失，體胚成熟與轉(zhuǎn)化率低等問題。而國(guó)內(nèi)外目前對(duì)赤松組織培養(yǎng)器官發(fā)生植株再生有所研究(朱麗華等，2010；李清清，2012)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究報(bào)道很少(吳靜等，2015)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，為抗病赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生條件進(jìn)行優(yōu)化以提高其體細(xì)胞胚胎的質(zhì)量和數(shù)量，從而來提高萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率，為抗性赤松的種質(zhì)資源保存、基因轉(zhuǎn)化、體胚苗的工廠化生產(chǎn)提供可行的技術(shù)支撐。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，包括胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖，體細(xì)胞胚的成熟、萌發(fā)和轉(zhuǎn)化；所述的體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)采用液—固增殖-固成熟方式進(jìn)行。

所述的液—固增殖-固成熟為：取生長(zhǎng)良好的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)入不含激素的DCR液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩形成良好的懸浮體系，取培養(yǎng)好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，用脫脂棉吸取水分，待水分瀝干后，將有培養(yǎng)物的濾紙放入配制好的固體增殖培養(yǎng)基中，15天之后轉(zhuǎn)入固體成熟培養(yǎng)基中。

所述的體細(xì)胞胚的萌發(fā)為：將誘導(dǎo)的成熟體細(xì)胞胚22#-1水平置于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，萌發(fā)培養(yǎng)基為L(zhǎng)P，添加20g/L麥芽糖，2g/L AC，3g/L植物凝膠，pH5.8；非直射光培養(yǎng)4-7天，再放入直射光下培養(yǎng)14-17天；然后將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入WPM基本培養(yǎng)基，附加1.5mg/L IBA，0.2mg/L NAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉膠，光照培養(yǎng)1個(gè)月。

所述的體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)化為：待再生植株根伸長(zhǎng)2cm后進(jìn)行移栽，移栽前7d逐漸將封口膜揭開，使幼苗適應(yīng)外界的環(huán)境，移栽時(shí)將幼苗根部的卡拉膠小心洗掉，移栽在珍珠巖、苗圃土和河沙構(gòu)成1：1：2的基質(zhì)中，移苗一個(gè)月內(nèi)注意保持空氣濕度、溫度和基質(zhì)濕度的穩(wěn)定，3個(gè)月后移栽成活。

在所述的體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加15mg/L ABA和140g/L PEG8000。

在所述的體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加8g/L肌醇。

在所述的體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加60g/L麥芽糖。

在所述的體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加3g/L植物凝膠。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高同步化的抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，以抗松材線蟲病赤松的未成熟合子胚為外植體，通過對(duì)抗病赤松未成熟合子胚已成功誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚成熟、萌發(fā)與植株再生等試驗(yàn)，成功獲得了成熟的體細(xì)胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培養(yǎng)基上產(chǎn)生體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率高，分別為67.2％和46.5％，再生植株3個(gè)月移栽成活率為32.7％。為抗病赤松的大規(guī)模繁殖和工廠化生產(chǎn)提供了重要的科學(xué)依據(jù)，為抗性赤松的種質(zhì)資源保存、基因轉(zhuǎn)化、體胚苗的工廠化生產(chǎn)提供可行的技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1是不同糖類對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響結(jié)果圖；

圖2是肌醇濃度對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響結(jié)果圖；圖中：J1為肌醇0g/L，J2為肌醇2g/L，J3為肌醇4g/L，J4為肌醇6g/L，J5為肌醇8g/L，J6為10g/L，J7為肌醇16g/L；

