專利名稱：斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因、載體、重組菌株和蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白以及編碼該蛋白的基因，包含該基因的載體以及該蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鈣調(diào)蛋白(CaM)是Ca2+信號通路中的重要調(diào)控蛋白之一。Ca2+作為細胞內(nèi)的第二信使，在行使其傳遞信息流作用中，要依賴于鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白的相互作用，其中，鈣調(diào)蛋白是在真核細胞中廣泛分布的。于1964年，美籍華人張槐耀對胞內(nèi)cAMP的相關(guān)研究工作中發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白的存在。鈣調(diào)蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，是一種酸性的單鏈蛋白，兩端各包含有兩個高度保守的Ca2+結(jié)合區(qū)域，每個Ca2+結(jié)合區(qū)域能夠結(jié)合一分子的Ca2+，中間由α螺旋結(jié)構(gòu)相連，其分子量一般在1.7KDa，約由149個氨基酸組成。在其氨基酸組成當(dāng)中，酸性氨基酸占了約30%，從而能夠提供羧基(-C00H)與鈣離子結(jié)合。在功能上，鈣調(diào)蛋白單體一般以非活性狀態(tài)存在于細胞內(nèi) ，當(dāng)細胞受到外界刺激以后，能夠迅速捕獲胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+，從而引起自身的構(gòu)象發(fā)生改變，形成具有高度活性的Ca2+-CaM復(fù)合物，由于在其氨基酸組成中不包含有羥脯氨基酸，從而保證了肽鏈的高靈活性，作用于靶酶的激活位點，引起其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使后者從非活性態(tài)轉(zhuǎn)變成活性態(tài)。靶酶被激活后，又會作用于下游的關(guān)鍵因子，進一步在逆境中調(diào)節(jié)細胞的代謝，在增強魚類自身免疫能力的方面，對機體的免疫防御發(fā)揮出重要的作用。斜帶石斑jMXEpinepheluscoioides)屬于 S盧形目(Perciformess),鯧科(Serranidae),石斑魚亞科iBpinepheIinae),石斑魚屬{Epinephelus、,是暖水性的礁棲魚類，在印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域廣泛分布。石斑魚屬于名貴海產(chǎn)魚類之一，其肉質(zhì)鮮美，倍受各地消費者的喜愛，經(jīng)濟價值巨大。但是，由于面對著目前的急劇的氣候變化災(zāi)害和嚴(yán)重污染的水質(zhì)問題，從而導(dǎo)致了其致病率和死亡率居高不下，對石斑魚的人工養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟打擊，也是一個難以解決的問題。如何增強石斑魚的抗逆能力，提高養(yǎng)殖存活率，是目前亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有問題，本發(fā)明的目的在于提供一種斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白、該蛋白的編碼基因、以及該蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。編碼上述斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。—種克隆載體，其含有斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因。一種表達載體，其含有斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因。
生產(chǎn)斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白的方法，包括將含有斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因的表達載體導(dǎo)入宿主細胞中，表達得到斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白。所述宿主細胞為畢赤酵母。斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白在制備水產(chǎn)動物免疫增強劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明首次獲得了斜帶石斑魚的鈣調(diào)蛋白CaM基因序列，可以應(yīng)用于制備重組蛋白、魚類免疫制劑和飼料添加劑，為斜帶石斑魚的生理免疫研究提供了新的實踐基礎(chǔ)；
