本發(fā)明屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞保存液及該保存液的制備方法和使用方法。

背景技術(shù)：

基因的提取是分子生物學(xué)檢驗(yàn)工作中最基本的應(yīng)用技術(shù)，臨床上常用的方法有碘化鈉法、酚-氯仿法、Chelex-100法和試劑盒法等。上述這些方法大多使用人全血作為基因提取的標(biāo)本，采樣過(guò)程存在一定困難，如采血過(guò)程中的安全隱患、血液樣本易遭污染、患者拒絕率較高等問(wèn)題，同時(shí)采取血樣的成本高、操作較為繁瑣，需要具有專業(yè)技能的人員進(jìn)行操作才可靠。因此，探索更為取材簡(jiǎn)便、操作便捷，同時(shí)易于被患者接收的基因采集方法具有非常重要的意義。口腔黏膜上皮細(xì)胞的采集十分簡(jiǎn)便快捷，不僅方便易得，而且基本上無(wú)創(chuàng)，患者自行操作即可完成。現(xiàn)有技術(shù)中，許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中人體細(xì)胞提取的過(guò)程已適用提取口腔細(xì)胞進(jìn)行分析，研究表明，口腔上皮細(xì)胞中提取到的DNA數(shù)量與質(zhì)量比較理想，可作為人體細(xì)胞分析的樣本進(jìn)行使用。現(xiàn)有技術(shù)中口腔細(xì)胞提取的過(guò)程為：醫(yī)護(hù)人員利用專業(yè)的口腔拭子在患者頰粘膜兩側(cè)輕刮數(shù)次，然后將拭子頭置入細(xì)胞保存液中，讓拭子頭上留存的患者細(xì)胞落入細(xì)胞保存液中，然后將含有患者細(xì)胞的細(xì)胞保存液密封，最后送到各分析中心。

對(duì)于如上述非血液途徑獲取的細(xì)胞，如何維持細(xì)胞活性是一項(xiàng)極大的挑戰(zhàn)，在短時(shí)間內(nèi)保存細(xì)胞并在臨床上應(yīng)用時(shí)，往往使用生理鹽水來(lái)維持細(xì)胞活性，然而細(xì)胞在生理鹽水中活性降低的速度非常快，10小時(shí)之內(nèi)細(xì)胞的活性喪失率可達(dá)30%甚至更高，然而許多對(duì)細(xì)胞的觀察測(cè)試從取樣到應(yīng)用可能需要超過(guò)10小時(shí)、24小時(shí)，甚至多達(dá)數(shù)天，生理鹽水無(wú)法滿足需求。為了解決這一問(wèn)題，各類細(xì)胞固定液應(yīng)運(yùn)而生。細(xì)胞保存液是一種能夠幫助細(xì)胞保持原有形態(tài)、結(jié)構(gòu)的一種化學(xué)藥品，其功能是迅速防止細(xì)胞死亡后的變化，防止其自溶、腐敗，盡量保持生長(zhǎng)狀態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持其生前的形態(tài)，進(jìn)一步地，好的細(xì)胞保存液還可使細(xì)胞更便于觀察和鑒定。目前市場(chǎng)上有許多不同種類的細(xì)胞保存液，不同的廠商擁有自己的保存液配方，許多細(xì)胞保存液被用于與測(cè)試儀器一同進(jìn)行銷售，價(jià)格昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

4%的多聚甲醛細(xì)胞保存液是使用較多的細(xì)胞保存液之一，具有對(duì)組織穿透性好、固定均勻的特性。但是，4%多聚甲醛細(xì)胞保存液則對(duì)細(xì)胞保存的時(shí)間非常敏感，超過(guò)12h以后其保存的細(xì)胞活性往往下降較快。針對(duì)4%多聚甲醛細(xì)胞保存液無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高效保存的問(wèn)題，本發(fā)明中提供了一種以4%多聚甲醛細(xì)胞保存液為基礎(chǔ)的新的細(xì)胞保存液，該保存液不僅大幅提升了對(duì)細(xì)胞保存的時(shí)間，而且制備方法簡(jiǎn)單、適用范圍廣泛。

本發(fā)明的技術(shù)效果通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明中提供的一種細(xì)胞保存液，為超純水配制的溶液，該溶液為多聚甲醛保存液，溶液中還包括如下濃度范圍的組分：