圖3是抗病赤松體細(xì)胞胚胎成熟、萌發(fā)及植株再生結(jié)果圖；圖中，A1，A2：正常子葉胚；B1，B2：畸形子葉胚；C1；C2：萌發(fā)培養(yǎng)基中5d后的體細(xì)胞胚；C3：萌發(fā)培養(yǎng)基中20d后體細(xì)胞胚形成的再生植株；D1，D2：WPM培養(yǎng)基中壯苗的再生植株；E1，E2：WPM培養(yǎng)基中壯苗1個(gè)月的再生植株；F1，F(xiàn)2：WPM培養(yǎng)基中壯苗3個(gè)月的再生植株；G1：移栽后體細(xì)胞胚苗；G2：移栽后3個(gè)月體細(xì)胞胚苗。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

以下實(shí)施例所使用的材料為：抗病赤松未成熟球果于2013年6月采集于江蘇句容林場(chǎng)抗松材線蟲病赤松種質(zhì)資源庫(kù)(2004年2月從日本林木良種繁育中心引種建立)，從球果中剝離出未成熟合子胚，誘導(dǎo)出具有胚性的愈傷組織(22#-1和13#-1)，并已繼代培養(yǎng)7次，再經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)，將胚性愈傷組織生長(zhǎng)狀況良好的兩個(gè)無性系22^#-1和13^#-1作為體細(xì)胞胚胎發(fā)生的材料(吳靜，朱麗華，許建秀，吳小芹，葉建仁.抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，39(1)：17-21)。

以下實(shí)施例的結(jié)果數(shù)據(jù)采用Excel 2007處理，用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

實(shí)施例1

ABA濃度(10、15、20mg/L)、PEG(聚乙二醇)8000濃度(100、140、180g/L)進(jìn)行兩因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。將22^#-1的胚性胚柄團(tuán)(embryonic suspensor mass，ESM)轉(zhuǎn)接至設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基LP，另附加肌醇8g/L，麥芽糖60g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝膠3g/L，pH 5.8)中，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用高壓滅菌121℃20min。

抗病赤松體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、增殖和成熟試驗(yàn)在培養(yǎng)溫度設(shè)定為23±2℃的組培室中，暗培養(yǎng)，每?jī)蓚€(gè)星期觀察一次。正常體細(xì)胞胚數(shù)即每克愈傷組織形成體細(xì)胞胚數(shù)(個(gè)/g)＝正常體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)/愈傷組織鮮質(zhì)量，畸形體細(xì)胞胚數(shù)即每克愈傷組織形成體細(xì)胞胚數(shù)(個(gè)/g)＝畸形體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)/愈傷組織鮮質(zhì)量，體細(xì)胞胚數(shù)即每克愈傷組織形成體細(xì)胞胚數(shù)(個(gè)/g)＝體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)(包括正常和畸形)/愈傷組織鮮質(zhì)量。

不同ABA和PEG8000濃度對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟有顯著影響(表1)。當(dāng)ABA的濃度為15mg/L時(shí)，PEG在140g/L濃度組合下，正常體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到171個(gè)/g，均高于其他處理；當(dāng)ABA濃度為20mg/L時(shí)，正常體細(xì)胞胚數(shù)都偏低(79個(gè)/g)。添加適當(dāng)濃度的ABA可促進(jìn)體細(xì)胞胚胎單個(gè)化并進(jìn)一步發(fā)育成熟。PEG(聚乙二醇)在合適的濃度下，促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟。本實(shí)施例結(jié)果表明PEG對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟誘導(dǎo)有顯著影響。當(dāng)PEG濃度達(dá)到180g/L時(shí)，正常體細(xì)胞數(shù)反而有所下降，可見PEG的使用并不是濃度越高，正常體細(xì)胞胚數(shù)就越多，它們之間并不存在正相關(guān)。結(jié)果表明，ABA濃度為15mg/L和PEG8000 140g/L的組合最適合抗病赤松的體細(xì)胞胚成熟誘導(dǎo)。

表1不同ABA和PEG8000濃度對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響

實(shí)施例2

將22^#-1的ESM轉(zhuǎn)接在以LP為基本培養(yǎng)基，添加不同種類的糖(麥芽糖、蔗糖)及不同濃度(20、30、45、60、70g/L)，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。培養(yǎng)基附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，肌醇8g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8。培養(yǎng)基用高壓滅菌121℃20min。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同實(shí)施例1。

