本發明涉及一種植物組織培養的方法，具體涉及一種速生無刺槐組培苗的生根培養方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
速生無刺槐是人工選育出的一個刺槐優良無性系新品種，豆科刺槐屬落葉喬木，樹高可達30～35m。托葉刺小而軟，1～2年生樹有刺，3年生以后刺基本脫落。樹體高大，干型通直，生長迅速，年胸徑生長量為2.5～3.0cm，年樹高生長量2m以上。葉色濃綠，花白色，有香氣，花期5月。主要分布在北部暖溫帶落葉闊葉林區，分布的城市有沈陽、大連、北京、天津、石家莊、濟南、青島等。適應性強，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿，是鹽堿地以及城市綠化的優良樹種。
速生無刺槐屬豆科刺槐屬樹種，有關無刺槐的研究尚處于起始階段，僅中國農業大學有一篇關于《無刺桅桿槐和無刺槐再生體系的研究》的報道，該文章主要是從葉片再生角度進行無刺槐的研究，主要目的是為了通過建立再生體系進行基因工程育種，文章中無刺桅桿槐和無刺槐的再生率人別為60％、50％，生根率分別為55.6％、72.2％，組培苗移栽成活率為85％。本專利主要目的是通過繼代增殖培養實現速生無刺槐的大規模生產，專利中速生無刺槐的增殖系數達到4以上，生根率達到95％以上，大棚煉苗移栽成活率達到90％以上，各項指標標準高，有利于速生無刺槐生產成本的降低，易于實現大規模的工廠化生產。
技術實現要素：
本發明的目的在于，提供一種速生無刺槐組培苗的生根培養方法，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。
本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：
一種速生無刺槐組培苗的生根培養方法，其特征在于，包括：
(1)實驗材料的選擇：
選取繼代周期為30～40天，生長健壯、葉片舒展，株高為3～5cm的速生無刺槐組培苗為實驗材料，切除基部愈傷及基部葉片，保留1cm左右的頂芽、莖段及芽團；
(2)具體實驗步驟：
(2.1)無菌外植體的獲取；
(2.2)速生無刺槐繼代增殖步驟；
(2.3)速生無刺槐生根培養步驟；
(2.4)速生無刺槐繼代培養及生根培養條件；
(2.5)速生無刺槐組培苗的煉苗與移栽。
其中，步驟(2.1)無菌外植體的獲取
選取1～2年生帶芽體的健壯根系埋于育苗基質中，待新芽萌發出來后切割成1～2cm長的頂芽或帶腋芽的莖段，剪去葉片留3～5mm葉柄，用75％酒精擦拭外植體表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下沖洗0.5～1h；在超凈工作臺上，用0.05～0.1％的升汞處理10～15min，用無菌水沖洗5～6次，接種至誘導培養基中(MS+0.01～0.1mg/L 6-BA+30g/L糖+5～7g/L卡拉膠)，每瓶接種一株，獲得的無菌外植體的成功率為80％。
其中，步驟(2.2)速生無刺槐繼代增殖步驟：
(2.2.1)試驗材料
選取步驟1中誘導出來的芽直接進行增殖培養，所選材料生長健壯、葉片舒展，利用頂芽、莖段及芽團進行繁殖，其中頂芽高0.8～1.2cm左右、莖段高0.5～1cm左右含至少一個腋芽、芽團高0.5～1cm至少含兩個小芽；
(2.2.2)速生無刺槐繼代培養的實驗方案設計
速生無刺槐繼代培養的基本培養基為改良DKW培養基，其中添加蔗糖30g/L，卡拉膠5～7g/L，土豆30g/L，pH為5.8～6.0。
選用6-BA(6-芐基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)植物生長調節劑,速生無刺槐繼代培養最佳配方為：改良DKW+0.1mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L土豆+30g/L蔗糖+5～7g/L卡拉膠，采用該配方繼代培養的速生無刺槐的最大增殖比例為4.1，且植株長高明顯，能用于生根培養的單株苗多。
其中，步驟(2.3)速生無刺槐生根培養步驟
(2.3.1)選取繼代培養的速生無刺槐組培苗，選取標準為高度1.5～3cm、健壯、葉片舒展的單株組培苗；
(2.3.2)將選取的繼代培養的速生無刺槐組培苗接種至1/2MS生根培養基上，