戊二醛 0.4-0.8wt%

枸櫞酸鉀 0.05-0.1mol/L

雙乙酸鈉 0.035-0.15mol/L

六水氯化鎂 0.1-0.3mol/L

氯化鈉 0.08-0.4mol/L

α-硫辛酸 0.003-0.005mol/L

海藻糖 0.08-0.12mol/L

苦參堿 3-5mg/L

上述多聚甲醛保存液的制備方法為：將多聚甲醛溶解于30-40℃氫氧化鈉水溶液中，用超純水定容制成8wt%的多聚甲醛溶液，然后攪拌滴入0.2-0.3%v/v的焦炭酸二乙酯，持續(xù)攪拌至溶液清亮，然后加入PB緩沖液至多聚甲醛質(zhì)量百分含量為4wt%；

所述細(xì)胞保存液的pH值為7.1-7.4，滲透壓為290-315mmol/L。

4wt%甲醇溶液對(duì)細(xì)胞固定效果好，所有的保存液利用超純水進(jìn)行配制可有效防止雜質(zhì)離子的進(jìn)入，在本發(fā)明中，所有配制過(guò)程中使用的超純水的生產(chǎn)時(shí)間不超過(guò)12小時(shí)，以免超純水變質(zhì)。在本發(fā)明的配方中，枸櫞酸鉀和雙乙酸鈉作為協(xié)同防腐抗凝劑進(jìn)行使用，六水氯化鎂和氯化鈉共同作為緩沖鹽。α-硫辛酸是一種抗氧化劑，在本發(fā)明的配方中，與其他添加元素協(xié)同使用能夠有效提升長(zhǎng)時(shí)間保存后的細(xì)胞的活性。苦參堿是來(lái)自于苦參、山豆根等中藥中的活性成分，是四環(huán)喹嗪啶類衍生物，屬于生物堿，現(xiàn)代藥理研究表明，苦參堿具有抗炎、抗病毒、阻斷細(xì)胞凋亡、穩(wěn)定細(xì)胞膜等作用。海藻糖作為天然糖類的一種，還能夠起到非滲透性低溫保護(hù)劑的作用，海藻糖還是一種非還原性雙糖，具有非常穩(wěn)定的理化作用，對(duì)細(xì)胞無(wú)任何毒副作用，能夠有效穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。將海藻糖和苦參堿這兩種來(lái)自于動(dòng)植物的活性成分加入細(xì)胞保存液中，可有效增強(qiáng)了保護(hù)作用。同時(shí)，為了消除添加的物質(zhì)對(duì)多聚甲醛對(duì)細(xì)胞固定能力的影響，添加少量戊二醛與之相匹配使用。

在多聚甲醛保存液的制備過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的制備方法中往往直接將多聚甲醛溶于PB緩沖液或者PBS緩沖液中，由于多聚甲醛難溶于水，所以溶解時(shí)間非常長(zhǎng)并需要輔助進(jìn)行加熱，往往需要在60℃甚至更高的溫度下溶解4小時(shí)以上。考慮到上述制備過(guò)程中耗時(shí)的問(wèn)題，本發(fā)明利用了多聚甲醛難難溶于水但是在堿溶液中溶解速度加快的特點(diǎn)，首先將多聚甲醛溶解于少量的氫氧化鈉水溶液中，為進(jìn)一步提升溶解速度，對(duì)堿液進(jìn)行加熱，只需略加熱至30-40℃即可。在溶解多聚甲醛的步驟中，使用的氫氧化鈉水溶液濃度為5-10wt%，溶解時(shí)使用的量不宜過(guò)多，能夠浸沒(méi)多聚甲醛使其快速溶解即可，以免影響保存液整體pH值。多聚甲醛溶解后用超純水定容，然后滴入焦炭酸二乙酯（DEPC），持續(xù)攪拌至溶液清亮，最后加入PB緩沖液即可。

本發(fā)明中使用PB緩沖液而非PBS緩沖液，其目的是避免引入過(guò)多離子，所述PB緩沖液為0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄以體積比1:1.5-4混合配制而成。

進(jìn)一步地，本發(fā)明中細(xì)胞保存液還包括0.1-0.2wt/L的氨基酸，所述氨基酸為甘氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸中的一種或多種。氨基酸能夠協(xié)同保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞，即延長(zhǎng)細(xì)胞保存時(shí)間。