結(jié)果表明，糖類型及濃度對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響呈顯著差異，麥芽糖比蔗糖更能增加抗病赤松體細(xì)胞胚胎數(shù)量(圖1)。其中麥芽糖濃度為60g/L時(shí)，抗病赤松體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到235個(gè)/g，而且畸形胚也降到最低。當(dāng)糖濃度升高時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)降低并且畸形胚也多。當(dāng)糖濃度低于60g/L時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)低。因此，抗病赤松體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中，麥芽糖比蔗糖更適合進(jìn)行抗病赤松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，最適濃度為60g/L。

實(shí)施例3

將22^#-1的ESM轉(zhuǎn)接在LP基本培養(yǎng)基中，添加肌醇0、2、4、6、8、10、16g/L，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。培養(yǎng)基附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，MES 250mg/L、CH 500mg/L、VC 10mg/L、谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝膠3g/L，pH 5.8。培養(yǎng)基用高壓滅菌121℃20min。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同實(shí)施例1。

結(jié)果表明(圖2)，在缺乏肌醇的情況下，抗性赤松雖能產(chǎn)生子葉胚，但是子葉胚胚頭膨大，胚柄短小甚至不能正常發(fā)育，胚體短而粗顏色偏黃，生長(zhǎng)狀態(tài)不良，都為畸形胚；而且愈傷組織顏色偏褐，結(jié)構(gòu)逐漸緊密，生長(zhǎng)狀況明顯衰退(圖2-J1)。當(dāng)加入肌醇時(shí)(2-8g/L)，抗病赤松體細(xì)胞胚數(shù)明顯提高(圖2-J2、J3、J4、J5)。而肌醇濃度大于8g/L時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)劇增，但出現(xiàn)的都是畸形胚，胚頭膨大，胚柄短小，生長(zhǎng)狀態(tài)不佳(圖2-J6、J7)。由此表明肌醇的最適濃度為8g/L(圖2-J5)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例采用兩種凝固劑分別為植物凝膠(Phytagel)和瓊脂(Agar powder)。將22^#-1的ESM轉(zhuǎn)接在以LP為基本培養(yǎng)基，添加不同植物凝膠和瓊脂(2.5、3、3.5、4g/L)，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。培養(yǎng)基附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，肌醇8g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L，pH5.8。培養(yǎng)基用高壓滅菌121℃20min。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同實(shí)施例1。

結(jié)果表明(表2)，在培養(yǎng)基質(zhì)中瓊脂從6g/L添加至12g/L時(shí)，培養(yǎng)基都不能凝固，愈傷組織無法生長(zhǎng)，也無子葉胚形成。當(dāng)加入植物凝膠且濃度為3g/L，培養(yǎng)基凝固，軟硬適中，產(chǎn)生的子葉胚，子葉胚細(xì)長(zhǎng)，發(fā)育正常，生長(zhǎng)良好。當(dāng)植物凝膠濃度為2g/L，子葉胚生長(zhǎng)良好，但是培養(yǎng)基較軟，不易固定。當(dāng)植物凝膠濃度增為3.5g/L時(shí)，培養(yǎng)基開始偏硬，只出現(xiàn)少量非正常的子葉胚。當(dāng)植物凝膠濃度增為4g/L時(shí)，培養(yǎng)基很硬，愈傷組織干燥顏色發(fā)白，沒有出現(xiàn)子葉胚。因此，在抗病赤松發(fā)育成熟階段宜選用植物凝膠濃度為3g/L，對(duì)體細(xì)胞胚數(shù)和子葉胚的質(zhì)量有較好的影響。

