本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產品中的應用。

背景技術：

隨著生活水平的逐漸提高，人們的衛生防病意識也在不斷的加強。真菌是細菌的一種，能引起動植物和人的各種疾病。不同真菌可以通過不同的方式致病，可以分為以下幾種：(1)致病性真菌感染：由外源性真菌引起，如皮膚癬病菌；(2)條件致病性真菌感染：由內源性真菌引起，如白色念珠菌等；(3)真菌超敏反應性疾病：吸入或食入菌絲或孢子引起蕁麻疹、哮喘等；(4)真菌性中毒癥：食用含真菌毒素的霉變糧食所致；(5)真菌毒素：與腫瘤發生有關。

人類感染的真菌主要來自外界環境，并通過接觸、吸入或食入而感染。少數致病真菌可直接致病，但多數真菌需要在一定條件下才能致病，后者稱為條件致病菌。其中，皮膚癬菌中的紅色毛癬菌通過接觸傳染，感染指(趾)甲形成足癬，還可以感染而引起頭癬、體癬、股癬、手癬等。而足癬，俗稱腳氣，具有傳染性，其難以治愈、容易交叉傳染，不及時治療，久而久之會引發灰指甲的形成，同時抓撓后極易引發身體其他部位的真菌感染，嚴重影響人們的生活質量。用于臨床的抗真菌藥皆因不能滲透角質而對治療灰指(趾)甲無效。從前的主要治療方法為手術拔除指(趾)甲，多人畏其疼痛而為難，成為許多人特別是年輕人心頭之煩惱。目前，用于治療灰指甲的方法有口服藥和外用藥兩大類。口服藥主要是抗真菌藥物類，如斯皮仁諾(別名：伊曲康唑、依康唑、伊康唑、依他康唑)，但口服藥往往會給人體帶來較大的傷害；久而久之，容易引起指(趾)甲對紅色毛癬菌的耐藥性等很多副作用，且安全性也不斷受到質疑。外用藥物，如硝酸咪康唑、復方苯甲酸軟膏等西藥類，通過涂抹患處，殺滅真菌治療，但是此類藥物往往具有很大的刺激性，使用時還可能會帶來灼燒感和刺痛感，嚴重時難以忍受，且復發率較高。

同樣，白色念珠菌為條件致病性真菌，常寄生于人的皮膚、口腔、陰道和腸道粘膜處。隨著免疫功能低下或免疫缺陷的病人日益增多，其感染率不斷增加。其可侵犯人體許多部位，如皮膚皺褶處(腑窩、腹股溝，乳房下，肛門周圍及甲溝，指間)，引起皮膚潮紅、潮濕、發亮，有時病變周圍有小水泡等癥狀，同時還會引起鵝口瘡、口角炎、陰道炎、淺表潰瘍、肺炎、腸胃炎、心內膜炎、腦膜炎、腦炎等，偶爾也可發生敗血癥。近年來，由于廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑等藥物的大量應用，介入手術的普及，惡性腫瘤、艾滋病等疾病發病率逐年上升等因素，使得念珠菌感染發病率逐年升高。目前，唑類藥物是臨床治療和預防白色念珠菌感染的首選藥物，唑類藥物的大量應用，在治療白色念珠菌感染的同時又使白色念珠菌的耐藥性提高。

因此，開發研究一種新型、高效、天然的抗真菌感染產品是目前所急需的，也是現代醫學研究的熱點。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產品中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產品中的應用。

進一步，所述真菌為紅色毛癬菌或白色念珠菌。

進一步，所述桑枝提取物的制備方法為：

(1)取桑枝烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇或甲醇中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；

或將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入石油醚中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅱ；將經石油醚提取后的桑枝粉末加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅲ；將經乙酸乙酯、氯仿或丙酮提取后的桑枝粉末加入正丁醇中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅳ；將經正丁醇提取后的桑枝粉末加入水中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅴ。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與無水乙醇或甲醇的質量體積比為1mg：20ml。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與石油醚的質量體積比為1mg：20ml；所述經石油醚提取后的桑枝粉末與乙酸乙酯、氯仿或丙酮的質量體積比為1mg：20ml；所述經乙酸乙酯、氯仿或丙酮提取后的桑枝粉末與正丁醇的質量體積比為1mg：20ml；所述經正丁醇提取后的桑枝粉末與水的質量體積比為1mg：20ml。

