本發明涉及通過在鮨科中屬于石斑魚亞科的褐石斑魚與鞍帶石斑魚兩種之間的雜交來生產的雜交種及其雜交種的生產方法，涉及雌性褐石斑魚(longtoothgrouper，epinephelusbruneus)與雄性鞍帶石斑魚(giantgrouper，epinepheluslanceolatus)之間的雜交種及雄性褐石斑魚與雌性鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法。本發明為包含如下步驟的方法：包括從雌性確保成熟卵，從雄性提取精液之后，進行兩者之間的人工受精，從而生產受精卵，并將受精卵育成孵化及種苗步驟。與褐石斑魚相比，褐石斑魚與鞍帶石斑魚兩種之間的雜交種具有生長非常快的優點。
背景技術：
：鮨科魚類(familyserranidae)為3亞科529種，其中，主要養殖對象種為石斑魚亞科(subfamilyepinephelinae)，是15屬159種，大部分在屬于亞熱帶性的印度-太平洋地區中棲息。鮨科魚類作為高價的養殖魚類受到矚目，養殖生產量急增，2011年生產94040噸，從而具有10年增加7.3倍的大的市場性。屬于本發明的對象種的褐石斑魚作為在水產養殖業具有高附加價值的魚種，在韓國濟州島用方言稱為“東洋鱸”，以高的價格銷售，并且作為鮨科魚類的最大市場的香港市場和中國本土中的需要量多。鞍帶石斑魚作為在亞熱帶性地區中棲息的超大型魚類，因快的生長率和高的價格，在臺灣作為養殖對象種受到矚目，還逐漸引入中國本土。雜交作為基因型和表現型不同的兩種之間的交配方法，是一種以作為在經濟上重要的形質的生長、抗病性、肉質、環境適應力增大等為對象生產新的物種的技術。尤其，種間雜交通過所需的形質的組合來獲取雜種優勢的概率高，因而正進行多種試圖(韓國公開專利第10-1999-0045938號、韓國授權專利第10-0844339號、韓國公開專利第10-2012-0083990號)。另一方面，還正活躍地進行將鮨科魚類作為對象的多種雜交品種的生產。代表性地，有暗點石斑魚(duskygrouper(烏鰭石斑魚(epinephelusmarginatus)))×白石斑魚(whitegrouper(e.aeneus))、地中海石斑魚(goldblotchgrouper(e.costae))×暗點石斑魚、棕點石斑魚(brown-marblegrouper(e.fuscoguttatus))×白星石斑魚(spottedgrouper(e.polyphekadion))、點帶石斑魚(orange-spottedgrouper(e.coioides))×棕點石斑魚、點帶石斑魚×鞍帶石斑魚及赤點石斑魚(red-spottedgrouper(e.akaara))×點帶石斑魚等。尤其，由雌性棕點石斑魚的成熟卵和鞍帶石斑魚的精液人工受精而成的雜交種因具有快的生長和抗病性而進行大量生產，且在香港市場中正式登錄而進行銷售。但是，至今，鮨科魚類的雜交只有亞熱帶性魚種之間的雜交種，未實現在韓國棲息的鮨科魚類與亞熱帶性鮨科魚類之間的雜交。與此同時，當開發通過市場性高的褐石斑魚與生長快且具有市場性的鞍帶石斑魚之間的雜交的新品種時，與在韓國的銷售一同，還可以在具有最大消費市場的中國進行銷售。現有技術文獻專利文獻專利文獻0001：韓國公開專利第10-1999-0045938號專利文獻0002：韓國授權專利第10-0844339號專利文獻0003：韓國公開專利第10-2012-0083990號技術實現要素：本發明的目的在于，為了獲取褐石斑魚與鞍帶石斑魚的市場性、生長率等的優良形質，開發通過雜交的新品種。并且，本發明的目的在于，提供生長速度快、可貢獻于養殖產業的活性化的褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交方法。為了實現如上所述的目的，本發明提供褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法，上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法包括：準備雌性褐石斑魚的成熟卵，并準備雄性鞍帶石斑魚的精液之后，進行兩者之間的人工受精，來生產受精卵的步驟；以及對上述受精卵進行孵化及飼育來生產仔魚的步驟。并且，本發明提供褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法，上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法包括：準備雌性鞍帶石斑魚的成熟卵，并準備雄性褐石斑魚的精液之后，進行兩者之間的人工受精，來生產受精卵的步驟；以及對上述受精卵進行孵化及飼育來生產仔魚的步驟。并且，本發明提供褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的確認方法，上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的確認方法包括：對生產的上述仔魚的脫氧核糖核酸(dna)進行提取的步驟；對提取的上述仔魚的脫氧核糖核酸和序列1的引物或序列2的引物進行混合，并利用聚合酶鏈式反應(pcr)進行擴增的步驟；以及通過電泳來確認通過上述擴增獲得的產物的步驟。