表2不同凝固劑對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響

實(shí)施例5

I.液—固增殖-固成熟：取胚性細(xì)胞系22^#-1和13^#-1生長(zhǎng)良好的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)入20mL不含激素DCR液體培養(yǎng)基中，用手劇烈震蕩形成良好的懸浮體系，用1mL的移液槍吸取培養(yǎng)好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，用脫脂棉吸取水分，待水分瀝干后，將有培養(yǎng)物的濾紙放入配制好的固體增殖培養(yǎng)基中，15天之后轉(zhuǎn)入固體成熟培養(yǎng)基中。

II.固增殖—固成熟：直接用鑷子夾取生長(zhǎng)良好的胚性細(xì)胞系22^#-1和13^#-1的胚性愈傷組織于固體增殖培養(yǎng)基上，15天之后轉(zhuǎn)入固體成熟培養(yǎng)基中。

Ⅲ.液-固成熟：取胚性細(xì)胞系22^#-1和13^#-1生長(zhǎng)良好的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)入20mL不含激素DCR液體培養(yǎng)基中，用手劇烈震蕩形成良好的懸浮體系，用1mL的移液槍吸取培養(yǎng)好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，用脫脂棉吸取水分，待水分瀝干后，將有培養(yǎng)物的濾紙放入配制好的固體成熟培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)基均附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，肌醇8g/L，麥芽糖60g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8。培養(yǎng)基用高壓滅菌121℃20min。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同實(shí)施例1。

結(jié)果表明(表3)，采用三種不同培養(yǎng)方式，抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的時(shí)間明顯不同，但發(fā)育程度基本相同。當(dāng)采用方式Ⅰ(液-固增殖-固成熟)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，胚性愈傷組織經(jīng)11-12周能發(fā)育成完整結(jié)構(gòu)的成熟體細(xì)胞胚，其中22#-1的正常體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到239個(gè)/g，畸形體細(xì)胞胚數(shù)降到25個(gè)/g，且同步化程度最高。當(dāng)采用方式Ⅱ(固增殖-固成熟)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，胚性愈傷組織經(jīng)8-9周能發(fā)育成完整結(jié)構(gòu)的成熟體細(xì)胞胚，較方式Ⅰ和Ⅲ有優(yōu)勢(shì)，但正常體細(xì)胞胚數(shù)較方式Ⅰ有所下降，只有200個(gè)/g左右，畸形體細(xì)胞胚數(shù)提高，且同步化程度最低。當(dāng)采用方式Ⅲ進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，胚性愈傷組織經(jīng)12-14周才能發(fā)育成完整結(jié)構(gòu)的成熟體細(xì)胞胚，非常緩慢，且表面水漬化嚴(yán)重，正常體細(xì)胞胚數(shù)下降到最低，畸形體細(xì)胞胚數(shù)增至最高。結(jié)果表明，方式Ⅰ的正常體細(xì)胞胚數(shù)最高和畸形體細(xì)胞胚數(shù)最低，雖成熟時(shí)間較方式Ⅱ多了3周左右，但同步化程度高，所需材料少，因此，該方式適合進(jìn)行抗病赤松體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)。

表3不同培養(yǎng)方式對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響

實(shí)施例6

將誘導(dǎo)的成熟體細(xì)胞胚22#-1水平置于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，萌發(fā)培養(yǎng)基為L(zhǎng)P，添加20g/L麥芽糖，2g/L AC，3g/L植物凝膠，pH5.8。非直射光培養(yǎng)5天左右，再放入直射光下培養(yǎng)15天左右，觀察體胚的萌發(fā)狀況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。然后將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入WPM基本培養(yǎng)基，附加1.5mg/L IBA，0.2mg/L NAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉膠，光照培養(yǎng)1個(gè)月，統(tǒng)計(jì)植株轉(zhuǎn)化率。萌發(fā)率(％)＝萌發(fā)正常體胚的個(gè)數(shù)/接種體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)*100％，植株轉(zhuǎn)化率(％)＝生根的植株數(shù)/萌發(fā)正常體胚的個(gè)數(shù)*100％。

