本發明涉及石蒜花提取物的制備方法，具體地指一種石蒜花提取物的制備方法及在制備治療或預防油茶病害藥物中的用途。

背景技術：

油茶(Camellia oleifera)是我國特有的一種高級油料作物，與油棕、橄欖和椰子并稱世界四大木本油料樹種，請見(莊瑞林.中國油茶[M].北京：中國林業出版社，2008.)。油茶的綜合價值很高，茶籽通過壓榨后取得的茶油是深受群眾喜愛的優質食用油，其不飽和脂肪酸含量90％以上；茶油還能通過深加工生產高級保健食用油、醫藥和天然化妝品用油等；茶油在工業上可制取油酸及其酯類，以此為原料生產肥皂和凡士林等，還可經極度氫化后水解制硬脂酸和甘油等工業原材料；另外，茶油還可作為醫藥原料制作注射用的針劑和調制各種藥膏、藥丸等，請見(劉躍進，歐日明，陳永忠.我國油茶產業發展現狀與對策[J].林業科技開發，2007，21(4):1-4.)。因此，油茶的經濟價值非常高，被廣泛應用于食品、醫藥保健品及生物化工領域，有著廣闊的國內外市場需求。

然而，油茶病害種類繁多，油茶炭疽病、葉枯病、軟腐病、根腐病、茶餅病、黑斑病等在我國各油茶產區普遍發生，主要引起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干潰瘍、甚至整株死亡，每年油茶產業因病害造成了巨大的經濟損失，請見(束慶龍，張良富.中國油茶栽培與病蟲害防治[M].北京：中國林業出版社，2009.)。近年來，湖北油茶種植規模不斷擴大，相應的病害逐步引起高度重視。

目前對油茶主要病害的防治普遍通過種植抗性品種和化學防治來控制，過多使用化學殺菌劑有危害人類身體健康、藥物殘留破壞生態環境、引發病原物產生抗藥性、影響茶油質量和食用安全等諸多缺點，不利于油茶產業可持續發展。因此，當前防治油茶病害的首要任務是尋求安全、高效和經濟的生物源農藥。

國內外已有植物提取物抑制植物病害的相關報道，如張啟東等采用30種藥用植物提取物展開殺蟲殺菌活性研究，結果表明卡瓦胡椒和厚樸的乙醇提取物對玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌、小麥根腐病菌和油菜菌核病菌具有較高的殺菌活性，請見(張啟東，黃路枝，胡兆農，等.30種藥用植物提取物殺蟲殺菌活性研究[J].西北植物學報，2006(06)：1223-1230.)；汪曉娟等研究了百部堿等5種植物提取物對水霉菌的抑制作用，結果表明苦楝提取物對水霉菌抑制作用最為明顯，請見(汪曉娟，胡青，林崗.百部堿等5種植物提取物對水霉菌的抑制作用[J].安徽農學通報(上半月刊)，2012(23)：38-42.)；周建宏等采用生長速率法初步篩選了20種植物的水提取物對油茶軟腐病菌、炭疽病菌的生物活性，不同植物提取物的林間防治效果表明：當丁香、黃芩提取物及茶皂素的質量比為1:1:1時，對油茶主要病害的防治效果最好，可達80％，同時可以將油茶的病果率降低約60％，請見(周建宏，劉君昂，鄧小軍，等.植物提取物對油茶主要病害的抑菌作用[J].中南林業科技大學學報，2011(04)：42-45.)。周德明等研究了12種植物對油茶炭疽病菌和軟腐病菌的抑制活性，結果表明博落回的乙醇粗提物對油茶炭疽病、油茶軟腐病的抑制作用最強，其室內離體抑菌率分別達80.87％和61.1％，請見(周德明，艾芹，周國英.12種植物對油茶炭疽病菌和軟腐病菌的抑制活性[J].江蘇農業科學，2015(06)：121-123.)。后面2則研究主要針對油茶軟腐病菌和炭疽病菌，其防治范圍還有進一步擴大的空間，對油茶病害的防治效果也可進一步提高。

石蒜(Lycoris radiate)是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜屬(Lycoris Herb.)草本植物，別名紅花石蒜、龍爪花等，請見(李明凱，張玉瓊，董召榮，等.高效液相色譜法測定石蒜中加蘭他敏、力可拉敏及石蒜堿3種生物堿[J].分析測試學報，2012，31(8)：957-961.)。石蒜是東亞常見的園林觀賞植物，冬賞其葉，秋賞其花；是優良宿根草本花卉，園林中常用作背陰處綠化或林下地被花卉，花鏡叢植或山石間自然式栽植，現人工種植越來越多。花期過后，花瓣枯萎凋謝，不被人們利用。

技術實現要素：

本發明的目的提供了一種石蒜花提取物的制備方法，該方法利用凋謝后的石蒜花瓣制得石蒜花提取物，該方法生產簡單，方便易行，適合規模化生產和實際應用。制備石蒜花提取物的原料來自于凋謝的石蒜花瓣，生產成本極低，變廢為寶。