在本發明的一實施例中，其特征在于，在通過上述電泳來確認的步驟中，在使用序列1的引物的情況下，若檢測到約320bp、330bp、400bp及450bp的條帶，則判定為雜交種。在本發明的一實施例中，其特征在于，在通過上述電泳來確認的步驟中，在使用序列2的引物的情況下，若檢測到約380bp及410bp的條帶，則判定為雜交種。并且，本發明提供利用上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法來制備而得的雜交種、受精卵及仔魚。本發明可通過市場性高的褐石斑魚與生長快且具有市場性的鞍帶石斑魚之間的雜交來提供生長速度快且具有優良形質的雜交種。本發明的雜交種中初期仔魚的生長非常快，因而可解決當養殖鮨科魚類時成為大問題的生物餌料的問題，從而可貢獻于韓國養殖產業的活性化。并且，本發明可對抗作為鮨科魚類種苗生產最發達國家的臺灣提高韓國養殖產業的國家競爭力，并通過進入鮨科魚類養殖市場可創造莫大的收入。附圖說明圖1為褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的按水溫的孵化率及初期生存率。圖2為褐石斑魚、鞍帶石斑魚及雜交種的形態特征。圖3為褐石斑魚及雜交種的生長率差異，趨勢線利用了指數趨勢線，并公開r2值。圖4為利用序列1的引物的聚合酶鏈式反應擴增產物的電泳照片，gg1、gg2及gg3為鞍帶石斑魚，lg1、lg2及lg3為褐石斑魚，lg×gg1、lg×gg2為雜交種。圖5為利用序列2的引物的聚合酶鏈式反應擴增產物的電泳照片，gg1、gg2及gg3為鞍帶石斑魚，lg1、lg2及lg3為褐石斑魚，lg×gg1、lg×gg2為雜交種。具體實施方式以下，基于實施例及附圖對本發明進行詳細說明。在本發明中使用的術語、實施例、附圖等僅用于更具體地說明本發明，并有助于本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員理解本發明，不能解釋為本發明的發明要求保護范圍等局限于此。若在本發明中使用的技術術語及科學術語無其他定義，則表示本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員通常理解的意義。本發明涉及褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法，上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法包括：準備雌性褐石斑魚的成熟卵，并準備雄性鞍帶石斑魚的精液之后，進行兩者之間的人工受精，來生產受精卵的步驟；以及對上述受精卵進行孵化及飼育來生產仔魚的步驟。并且，本發明涉及褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法，上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法包括：準備雌性鞍帶石斑魚的成熟卵，并準備雄性褐石斑魚的精液之后，進行兩者之間的人工受精，來生產受精卵的步驟；以及對上述受精卵進行孵化及飼育來生產仔魚的步驟。并且，本發明涉及褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的確認方法，上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的確認方法包括：對生產的上述仔魚的脫氧核糖核酸進行提取的步驟；對提取的上述仔魚的脫氧核糖核酸和序列1的引物或序列2的引物進行混合，并利用聚合酶鏈式反應進行擴增的步驟；以及通過電泳來確認通過上述擴增獲得的產物的步驟。在通過上述電泳來確認的步驟中，在使用序列1的引物的情況下，若檢測到約320bp、330bp、400bp及450bp的條帶，則判定為雜交種。在通過上述電泳來確認的步驟中，在使用序列2的引物的情況下，若檢測到約380bp及410bp的條帶，則判定為雜交種。并且，本發明涉及利用上述褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種的生產方法來制備而得的雜交種、受精卵及仔魚。以下，通過實施例詳細說明本發明。以下實施例僅用于實施本發明，本發明的內容并不局限于以下實施例。實施例1.親魚的確保在本發明中，作為褐石斑魚，利用了在韓國濟州附近采集且在親魚飼育槽中正在馴養的體重為1.5～5.2kg的個體中成熟的雌性褐石斑魚，作為鞍帶石斑魚，利用了從臺灣進口且在親魚飼育槽中正在馴養的體重為54.2～112.0kg的個體中成熟的雄性鞍帶石斑魚。實施例2.雜交利用腹部壓迫法從成熟的雌性褐石斑魚與雄性鞍帶石斑魚中分別提取卵和精液之后，利用干法通過人工受精進行了雜交。首先，為了取得成熟的雌性褐石斑魚的高質量的成熟卵，觀察腹部之后，一邊用手摸一邊確認了成熟狀態。向進行成熟的雌性褐石斑魚的腹腔注射了25μg/kg的黃體生成素釋放激素(lhrh)(美國西格瑪(sigma，usa)公司)和1000iu/㎏的人絨毛膜促性腺激素(hcg)。