進一步，步驟(2)中，所述提取具體為在350w下微波提取三次，每次30min。

進一步，所述桑枝萃取物的制備方法為：

(1)取桑枝烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇或甲醇中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；將所述桑枝提取物ⅰ溶于水中，獲得桑枝提取物ⅰ水溶液，將所述桑枝提取物ⅰ水溶液加入石油醚中，經萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅰ；將經石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，經萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅱ；將經乙酸乙酯、氯仿或丙酮萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入正丁醇中，經萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅲ；將經正丁醇萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅳ。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與無水乙醇或甲醇的質量體積比為1mg：20ml。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝提取物ⅰ水溶液與石油醚的體積比為1：1；所述經石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液與乙酸乙酯、氯仿或丙酮的體積比為1：1；所述經乙酸乙酯、氯仿或丙酮萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液與正丁醇的體積比為1：1。

進一步，步驟(2)中，所述提取具體為在350w下微波提取三次，每次30min。

本發明的有益效果在于：本發明公開了桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產品中的應用，桑枝提取物或萃取物成分天然、安全性好，對紅色毛癬菌和白色念珠菌均具有良好的抗菌能力，能很好用于新型、高效、天然的抗真菌感染藥物的研發。其中，桑枝的乙酸乙酯萃取液對紅色毛癬菌和白色念珠菌的抗菌能力最好，對兩種菌的最小抑菌濃度分別為1mg/ml、0.5mg/ml。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為實施例2中不同濃度的樣液1-5對紅色毛癬菌的抑菌率圖。

具體實施方式

下面將對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件按照制造廠商所建議的條件。

本發明實施例中使用的材料及主要試劑如下：rpm-1640培養基(含l-谷酰胺，不含碳酸氫鈉，含ph指示劑)，購于上海士豐生物科技有限公司；二甲基亞砜(dmso)、mtt，購于上海生工生物工程有限公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純，購于重慶川東化工集團有限公司；

桑枝(湖桑32號)，采自重慶市蠶業科學技術研究院桑樹資源圃；

紅色毛癬菌，編號為atcc28188，購買于上海士豐生物科技有限公司；

白色念珠菌，編號為cmcc(f)98001，購買于中國獸藥所。

實施例1

桑枝提取物和萃取物的制備

1、桑枝提取物的制備

(1)取無病蟲害桑枝，烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，將提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；所述桑枝粉末與無水乙醇的質量體積比為1mg：20ml，將制得的桑枝提取物ⅰ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液1，存于-20℃冰箱備用。

2、桑枝萃取物的制備

(1)取無病蟲害桑枝，烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，將提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ，所述桑枝粉末與無水乙醇的質量體積比為1mg：20ml；將所述桑枝提取物ⅰ溶于水中，獲得桑枝提取物ⅰ水溶液，按體積比1：1將所述桑枝提取物ⅰ水溶液加入石油醚中，經萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅰ，將制得的桑枝萃取物ⅰ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液2，存于-20℃冰箱備用；按體積比1：1將經石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入乙酸乙酯中，經萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅱ，將制得的桑枝萃取物ⅱ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液3，存于-20℃冰箱備用；按體積比1：1將經乙酸乙酯萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入正丁醇中，經萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅲ，將制得的桑枝萃取物ⅲ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液4，存于-20℃冰箱備用；將經正丁醇萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅳ，將制得的桑枝萃取物ⅳ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液5，存于-20℃冰箱備用。