(2)本發(fā)明所提供的斜帶石斑魚CaM重組蛋白，經(jīng)實驗證明可以提高石斑魚抗應(yīng)激能力，可以應(yīng)用于制備與魚類相關(guān)的免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應(yīng)用潛力；
(3)將斜帶石斑魚CaM核苷酸序列在巴斯德畢赤酵母重組菌株中表達，可以應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生存，降低了成本的投入，具有較高的經(jīng)濟·價值。


圖1是斜帶石斑魚CaM基因ORF的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定 圖2是石斑魚CaM基因ORF連接酶切接頭(McoRI ,XbaI)的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定
圖3是克隆載體pMD18-T-CaM雙酶切, XbaI)和表達載體pPICZaA雙酶切iEcoRI 'XbaD的電泳鑒定 圖4是pPICZaA表達載體和所構(gòu)建的pPICZaA_CaM表達載體單酶切iSacl)的電泳鑒定 圖5是重組菌株pPICZaA-CaM-X-33表達產(chǎn)物CaM重組蛋白的Tricine-SDS-Page電泳分析 圖6是重組菌株pPICZaA-CaM-X-33表達產(chǎn)物CaM重組蛋白的western blot鑒定圖； 圖7是pPICZaA-CaM畢赤酵母表達載體構(gòu)建示意 圖8是斜帶石斑魚CaM蛋白的氨基酸序列和人CaM蛋白的氨基酸序列對比 圖9是斜帶石斑魚CaM蛋白抗原表位預(yù)測分析結(jié)果；
圖10是重組菌株pPICZaA-CaM-X-33高密度發(fā)酵產(chǎn)物CaM重組蛋白的SDS-Page電泳分析 圖11是在低溫應(yīng)激中的，A，B, C三組魚血細胞數(shù)目隨應(yīng)激時間的變化情況；
圖12是在低溫應(yīng)激中A、B、C三組魚血細胞呼吸爆發(fā)水平隨應(yīng)激時間的變化情況；
圖13是在低溫應(yīng)激中A、B、C三組魚血細胞凋亡情況隨應(yīng)激時間的變化情況。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所采用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)包括PCR擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。一、通過設(shè)計兼并引物獲得斜帶石斑魚CaM基因的ORF依據(jù)CaM蛋白氨基酸序列在各個物種中的保守性，設(shè)計兼并引物。第一條引物為 CAMS1，5’ -GACATGGCTGACCAACTAACA(SEQ ID NO:3)，第二條引物為 CAMA1，5， -AGTTCATTTGGCGGTCATAA
(SEQ ID N0:4),以 M-MLV reverse transcriptase kit(Promega, Madison, WI, USA)反轉(zhuǎn)錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經(jīng)過touchdownPCR技術(shù)，獲得PCR擴增產(chǎn)物，對其進行測序并比對，確定為CaM基因，其長度為468bp (SEQID NO:1 )，并推測出其氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4分鐘；
(I)94°C變性30s，退火72°C 30s，共5個循環(huán)；(2) 94°C變性30s，退火70°C 30s，延伸72°C，共5個循環(huán)；(3)94°C變性30s，退火53°C 30s，延伸72°C，共30個循環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1，其中:M為DS2000 Marker ;1，2為PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送去華大基因公司測序，測序結(jié)果和比對結(jié)果一致。二、生物信息學(xué)方法分析斜帶石斑魚CaM蛋白序列
使用clustal-X和GeneDoc兩個序列分析軟件，將斜帶石斑魚CaM基因的氨基酸序列和人CaM基因的氨基酸序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚CaM蛋白序列和人類CaM蛋白序列有較高的同源性(圖8)，并通過DNAstar軟件分析斜帶石斑魚CaM蛋白的抗原表位(圖9)。三、斜帶石斑魚CaM基因序列的 合成
根據(jù)分析好的斜帶石斑魚CaM基因的cDNA序列，設(shè)計合成上下游兩端的引物。上游引物是CAMSP，在該片段第一位堿基起前加入的限制酶切位點以及其保護堿基5’ -CCGGAATTCATGGCTGATCAGCTTACAGA(SEQ ID NO: 5);下游引物是 CAMAP1M，在該片段后插入XbaI的限制酶切位點以及該酶切位點的保護堿基、6Xhis標(biāo)簽、終止密碼子5’ - TGCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGCTTCGCCGTCATCATTTGT] (SEQ ID NO:6)。以反轉(zhuǎn)錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴增石斑魚的CaM基因，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性