從注射之后36小時開始以4小時的間隔用手摸并確認了成熟卵是否完熟，最終，通過壓迫腹部來確保了成熟卵。利用腹部壓迫法來提取了雄性鞍帶石斑魚的精液。需要防止確保的成熟卵在常溫條件下露出30分鐘以上，并在采卵容器中使確保的成熟卵與精液均勻地混合之后，在室溫條件下，放置1～5鐘，之后，添加海水來激活精子。之后，再添加海水，在室溫條件下，放置5～20分鐘，之后，區分了浮性卵和沉性卵。其中，僅將浮性卵移到洗卵網來清洗殘留精液之后，將洗卵網飄浮于水槽來將海水流出10～20小時左右。最終，僅收取上浮的受精卵來移到孵化槽。實施例3.孵化及飼育在孵化槽中相同地進行了孵化及仔魚的飼育。孵化實驗結果表明，在22～31℃為止的孵化槽的水溫中，全部進行孵化，但在22℃和31℃中呈現低于25℃和28℃的孵化率。卵黃吸收仔魚的生存率在25℃及28℃實驗組中呈現高的數值，但在22℃和31℃實驗組中未生存(圖1)。孵化仔魚的畸形率分析結果表明，在25℃溫度下，呈現1.5％的畸形率，而在28℃溫度下，畸形率高達15.5％，使得適當孵化槽的溫度優選為23～27℃，更優選為23.5～26.5℃。從孵化之后開口結束的2天開始供給了輪蟲(rotifer)。隨著仔魚生長，與鹵蟲幼體一同供給了配合飼料。飼育水利用了過濾海水，在飼育初期以指數式維持，從供給鹵蟲之后將1天換水量維持成30～50％。針對水槽內排泄物，從鹵蟲供給步驟開始通過虹吸管進行了去除。實施例4.生長率的調查對孵化之后仔魚的大小、卵黃吸收之后仔魚的大小及孵化3天、5天、7天、12天、17天、24天間隔的生長率進行了調查(圖2)。以全長為基準進行了測定，為了比較相應的雜交種的生長，以與褐石斑魚純種的全長為基準進行了比較。孵化之后20天為止，褐石斑魚純種和褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種之間無顯著的差異，但之后，與褐石斑魚純種相比，褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種在40天呈現約155％的生長，在70天呈現187％的生長(圖3)。實施例5.利用分子標記的雜交種的判別以褐石斑魚和鞍帶石斑魚及兩種之間的雜交種作為對象，切割尾鰭的一部分，并利用酚提取(phenolextraction)方法提取了基因組(genomic)脫氧核糖核酸。利用隨機擴增多態性脫氧核糖核酸(rapd，randomamplifiedpolymorphicdna)技術判別了雜交種。在隨機擴增多態性脫氧核糖核酸聚合酶鏈式反應中利用了10-mer隨機引物(randomprimer)(美國加利福尼亞州阿拉米達市操縱子技術公司(operontechnologies，inc.，alameda，ca.))，以各1條的方式將共3條的基因組脫氧核糖核酸作為對象，首先進行聚合酶鏈式反應，來選定了呈現有效的條帶圖案的2個引物(表1)。之后，以3條鞍帶石斑魚、2條褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種及3條褐石斑魚為對象，利用相應的2個引物進行了驗證。聚合酶鏈式反應實施如下：將30ng的基因組脫氧核糖核酸和25μμ的隨機引物放入20ul的容積的accupower聚合酶鏈式反應預混合試劑盒(pcrpremixkit)(韓國柏業(bioneer，korea)公司)之后，在94℃溫度下，進行5分鐘的初期熱變性反應之后，將在94℃溫度下1分鐘，在36℃溫度下1分鐘，在72℃溫度下2分鐘的循環反應進行了35次。最終，在72℃溫度下，進行了10分鐘的延伸反應。在利用gelred(美國biotium公司(biotiuminc.，usa))進行染色的1.5％的瓊脂糖(agarose)凝膠中，進行電泳來確認了聚合酶鏈式反應是否成功。其結果，在序列1的引物(opa7)中，在320～340bp(約330bp)和390～410bp(約400bp)中呈現鞍帶石斑魚的特異條帶，在310～330bp(約320bp)和440～460bp(約450bp)中呈現褐石斑魚的特異條帶。在褐石斑魚與鞍帶石斑魚的2條雜交種中共享上述所涉及的特異條帶(圖4)。在序列2的引物(opa8)中，在370～390bp(約380bp)中呈現鞍帶石斑魚的特異條帶，在400～420bp(約410bp)中呈現褐石斑魚的特異條帶，在褐石斑魚與鞍帶石斑魚的2條雜交種中均共享2個特異條帶(圖5)。因此，利用序列1及序列2的引物，可明確地區分褐石斑魚和鞍帶石斑魚及兩種之間的雜交種。表1引物名稱堿基序列(5’→3’)opa7gaaacgggtgopa8gtgacgtagg序列表<110>韓國海洋科學技術院順天鄉大學校產學協力團木浦大學校產學協力團尹樂進<120>褐石斑魚與鞍帶石斑魚的雜交種及其生產方法<130><150>kr10-2015-0185564<151>2015-12-24<160>2<210>1<211>10<212>dna<213>石斑魚屬（epinephelus）<400>1gaaacgggtg10<210>2<211>10<212>dna<213>石斑魚屬（epinephelus）<400>2gtgacgtagg10當前第1頁12