本發明的第二個目的是提供了石蒜花提取物在制備治療或預防油茶主要病害藥物中的應用，該石蒜花提取物作為防治油茶主要病害的生物源殺菌劑，其高效防治油茶炭疽病、葉斑病、黑斑病和潰瘍病，提取物抑菌率實驗表明，該石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率達到90％以上。

為實現上述目的，本發明提供的一種石蒜花提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)采集已經枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，清洗干凈后晾干，

2)將清洗晾干后的花瓣樣品勻漿粉碎，

3)將花瓣與提取溶劑按質量體積比1:10～30g/L混合，，浸提24～72h，過濾花瓣雜質后即可得到石蒜花提取物，其中，提取溶劑為質量分數為60～90％的乙醇溶液。

進一步地，所述步驟3)中，乙醇溶液的質量分數為70～85％。

再進一步地，所述花瓣與乙醇質量體積比1:15～25g/L。

本發明還提供了一種上述制備得到石蒜花提取物在制備治療或預防油茶病害藥物中的應用，所述油茶病害為油茶炭疽病、油茶葉斑病、油茶軟腐病、油茶黑斑病或油茶潰瘍病。其應用基本過程是：

A、采用濾紙片平板對峙培養法研究石蒜花提取物對油茶主要病害的拮抗作用。準備好直徑為7mm的濾紙片并滅菌處理，并在石蒜花提取物中浸潤2min；將打好的直徑為7mm的病原菌餅和浸潤后的濾紙片放置在平板中心線上，病原菌餅置于平板中央，浸潤有石蒜花提取物的濾紙片分別距離平板中心1.5cm，置于28℃恒溫培養箱培養，并每隔24h在超凈工作臺中無菌吸取5μL石蒜花提取物浸潤1個濾紙片，5～7天后觀察抑菌帶有無及大小，每個處理重復3次。

抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

B、采用培養法研究石蒜花提取物對油茶主要病害的拮抗作用。將石蒜花提取物與約50℃的PDA固體培養基按照1:19混勻后倒入培養皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7mm的油茶主要病原菌菌餅，以無菌水為對照，每個處理重復3次。5天后測量病原菌菌落直徑。

抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

本發明的有益效果在于：

1)本發明首次發現了石蒜花提取物對油茶主要病害(如油茶炭疽病、油茶膠孢炭疽病、油茶葉斑病、油茶軟腐病、油茶黑斑病、油茶潰瘍病等)均具有較強的抑制和滅殺活性。抗菌譜廣泛，可有效降低防治成本。

2)石蒜花花期過后，花瓣枯萎凋謝，不被人們利用。本發明則利用凋謝后的石蒜花瓣制得一種石蒜花提取物，原料成本極低，變廢為寶。

3)本發明的石蒜花提取物制備方法簡單，效果明顯，彌補了一般化學藥劑和生物農藥防效不顯著的缺陷，更易在實際生產中得到應用。

4)本發明制備的石蒜花提取物殺菌活性成分多樣，可緩解油茶病害致病菌的耐藥性產生，且植物活性成分易代謝，在土壤中無殘留，因此，該生物藥劑產品能長期在某個地區使用，施用后對人畜無毒害，環境友好。

5)本發明利用培養法實驗抑菌率表明：該石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率達到90％以上。

附圖說明

圖1為時間對石蒜花提取物對油茶膠孢炭疽病拮抗效果的影響示意圖。

圖2為溫度對石蒜花提取物對油茶膠孢炭疽病拮抗效果的影響示意圖。

圖3為石蒜花提取物對油茶黑斑病原菌的拮抗效果示意圖。

具體實施方式

為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。

本發明所用的試劑或原料，均購自商業渠道。

菌株來源：油茶炭疽病Colletotrichum nicotianae同文獻中報道菌株(李東升，張一揚.煙草炭疽病的形態特征和致病性研究[J].湖南農業科學，2009(5)：97-98.)；油茶膠胞炭疽病Colletotrichum.gloeosporioides，同文獻中報道菌株(孟慶敏，周國英，劉君昂，等.油茶炭疽病拮抗細菌Y13主要抑菌物質分離純化及作用方式[J].植物保護，2014，40(2)：36-42.)；油茶葉斑病Phyllosticta capitalensis，同文獻中報道菌株(馬成,彭麗娟,吳石平.銀杏葉點霉葉斑病病原菌鑒定[J].貴州農業科學,2014,42(12):126-128.)；油茶軟腐病Agaricodochium camellia，同文獻中報道菌株(趙丹陽,秦長生,廖仿炎.5種殺菌劑對油茶軟腐病的防治研究[J].廣東林業科技,2013,29(2):28-31.)；油茶黑斑病Altermaria alternate同文獻中報道菌株(Kobiler I,Akerman M,Huberman L,et al.采前與采后處理結合控制柿子貯藏過程中鏈格孢菌(Alternaria alternata)引起的黑斑病的研究[J].保鮮與加工,2011,5:025.)，油茶潰瘍病Bothyosphaeria dothidea，同文獻中報道菌株(Slippers B,Crous P W,Denman S,et al.Combined multiple gene genealogies and phenotypic characters differentiate several species previously identified as Botryosphaeria dothidea[J].Mycologia,2004,96(1):83-101.)。