3分鐘；下邊為40個循環(huán):94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖2，其中，M:DS 2000 marker ;1，2:PCR擴增產(chǎn)物。從圖2可見PCR擴增后獲得一段約460bp的序列。四、含斜帶石斑魚CaM序列的克隆載體pMD18-T_CaM的構(gòu)建
將上述所獲得的基因片段分離純化，然后與PMD18-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系4°C連接過夜(13h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)Amp+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆；通過質(zhì)粒小提試劑盒(Omega，USA)提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚CaM序列克隆到載體中，命名為pMD18-T-CaM，克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α所得到的重組菌株命名為pMD18-T-CaM_DH5 α。使用EcoR1、XbaI對克隆載體pMD18-T-CaM進行雙酶切，酶切圖譜見圖3所示:M為DS 5000 Marker ；1:為pMD18_T_CaM的,XbaI雙酶切產(chǎn)物；2:pPICZaA表達載體的、XbaI雙酶切產(chǎn)物。五、含斜帶石斑魚CaM序列的表達載體pPICZaA- CaM的構(gòu)建
克隆載體pMD18-T-CaM經(jīng)小提質(zhì)粒試劑盒(Omega，USA)抽提后，用限制性內(nèi)切酶及和油<3J進行雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit回收，分離純化約460bp的斜帶石斑魚CaM序列；
載體質(zhì)粒pPICZaA經(jīng)限制性內(nèi)切酶及和油a/雙酶切后分離純化3.6kb的大片段，與約460bp的斜帶石斑魚CaM的基因片段以1:3比例混合，用T4連接酶于16°C過夜連接(約15h)。然后,用CaCl2法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，于低鹽LB平板篩選出具Zeocin抗性的轉(zhuǎn)化子。以標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒，篩選大小約4.0 kb的重組質(zhì)粒,經(jīng)送往Invitrogen公司測序，對測序結(jié)果進行比對，為斜帶石斑魚CaM的基因序列，并正確插入到畢赤酵母表達載體pPICZaA中，重組質(zhì)粒命名為PICZaA-CaM。質(zhì)粒構(gòu)建流程見圖7。使用J對表達載體PPICZaA-CaM進行雙酶切，酶切分析圖見圖4，其中M:DS5000 Marker ；1:pPICZaA載體；2:pPICZaA載體的酶切產(chǎn)物；3:表達載體pPICZaA-CaM ；4:pPICZaA-CaM表達載體的Sacl酶切產(chǎn)物。六、能高效表達斜帶石斑魚CaM蛋白的畢赤酵母重組菌株pPICZaA-CaM _X_33構(gòu)
建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect Pichia Expression Kit 說明書制備畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒pP I CZaA-CaM用fee J線形化后凝膠回收，用電擊法將重組質(zhì)粒pPICZaA-CaM轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞中，在含有Zeocin 350 μ g/ml的YPDS平板上28°C進行培養(yǎng)。約3d后長出單克隆菌株。挑取單克隆經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定篩選出能高效表達斜帶石斑魚CaM重組蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- CaM _X_33。七、利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA- CaM _X_33生產(chǎn)重組斜帶石斑魚CaM蛋白 分別挑取各單克隆工程菌，接種于BMGY中，28°C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，離心換等