1/2MS生根培養基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O8.45mg/L、ZnSO4·7H2O 4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、鹽酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、5～7g/L卡拉膠；
(2.3.3)接種30天后統計生根率，生根率＝生根株數/接種株數×100％；
篩選出的最適生根配方為：1/2MS+0.01mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IBA+20g/L土豆+20g/L蔗糖+5～7g/L卡拉膠。
其中，步驟(2.4)速生無刺槐繼代培養及生根培養條件
速生無刺槐組培苗繼代及生根培養的條件為：光培養與暗培養交替進行，光培養條件為連續進行12h光照，光照強度為3000lx，培養溫度為25℃；暗培養條件為連續進行12h，溫度為20℃。
其中，步驟(2.5)速生無刺槐組培苗的煉苗與移栽
(2.5.1)生根培養30～45天的生根苗可進溫室煉苗移栽，選取葉色正常、無枯葉黃葉的健壯植株進行移栽；
(2.5.2)將速生無刺槐生根苗根系上的培養基洗凈，種植在含珍珠巖、草炭、河沙等基質的營養杯或穴盤中，濕度控制在75～80％，待新根與新葉發出后逐漸降低濕度，培養45～60天，即可得速生無刺槐容器苗，其大棚煉苗成活率為90％以上；
(2.5.3)上述所說基質配方包括上下兩層，其中上層1/3容量體積為蛭石：珍珠巖＝1:1；下層2/3容量體積為園土：草炭：河沙：珍珠巖＝2:1:1:1。該基質配方的特點是上層基質疏松透氣、保水保濕，利于煉苗前期新根及新葉的發出；下層基質營養豐富，利于后期組培苗營養生長，且根系與基質易于成團、便于容器苗運輸。
本發明的有益效果：
本發明主要目的是通過繼代增殖培養實現速生無刺槐的大規模生產，采用該方法繁殖的速生無刺槐具有如下優點：
(1)增殖系數高，平均增殖系數達到4以上；
(2)生根率高，最高可達95％；
(3)煉苗成活率高，平均為90％以上。與扦插繁殖相比，速生無刺槐組織培養繁殖的方式，生產上不受季節的限制，繁殖系數大；與再生培養相比，后代不易發生變異，操作方便，能實現大規模的工廠化生產，利于速生無刺槐的繁育及推廣。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。
實施例1
一種速生無刺槐組培苗的生根培養方法，包括：
一實驗材料
選取繼代周期為30～40天，生長健壯、葉片舒展，株高為3～5cm的速生無刺槐組培苗為實驗材料，切除基部愈傷及基部葉片，保留1cm左右的頂芽、莖段及芽團。
二具體實驗步驟
一種速生無刺槐組培苗繼代培養的方法，步驟如下：
1、無菌外植體的獲取
選取1～2年生帶芽體的健壯根系埋于育苗基質中，待新芽萌發出來后切割成1～2cm長的頂芽或帶腋芽的莖段，剪去葉片留3～5mm葉柄，用75％酒精擦拭外植體表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下沖洗0.5～1h；在超凈工作臺上，用0.05～0.1％的升汞處理10～15min，用無菌水沖洗5～6次，接種至誘導培養基中(MS+0.01～0.1mg/L 6-BA+30g/L糖+5～7g/L卡拉膠)，每瓶接種一株，獲得的無菌外植體的成功率為80％。
2、速生無刺槐繼代增殖步驟：
(1)試驗材料
選取步驟1中誘導出來的芽直接進行增殖培養，所選材料生長健壯、葉片舒展，利用頂芽、莖段及芽團進行繁殖，其中頂芽高0.8～1.2cm左右、莖段高0.5～1cm左右含至少一個腋芽、芽團高0.5～1cm至少含兩個小芽。
(2)速生無刺槐繼代培養的實驗方案設計
速生無刺槐繼代培養的基本培養基為改良DKW培養基，其中添加蔗糖30g/L，卡拉膠5～7g/L，土豆20～30g/L，pH為5.8～6.0。選用6-BA(6-芐基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)等植物生長調節劑。每個處理接種50瓶，每瓶接種6株，實驗重復三次，培養30天統計增殖比例及生長情況，從而比較不同培養基對不定芽增殖的影響，進一步篩選出最佳繼代增殖培養基。
改良DKW培養基主要針對培養基的大量元素進行改良，其它DKW添加物保持不變，改良表如表1：
表1
速生無刺槐繼代培養細胞分裂素6-BA的篩選如表2：
表2
由上述表2結果顯示，速生無刺槐繼代培養所用細胞分裂素的最佳濃度為0.3～0.8mg/L。在此基礎上進行速生無刺槐生長素種類的篩選，各處理結果如表3：
