1.一種抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種的創制方法,其特征在于包含以下步驟:
(1)授粉方法:以抗根腫病大白菜為母本,甘藍為父本,配置雜交組合,采用人工剝蕾去雄重復授粉的方法,取父本新鮮花粉,涂抹在母本去雄的花蕾柱頭上;
(2)胚珠培養:取授粉后10d的子房消毒滅菌,剝取子房中的胚珠接種到胚挽救培養基上,在環境25±0.5℃,光照強度50-100μmol·m–2·s–1,光照時長12-14h·d–1條件下培養25~30d,所述的胚挽救培養基為:MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖,pH為5.90~5.95;
(3)分化培養:待幼胚長至子葉形胚時,接入分化培養基誘導不定芽分化,所述的分化培養基為:MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖,pH為5.90~5.95;
(4)繼代培養:20~30d后轉入繼代培養,繼代培養基為:MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖,pH為5.90~5.95;
(5)生根培養:繼代2周后接入生根培養基誘導生根,所述的生根培養基為:1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂,pH為5.90~5.95;
(6)人工加倍:將修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中進行加倍,所述的處理條件為含2%二甲基亞砜濃度為0.4%的秋水仙素溶液中處理18-20h,處理完畢后,將根部的秋水仙素殘液沖洗干凈,最后定植于含有草炭土、珍珠巖和蛭石的穴盤中;
(7)形態學鑒定:對幼苗營養生長階段、生殖生長階段的主要形態特征進行觀察;
(8)細胞DNA相對含量測定:用流式細胞儀對后代加倍植株進行細胞DNA相對含量測定;
(9)根腫病抗性鑒定:通過菌土法接種鑒定和抗根腫病基因CRb的分子標記驗證相結合鑒定根腫病抗性,將基質滅菌后,每克滅菌土中接種0.001g病根,然后直接將鑒定材料播于菌土中,于25-28℃下培養,2個月后拔出幼苗,洗凈根部雜質,觀察發病情況;同時,利用與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13對后代植株進行分子標記鑒定,當后代材料的擴增譜帶中出現抗根腫病大白菜所具有的特異條帶時,即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。
2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(1)中所述的雜交組合的配置為:抗根腫病大白菜為母本,甘藍為父本。其中母本為引進的1份對根腫病表現免疫、攜帶CRb基因的大白菜材料。
3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(2)中子房消毒滅菌方法為:用75%的乙醇消毒1min,然后用7%(體積分數)的次氯酸鈉滅菌15min,再用用無菌水沖洗3次,每次5min。
4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(6)中秋水仙素溶液進行加倍處理時一定要沒過根部。
5.根據權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(6)中草炭土、珍珠巖和蛭石的體積比為8:1:1。
6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(9)中所述的與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13上游引物序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(9)中當后代材料的擴增譜帶中出現抗根腫病大白菜所具有的313bp特異條帶時,即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。