體積培養(yǎng)基BMMY，稀釋0D600至1.0，每隔24h向培養(yǎng)基中補加0.5%甲醇，培養(yǎng)約96h后，5000rpm離心2min,4°C收集上清。取約Iml上清,用DOC-TCA-丙酮沉淀法對蛋白進行濃縮后，加入5X電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣方法處理后電泳。陰性對照為空載質(zhì)粒PPICZaA轉(zhuǎn)化X-33后長出的單克隆培養(yǎng)后的上清蛋白。結(jié)果見圖5，其中:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC:重組菌株pPICZaA-X-33表達產(chǎn)物；1:重組菌株pPICZaA- CaM_X_33表達產(chǎn)物。NC作為陰性對照，位于17Kd和26Kd之間出現(xiàn)一條新的蛋白條帶,而陰性對照不出現(xiàn)此蛋白帶。

八、斜帶石斑魚CaM蛋白抗原活性鑒定實驗
采用蛋白印跡方法(western blot)對重組斜帶石斑魚CaM蛋白進行免疫鑒定。其中，一抗采用鼠源his單克隆抗體(Novagen), 二抗采用馬抗小鼠IgG-AP (鼎國生物公司)。結(jié)果如圖6所示。其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC:重組菌株pPICZaA-X-33表達產(chǎn)物Westernblot鑒定圖譜；1:重組菌株pPICZaA- CaM-X-33表達產(chǎn)物Western blot鑒定圖譜。NC作為陰性對照，說明鼠源his單克隆抗體能夠識別帶有6Xhis標(biāo)簽的重組斜帶石斑魚CaM蛋白，證明得到的蛋白為斜帶石斑魚CaM蛋白。九、畢赤酵母工程菌pPICZaA- CaM -X-33的高密度發(fā)酵
發(fā)酵過程參照 Invitrogen 公司的Pichia Fermentation Process Guidelines,具體步驟如下:
1.分別在 YPDS(Zeocin+)提取單克隆菌株，pPICZ a A-CaM-X-33 和 pPICZ α Α-Χ-33，其中pPICZa Α-Χ-33菌株作為空載對照。加入200ml MGY液體培養(yǎng)基到IL的錐形瓶中，30°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)至 0D600=2-6 (約 16_24h)。2.組裝好發(fā)酵罐，加入3L含有4%甘油的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(配方見PichiaFermentation Process Guidelines),然后121°C,滅菌15min,待冷卻后,用流加瓶加入氨水，調(diào)pH到5。
3.在火焰圈保護下，將步驟1.1中搖好的菌種接種于發(fā)酵罐中。調(diào)節(jié)通氣量，灌壓，轉(zhuǎn)速來維持溶氧，使其高于20%。設(shè)定發(fā)酵溫度為28°C，自動流加氨水控制pH 5±0.05。4.當(dāng)發(fā)酵罐中的甘油耗盡后(約接種后20個小時)，用流加瓶流加每升含12mlPTMl (配方見 Pichia Fermentation Process Guideline),設(shè)置流加速度為 54.45ml/h,直到細胞濕重為200 g/liter結(jié)束(流加大約4個小時)。5.甘油消耗盡后，開始添加每升含12ml PTMl的甲醇，設(shè)定流加速度為10.8 ml/h，兩個小時，設(shè)定流加速度為21.9 ml/h;兩個小時后，設(shè)定流加速度為32.7 ml/h，保持這個速度直到發(fā)酵結(jié)束。這個階段需要60個小時，總共添加約1.2L的甲醇。此時的細胞濕重約為 290 g/liter ο6.分別取 pPICZ a A-CaM_X_33 與 pPICZ α Α-Χ-33 發(fā)酵的菌液各 Iml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5Χ電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，pPICZ α Α-Χ-33發(fā)酵的菌液做為陰性對照組，結(jié)果見圖10。其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC:空載菌株pPICZaA-X-33表達產(chǎn)物；1:重組菌株pPICZaA-CaM-X-33表達產(chǎn)物。顯示pPICZaA- CaM _X_33在17Kd和26Kd之間出現(xiàn)一條蛋白條帶，而陰性對照不出現(xiàn)此帶。結(jié)果說明，PPICZaA- rC3B _X_33菌種發(fā)酵產(chǎn)生了高濃度的重組蛋白。7.把發(fā)酵液用噴霧干燥器處理，得到粉末，PPICZaA-CaM -X-33菌種的發(fā)酵液粉末做為飼料添加劑，pPICZ α Α-Χ-33菌種的發(fā)酵液粉末做為對照，用于飼養(yǎng)實驗。十、動物實驗 I實驗條件 選取同一批次、體質(zhì)健康、規(guī)格相近的斜帶石斑魚放養(yǎng)在養(yǎng)殖桶中。水溫25 30°C,水體鹽度28 32%。，pH值8.1 8.3，溶解氧值大于5.0 mg/L,并且水體持續(xù)循環(huán)。2飼料配置