抗病赤松體胚成熟時(shí)，正常子葉胚是呈現(xiàn)乳白色或者乳黃色，子葉完全張開，可以清楚的看到有幾個(gè)子葉，并出現(xiàn)明顯的黃色細(xì)長(zhǎng)胚軸和紅色胚根(圖3A1、A2)；畸形子葉胚是呈現(xiàn)乳白色或者乳黃色，子葉未張開或胚頭膨大，胚軸短小甚至不能正常發(fā)育，胚根未形成或有點(diǎn)紅色根點(diǎn)(圖3B1、B2)。

將不同發(fā)育階段產(chǎn)生的成熟體細(xì)胞胚輕輕挑出，轉(zhuǎn)至無激素的萌發(fā)培養(yǎng)基，非直射光培養(yǎng)5d后，體細(xì)胞胚子葉由黃白色逐漸變?yōu)辄S綠色(圖3C1，C2)，后將子葉胚在光照下培養(yǎng)。光照后正常萌發(fā)的子葉逐漸張開，顏色變?yōu)樯罹G色；胚軸伸長(zhǎng)，基部有微小紅色根尖(圖3C3)，后根尖逐漸變?yōu)樯詈稚可L(zhǎng)。正常萌發(fā)的子葉胚子葉張開，胚軸伸長(zhǎng)，基部有微小紅色根點(diǎn)(圖3C3)，而畸形的子葉胚子葉很小未張開，胚軸很短或者幾乎沒有，基部有一點(diǎn)紅色小根點(diǎn)或者沒有，基部愈傷化嚴(yán)重(圖3C3)。然后將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)基中，1個(gè)月后長(zhǎng)出初生針葉，形成再生植株：正常的子葉胚胚軸較長(zhǎng)，胚根伸長(zhǎng)，1個(gè)月后長(zhǎng)出初生針葉，嫩白色根長(zhǎng)1cm左右(圖3D1、E1)；畸形胚胚軸很短，根部的愈傷組織嚴(yán)重(圖3D2、E2)。在WPM壯苗培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)3個(gè)月后，正常子葉胚初生針葉繼續(xù)生長(zhǎng)，有的還長(zhǎng)出了次生針葉，根部嫩白色，并只有一條主根，主根周圍長(zhǎng)出許多須根(圖3F1)，這時(shí)可以直接移栽；而畸形子葉胚胚在WPM壯苗培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)3個(gè)月后，初生針葉雖繼續(xù)生長(zhǎng)，但未見有次生針葉，根部棕褐色，愈傷化嚴(yán)重，有的還長(zhǎng)出若干側(cè)根(圖3F2)，移栽后可能會(huì)出現(xiàn)死亡。成熟培養(yǎng)基上產(chǎn)生體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率分別為67.2％和46.5％。

實(shí)施例7

待再生植株根伸長(zhǎng)2cm左右后進(jìn)行移栽，移栽前7d逐漸將封口膜揭開，使幼苗適應(yīng)外界的環(huán)境，移栽時(shí)將幼苗根部的卡拉膠小心洗掉，移栽在珍珠巖、苗圃土和河沙構(gòu)成1：1：2的基質(zhì)中。移苗一個(gè)月內(nèi)注意保持空氣濕度、溫度和基質(zhì)濕度的穩(wěn)定。3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。移栽成活率(％)＝植株成活的株數(shù)/移栽的株數(shù)×100％。

由抗病赤松正常子葉胚生長(zhǎng)的移栽后體細(xì)胞胚苗(圖3G1)較幼嫩，移栽3個(gè)月后抗病赤松體細(xì)胞胚苗(圖3G2)都長(zhǎng)出次生針葉，根系深入土壤，移栽體細(xì)胞胚再生植株為202棵，成活株數(shù)為66棵，移栽成活率為32.7％。