實施例1

石蒜花提取物1的制備方法，其步驟是：

1)采集已經枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，自來水清洗干凈后晾干，

2)利用勻漿機將清洗晾干后的花瓣樣品勻漿粉碎，按照質量體積比1：10g/L將花瓣和質量分數為90％的乙醇溶液混合，浸提24h，過濾花瓣雜質后即得到石蒜花提取物1，4℃短期保藏。

實施例2

石蒜花提取物2的制備方法，其步驟是：

1)采集已經枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，自來水清洗干凈后晾干，

2)利用勻漿機將清洗晾干后的花瓣樣品粉碎，按照質量體積比1：20g/L將花瓣和質量分數為60％的乙醇溶液混合，浸提72h，過濾花瓣雜質后即得到石蒜花提取物2，4℃短期保藏。

實施例3

石蒜花提取物3的制備方法，其步驟是：

1)采集已經枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，自來水清洗干凈后晾干，

2)利用勻漿機將清洗晾干后的花瓣樣品粉碎，按照質量體積比1：15g/L將花瓣和質量分數為80％的乙醇溶液混合，浸提48h，過濾花瓣雜質后即得到石蒜花提取物3，4℃短期保藏。

實施例4

一種石蒜花提取物在制備治療或預防六種油茶病原菌藥物中的應用，其步驟是：

A.蒜花提取物與多種油茶病原菌體外互作：采用平板對峙培養法：準備好直徑為7mm的濾紙片并滅菌處理，并在石蒜花提取物中浸潤2min；將打好的直徑為7mm的病原菌餅和浸潤后的濾紙片放置在平板中心線上，病原菌餅置于平板中央，浸潤有石蒜花提取物的濾紙片分別距離平板中心1.5cm，置于28℃恒溫培養箱培養，并每隔24h在超凈工作臺中無菌吸取5μL石蒜花提取物浸潤1個濾紙片，5-7天后觀察抑菌帶有無及大小，每個處理重復3次。結果見表1。

結果表明石蒜花提取物對油茶炭疽病、膠孢炭疽病、葉斑病、軟腐病、黑斑病和潰瘍病均有很好的拮抗作用，抑菌率均達到90％以上。

表1石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率

表中數據為平均值±標準差(下同)，

抑菌率＝(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

B、采用培養法。將石蒜花提取物與約50℃的PDA固體培養基按照1:19混勻后倒入培養皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7mm的油茶主要病原菌菌餅，以無菌水為對照，每個處理重復3次。5天后測量病原菌菌落直徑。

抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

表2同樣顯示石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率均達到90％以上，尤其是對黑斑病的抑菌率達到99.6％，如圖3所示，系列結果表明石蒜花提取物抗菌譜廣，抑菌效果顯著。A中培養基未添加石蒜花提取物，病原菌生長快速，菌落直徑達到62.8±0.8mm，而B中培養基添加石蒜花提取物后，幾乎完全抑制了病原菌的生長，抑菌效果顯著。

表2石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率

實施例3

石蒜花提取物在制備治療或預防馬鈴薯干腐病和睡蓮黑斑病病原菌藥物中的應用，采用培養法步驟是：

將石蒜花提取物與約50℃的PDA固體培養基按照1:19混勻后倒入培養皿，冷卻后在平板中央分別放入直徑為7mm的馬鈴薯干腐病和睡蓮黑斑病菌餅，以無菌水為對照，每個處理重復3次。5天后測量病原菌菌落直徑。抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。表3顯示石蒜花提取物對馬鈴薯干腐病和睡蓮黑斑病原菌的抑菌率超過50％，該提取物的抑菌譜較廣。

表3石蒜花提取物對瑪咖根腐病和睡蓮黑斑病病原菌的抑菌率

實施例4

石蒜花提取物抗菌物質穩定性測試

時間穩定性測試：按照提取方法制備好石蒜花提取液，分別在4℃下放置0d、10d、20d、30d、40d、50d、60d測試其對油茶膠胞炭疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的抑制作用。每個處理重復3次。對油茶炭膠胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的拮抗效果如圖1所示。結果顯示該提取物對油茶膠孢炭疽病拮抗效果隨時間的增加而減弱，且在40天范圍內略微降低，第60天后，抑菌活性降低幅度變大，說明該提取物中有效成分能保留較長時間，但最好在該提取物活性較強的期限40天內使用。

溫度穩定性測試：按照提取方法制備好石蒜花提取液，各取5mL轉入無菌試管中，分別在溫度為20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下處理2h，測試其對油茶炭膠胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的抑制作用。每個處理重復3次。對油茶炭膠胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的拮抗效果如圖2所示。結果表明該石蒜花提取物在40℃時拮抗效果最佳，且在當溫度高于80℃時，抑菌活性逐漸降低，說明該提取物中有效成分部分耐高溫能力較強，部分有效成分不能耐高溫。

其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經創造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發明保護范圍。