實施例2

桑枝提取物和萃取物對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度(mic)檢測

用二倍稀釋法將實施例1中樣液1-5用rpm-1640培養基分別稀釋為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml八個濃度。取96孔細菌培養板，每孔加入100μl濃度為10⁶cfu/ml的紅色毛癬菌菌液及100μl各濃度的樣液，并設置空白對照(不含樣液的培養基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)，同時設置對照培養板(不加菌液)。28℃恒溫培養箱中培養93h，通過肉眼觀察，得出各樣液最小抑菌濃度，結果見表1。然后將96孔培養板取出，每孔加入20μl5.0mg/ml的mtt試劑，28℃恒溫孵育3-4h后，取出96孔培養板，2500r/min離心5min，每孔吸出100μl上清液棄去，再加入100μl二甲亞砜，震蕩30min后再次離心，將上清液轉移至新96孔板中，酶標儀530nm下檢測吸光值，根據實驗數據通過公式：抑制率(％)＝(1-測定孔od530nm值/空白對照孔od530nm值)×100計算其抑菌率，結果見表2，并繪制成圖，如圖1所示，由表2和圖1可知：各樣液對紅色毛癬菌的抑制效果均為濃度依賴型，桑枝提取物及其各萃取物對紅色毛癬菌具有一定的抑菌作用。其中，樣液3在濃度為1mg/ml時，能夠完全抑制紅色毛癬菌的生長，則其最小抑菌濃度(mic)為1mg/ml；其次是樣液1和樣液2，當濃度為1mg/ml時，其抑制率為83.10％和84.31％；樣液4和樣液5活性相對較差，但在濃度為1mg/ml時，也具有一定的抑制活性，其抑制率分別為50.98％和44.44％。

表1樣液1-5作用于紅色毛癬菌的最小抑菌濃度

注：樣液1為桑枝的無水乙醇提取液，樣液2為桑枝的石油醚萃取液，樣液3為桑枝的乙酸乙酯萃取液，樣液4為桑枝的正丁醇萃取液，樣液5為桑枝的水萃取液。

由表1可知，樣液1-5對紅色毛癬菌均具有抑菌作用，其中，樣液3對紅色毛癬菌的抑制活性最好，即桑枝的乙酸乙酯萃取物對紅色毛癬菌的抑制活性最好，最小抑菌濃度為1.00mg/ml，樣液1、樣液2、樣液4和樣液5對對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度均大于1.00mg/ml。

表2不同濃度的樣液1-5對紅色毛癬菌的抑菌率

注：肩字母相同表示差異不顯著，肩字母不同表示差異顯著(p<0.01)，樣液1為桑枝的無水乙醇提取液，樣液2為桑枝的石油醚萃取液，樣液3為桑枝的乙酸乙酯萃取液，樣液4為桑枝的正丁醇萃取液，樣液5為桑枝的水萃取液。

實施例3

桑枝提取物和萃取物對白色念珠菌的最小抑菌濃度(mic)檢測

用二倍稀釋法將實施例1中樣液1-5用rpm-1640培養基分別稀釋為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml八個濃度。取96孔細菌培養板，每孔加入100μl濃度為10⁶cfu/ml的白色念珠菌菌液及100μl各濃度的樣液，并設置空白對照(不含樣液的培養基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)，同時設置對照培養板(不加菌液)。28℃恒溫培養箱中培養48h。經測試發現樣液3對白色念珠菌的抑菌作用最好，即桑枝的乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌的抑菌作用最好，其最小抑菌濃度為0.5mg/ml。

實施例4

桑枝提取物和萃取物對白色念珠菌的最小殺菌濃度檢測

在實施例3中最小抑菌濃度的基礎上，按照mic的試驗方法，將樣液3配置為2倍mic、4倍mic、8倍mic、16倍mic，取96孔細菌培養板，每孔加入100μl濃度為10⁶cfu/ml的白色念珠菌菌液，再加入100μl相應濃度的各樣液，并設置空白對照(不含樣液的培養基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)。28℃培養箱中培養48h，然后每孔取20μl菌液接種在新鮮的營養瓊脂培養基上，過夜培養，無活菌生長的最小濃度即為最小殺菌濃度，經測試發現樣液3，即桑枝的乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌的最小殺菌濃度>1mg/ml。

本發明中，除了用無水乙醇制備桑枝提取物，還可用甲醇；除了用乙酸乙酯制備桑枝萃取物，還可用氯仿或丙酮。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。