表3
由上述表3結果可知，使用6-BA與三種生長素組合培養的速生無刺槐基部愈傷組織大且蓬松；6-BA與IBA的組合培養的速生無刺槐易出現玻璃化現象；6-BA與IAA組合培養的速生無刺槐雖然叢芽多，但是植株不長高，不利于后期生根。綜合分析適合速生無刺槐繼代培養的生長素為NAA，在此基礎上進一步篩選速生無刺槐的激素水平，各處理結果如表4：
表4
由上述表4結果可知，速生無刺槐繼代培養最佳配方為：改良DKW+0.1mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L土豆+30g/L蔗糖+5～7g/L卡拉膠，采用該配方繼代培養的速生無刺槐的最大增殖比例為4.1，且植株長高明顯，能用于生根培養的單株苗多。
3、速生無刺槐生根培養步驟
(1)選取繼代培養的速生無刺槐組培苗，選取標準為高度1.5～3cm、健壯、葉片舒展的單株組培苗；
(2)將選取的繼代培養的速生無刺槐組培苗接種至1/2MS生根培養基上。
1/2MS生根培養基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O8.45mg/L、ZnSO4·7H2O 4.25mg/L、NaMoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、鹽酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、5～7g/L卡拉膠。
(3)接種30天后統計生根率，生根率＝生根株數/接種株數×100％。
生根培養基激素篩選如表5：
表5
由上述表5結果可知，IBA與NAA單獨使用時不利于速生無刺槐組培苗的生根培養，而IBA與NAA配合使用時其生根率明顯提高，但是有落葉現象，添加適量6-BA后能解決落葉問題。篩選出的最適生根配方為：1/2MS+0.01mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IBA+20g/L土豆+20g/L蔗糖+5～7g/L卡拉膠。該配方培養的速生無刺槐組培苗生根率最高可達95％,且根系數量多、根系粗壯，在煉苗移栽過程中提高了速生無刺槐組培苗的成活率，本發明不僅解決了速生無刺槐組培苗生根率低的問題，而且大大降低了生產成本，加快了速生無刺槐的工廠化生產及推廣。
4、速生無刺槐繼代培養及生根培養條件
速生無刺槐組培苗繼代及生根培養的條件為：光培養與暗培養交替進行，光培養條件為連續進行12h光照，光照強度為3000lx，培養溫度為25℃；暗培養條件為連續進行12h，溫度為20℃。
5、速生無刺槐組培苗的煉苗與移栽
(1)生根培養30～45天的生根苗可進溫室煉苗移栽，選取葉色正常、無枯葉黃葉的健壯植株進行移栽；
(2)將速生無刺槐生根苗根系上的培養基洗凈，種植在含珍珠巖、草炭、河沙等基質的營養杯或穴盤中，濕度控制在75～80％，待新根與新葉發出后逐漸降低濕度，培養45～60天，即可得速生無刺槐容器苗。其大棚煉苗成活率為90％以上。
(3)上述所說基質配方包括上下兩層，其中上層1/3容量體積為蛭石：珍珠巖＝1:1；下層2/3容量體積為園土：草炭：河沙：珍珠巖＝2:1:1:1。該基質配方的特點是上層基質疏松透氣、保水保濕，利于煉苗前期新根及新葉的發出；下層基質營養豐富，利于后期組培苗營養生長，且根系與基質易于成團、便于容器苗運輸。
三對比分析
目前，國內幾乎沒有關于速生無刺槐組培苗繁殖方式的報道，一般采用的是扦插繁殖。僅中國農業大學有一篇關于《無刺桅桿槐和無刺槐再生體系的研究》的報道，該文章主要從葉片再生角度進行無刺槐的研究，再生繁殖的主要目的是為了通過建立再生體系進行基因工程育種，文章中無刺桅桿槐和無刺槐的再生率人別為60％、50％，生根率分別為55.6％、72.2％，組培苗移栽成活率為85％。本專利主要目的是通過繼代增殖培養實現速生無刺槐的大規模生產，采用該方法繁殖的速生無刺槐具有如下優點：(1)增殖系數高，平均增殖系數達到4以上；(2)生根率高，最高可達95％；(2)煉苗成活率高，平均為90％以上。與扦插繁殖相比，速生無刺槐組織培養繁殖的方式，生產上不受季節的限制，繁殖系數大；與再生培養相比，后代不易發生變異，操作方便，能實現大規模的工廠化生產，利于速生無刺槐的繁育及推廣。
以上對本發明的具體實施方式進行了說明，但本發明并不以此為限，只要不脫離本發明的宗旨，本發明還可以有各種變化。