本發明涉及大百合無性繁殖技術，具體涉及一種提前打破大百合休眠的方法。

背景技術：

大百合（Cardiocrinum giganteum（Wall.）Makino），又名百合蓮、百洼等，莖卵形，葉紙質網狀脈，花白色狹喇叭形，蒴果近球形。原產中國，因其植株粗壯、高大，顯著區別于百合屬植物而得名。是我國南方常用的野生民間草藥，球徑可入藥，有性味淡，平。清熱止咳，寬胸利氣。用于肺癆咯血，咳嗽痰喘，小兒高燒，胃痛及反胃，嘔吐功能；另外球徑可編淀粉含量較高可曬干后磨粉直接食用。隨著社會經濟的快速發展和人民生活水平的不斷提高，當前以大百合為原料生產的純天然、安全、保健的食品品和醫藥用品需求量極大，而大量的采集勢必造成野生大百合資源的日益枯竭。因此，推進人工繁殖育苗的規模化、產業化進程，縮短休眠周期，對滿足制藥行業的需求，實現資源可持續發展有著積極的意義。

大百合的繁殖方法主要為主要用分球法繁殖，其次可用鱗片扦插。由于大百合球莖休眠時間較長，所以大百合規模化生產就受到限制。因此，開發一種有效的提前打破大百合休眠的方法非常重要。

技術實現要素：

本發明為了克服現有技術的不足，提供一種能克服大百合球莖休眠時間過長的問題方法，為下一步的增殖培養提供量足、質優的無菌材料，促進大百合在生產過程中快速繁殖體系的建立。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種提前打破大百合休眠的方法，包括外植體獲取、外植體消毒、外植體低溫處理和芽誘導培養工序，采集秋季生長發育成熟大百合小球作為外植體，通過對外植體無菌消毒、低溫處理后，置于適宜的溫度、濕度和光照強度條件下進行培養，誘導芽的萌發；其主要操作步驟為：

（1）外植體獲取：采集秋季生長發育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內；

（2）外植體消毒：對大百合小球進行洗滌預處理后，再用化學試劑進行消毒處理；

（3）外植體低溫處理：將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為3-5℃的冰箱或冷庫中低溫處理，放置40-50天；

（4）芽誘導培養：將步驟（3）低溫處理的大百合小球接種于誘導培養基中，再置于適宜的條件下進行室內培養，誘導芽萌發。

以上步驟（2）中所述的洗滌預處理的方法是將得到的大百合小球及時用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸低濃度的洗潔精溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內并置于流水中，沖洗15-20min。

以上所述的低濃度的洗潔精溶液是體積濃度為1.5-3.0%的洗潔精水溶液。

以上步驟（2）中所述的消毒處理的方法是將洗滌預處理后的大百合小球置于干凈燒杯內，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉到超凈工作臺上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶內倒入福爾馬林溶液滅菌液進行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。

以上步驟（3）中所述的低溫處理在將大百合小球放入冰箱或冷庫的過程中，必須保證每個大百合小球之間不發生接觸。

以上步驟（4）中所述的誘導培養基為MS培養基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+1.5-2.0 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

以上步驟（4）中所述的室內培養條件為白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃，采用日光燈培養，光照強度1600-1800lx，光照時數10h?d^{- 1}。

與現有技術相比，本發明具有以下的優點和積極效果：

1、本發明的一種提前打破大百合休眠的方法，利用球莖材料，在室內繁殖幼苗，不受季節限制，既可以滿足生產上的數量需求，又可保持母本性狀，并有效克服大百合生產過程中球莖休眠時間的過長的問題，縮短大百合休眠時間，實現了大百合的規模化生產。

2、本發明的一種提前打破大百合休眠的方法，通過對外植體進行預處理和消毒滅菌后，放入于冰箱進行低溫處理，外植體發芽率較好，萌發時間為縮短3-4個月左右，可滿足下一步的增殖培養的需要。

3、本發明的一種提前打破大百合休眠的方法，采用秋天生長發育成熟的小球作為外植體，保證了外植體活力。

4、本發明的一種提前打破大百合休眠的方法，材料易得，成本低，方法簡單，操作方便，質量保證，能實現大百合快速繁殖體系的建立，具有較好的經濟效益、社會效益和生態效益。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。

實施例1：

一種提前打破大百合休眠的方法，在9月初采集生長發育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內，及時用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為1.5%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內并置于流水中，沖洗15min。將洗滌預處理后的大百合小球置于干凈燒杯內，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉到超凈工作臺上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶內倒入福爾馬林溶液滅菌液進行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為3℃的冰箱中低溫處理，放置40天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個大百合小球之間不發生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導培養基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內，采用日光燈培養，光照強度1600-1800lx，光照時數10h?d^{- 1}，誘導芽萌發。所述的誘導培養基中所述的誘導培養基為MS培養基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+1.5 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調查，外植體發芽率為87.6%，芽苗生長正常。

實施例2：

一種提前打破大百合休眠的方法，在10月中旬采集生長發育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內，及時用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為2.0%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內并置于流水中，沖洗15min。將洗滌預處理后的大百合小球置于干凈燒杯內，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉到超凈工作臺上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶內倒入福爾馬林溶液滅菌液進行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為3℃的冰箱或冷庫中低溫處理，放置45天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個大百合小球之間不發生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導培養基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內，采用日光燈培養，光照強度1600-1800lx，光照時數10h?d^{- 1}，誘導芽萌發。所述的誘導培養基中所述的誘導培養基為MS培養基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+2.0 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調查，外植體發芽率為90.6%，芽苗生長正常。

實施例3：

一種提前打破大百合休眠的方法，于11月上旬采集生長發育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內，及時用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為2.5%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內并置于流水中，沖洗20min。將洗滌預處理后的大百合小球置于干凈燒杯內，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉到超凈工作臺上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶內倒入福爾馬林溶液滅菌液進行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為5℃的冷庫中低溫處理，放置50天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個大百合小球之間不發生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導培養基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內，采用日光燈培養，光照強度1600-1800lx，光照時數10h?d^{- 1}，誘導芽萌發。所述的誘導培養基中所述的誘導培養基為MS培養基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+1.5 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調查，外植體發芽率為90.8%，芽苗生長正常。

實施例4：

一種提前打破大百合休眠的方法，在12月上旬采集生長發育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內，及時用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為3.0%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內并置于流水中，沖洗20min。將洗滌預處理后的大百合小球置于干凈燒杯內，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉到超凈工作臺上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶內倒入福爾馬林溶液滅菌液進行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為5℃的冷庫中低溫處理，放置45天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個大百合小球之間不發生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導培養基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內，采用日光燈培養，光照強度1600-1800lx，光照時數10h?d^{- 1}，誘導芽萌發。所述的誘導培養基中所述的誘導培養基為MS培養基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+2.0 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調查，外植體發芽率為89.2%，芽苗生長正常。