為保證細(xì)胞保存液的純度，本發(fā)明細(xì)胞保存液中所用原料都為分析純。

本發(fā)明中還提供一種制備上述細(xì)胞保存液的方法，包括如下步驟：

步驟一：按照保存液配方稱取多聚甲醛保存液及其他原料；

步驟二：將其他原料倒入多聚甲醛保存液中，攪拌均勻，利用0.2mol/L的NaH₂PO₄和/或0.2mol/L的Na₂HPO₄將pH值調(diào)整至7.1-7.4；

步驟三：將步驟二中制備得到的溶液滅菌，即得到所需細(xì)胞保存液。

本發(fā)明還提供一種細(xì)胞的保存方法，即利用本發(fā)明中的細(xì)胞保存液密封靜置保存。進(jìn)一步地，該細(xì)胞保存方法尤其適用于對(duì)口腔細(xì)胞進(jìn)行保存，保存的細(xì)胞濃度為10⁵-10⁸個(gè)/ml。

本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：

1、本發(fā)明中提供了一種細(xì)胞保存時(shí)間長(zhǎng)、效果好的細(xì)胞保存液。

2、本發(fā)明中的細(xì)胞保存液制備方法簡(jiǎn)單、適用范圍廣泛，針對(duì)非血液途徑獲取的細(xì)胞，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)有效維持其活性，尤其適用于口腔細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步的描述。

1、多聚甲醛保存液的制備

將稱取的多聚甲醛溶解于38℃的5wt%氫氧化鈉水溶液中，然后用超純水定容制成8wt%的多聚甲醛溶液，然后攪拌滴入0.23%v/v的焦炭酸二乙酯，持續(xù)攪拌至溶液清亮，然后加入PB緩沖液至多聚甲醛質(zhì)量百分含量為4wt%。溶解時(shí)使用氫氧化鈉溶液的量不宜過(guò)多，能夠浸沒(méi)多聚甲醛使其快速溶解即可。利用本實(shí)施例中多聚甲醛的保存液的制備方法，比直接用PB緩沖液溶解的方法快2個(gè)小時(shí)。

本實(shí)施例中，使用的PB緩沖液為0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄以體積比1:3.6混合配制而成。

本實(shí)施例中配置過(guò)程使用的水全部為新制備的超純水化學(xué)試劑為正規(guī)試劑生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

2、實(shí)施例中細(xì)胞保存液的制備

多聚甲醛保存液中的添加組分及含量按照下表中的成分含量進(jìn)行配比：

細(xì)胞保存液的制備方法如下：

步驟一：按照保存液配方稱取多聚甲醛保存液及其他原料；

步驟二：將其他原料倒入多聚甲醛保存液中，攪拌均勻，利用0.2mol/L的NaH₂PO₄和/或0.2mol/L的Na₂HPO₄將pH值調(diào)整至7.1-7.4；

步驟三：將步驟二中制備得到的溶液滅菌，即得到所需細(xì)胞保存液。

上述實(shí)施例中細(xì)胞保存液的滲透壓均在290-315mmol/L范圍內(nèi)。

3、對(duì)比例細(xì)胞保存液的制備

4、測(cè)試及結(jié)果對(duì)照

將實(shí)施例及對(duì)比例中的細(xì)胞保存液應(yīng)用于口腔細(xì)胞的保存中。利用同樣的取樣拭子取人體口腔細(xì)胞，細(xì)胞濃度在3×10⁶-10⁷個(gè)/ml范圍內(nèi)，然后將取樣拭子靜置密封保存于細(xì)胞保存液中，將細(xì)胞保存液置于4℃環(huán)境中靜置密封保存。在保存24h、48h、72h、96h后分別取出細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察存活細(xì)胞的數(shù)量。

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，由本實(shí)施例中的細(xì)胞保存液保存細(xì)胞平超過(guò)4天以后，仍舊有非常高的細(xì)胞存活率，而且采用本實(shí)施例中提供的細(xì)胞保存液進(jìn)行保存的細(xì)胞平均活性下降率低。

最后需要說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案而非對(duì)其進(jìn)行限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而這些修改或者等同替換亦不能使修改后的技術(shù)方案脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。