飼料共分為3種，A為商品料，B為商品料十lwt% pPICZ α Α_Χ_33菌種的發(fā)酵液粉末，C為商品料+ lwt%pPICZaA- CaM_X_33菌種的發(fā)酵液粉末。(分別將各組粉料攪拌均勻，每天投喂前準(zhǔn)確稱量，用水稀釋后制備成濕顆粒飼料投喂)。3實驗魚飼養(yǎng)
本試驗設(shè)3個實驗組，每組30條魚。分別投喂A、B、C組飼料。試驗魚平均體重
0.90±0.03g，長度為3±0.6cm。養(yǎng)殖水不斷充氣，水溫29土 2°C，水體pH值8.1 8.3，水體鹽度28 32%。。上午和下午按照魚體重的8%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及時清理殘餌，觀察記錄，飼養(yǎng)時間7周。實驗前禁食一天。4.應(yīng)激實驗 4.1實驗計劃
取用飼喂的斜帶石斑魚做溫度應(yīng)激實驗，應(yīng)激溫度為10土 0.5°C。實驗準(zhǔn)備1.0mX0.5 mX 0.5 m的儲物箱3個，在每個儲物箱先裝滿40L的海水，并將裝有海水的儲物箱置于氣候箱中并放入水溫計來測定水溫，待水溫穩(wěn)定在10±0.5°C，然后每個儲物箱分別放A，B，C三組魚各30條魚，將做低溫應(yīng)激實驗的儲物箱置于氣候箱中并放入水溫計來測定水溫。應(yīng)激12小時，分別在O小時、3小時、6小時、12小時取樣，每組取6尾。4.2血細胞計數(shù)以及滲透壓的測定用I ml—次性無菌注射器臀鰭下方尾靜脈或尾動脈抽血，取完血后，拔下針頭，將血液注入玻璃采血管中，4°C下靜置，取血清。血細胞計數(shù)板的計數(shù)血細胞方法按照WHO手冊進行計數(shù)，分別計數(shù)血細胞3次，取3次結(jié)果的平均值為計數(shù)結(jié)果。4.2.1血細胞計數(shù)的測定原理
細胞的計數(shù)一般使用血球計數(shù)板。每塊計數(shù)板由H形凹槽分為2個同樣的計數(shù)池，計數(shù)池高0.1mm0計數(shù)池分為9個大方格,每個大格面積為1.0mm.容積為0.1mm3C μ I),其中，中央大方格分成25個中方格，位于正中及四角5個中方格是紅細胞計數(shù)區(qū)域。四角的4個大方格是白細胞計數(shù)區(qū)域。在計數(shù)血細胞時，要計算位于中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數(shù)目，再根據(jù)公式細胞數(shù)/ml=五個中方格內(nèi)的細胞個數(shù)/5 X 25 X 10000X稀釋倍數(shù)。4.2.2血細胞計數(shù)的測定方法
視待測血細胞的濃度，加抗凝劑適當(dāng)稀釋(一般稀釋100倍)，然后取潔凈的血球計數(shù)板一塊，并在計數(shù)區(qū)內(nèi)蓋上一塊蓋玻片。將血細胞輕輕吹打混勻，用移液槍吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生。靜置片刻后，把血球計數(shù)板放在顯微鏡的載物臺上然后觀察并計數(shù)中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數(shù)目。在計數(shù)時，要遵循原則:數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈。每個血樣分別計數(shù)血細胞3次，取3次結(jié)果的平均值為計數(shù)結(jié)果。結(jié)果顯示:應(yīng)激過程中，在10±0.5°C應(yīng)激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的魚血細胞數(shù)目并沒有明顯差異。應(yīng)激3小時后，A，B，C三組的血細胞數(shù)目均有下降，但是C組的血細胞數(shù)目高于A、B組。應(yīng)激6小時后，A，B，C三組的血細胞數(shù)目進一步下降，但是C組的血細胞數(shù)目下降較A、B組少，數(shù)目明顯高于A、B組。應(yīng)激12小時后，A，B, C三組的血細胞數(shù)目均有上升，C組的血細胞數(shù)目略高于A，B組，沒有明顯差異(見圖11)。4.3呼吸爆發(fā)的測定
4.3.1細胞呼吸爆發(fā)的測定原理
活性氧(Reactive oxygen species, R0S)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，是機體進行正常細胞生長增殖、發(fā)育分化過程中產(chǎn)生，參與了機體衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。2，7-二氯氫化熒光素二脂(2，7-dichlorof Iuoresceindiacetate, DCFH-DA)是迄今為止最常用、最靈敏的細胞內(nèi)活性氧檢探針。本身沒有熒光的DCFH-DA可穿過細胞膜進入細胞，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比。在激發(fā)波長502nm，發(fā)射波長530nm附近，使用流式細胞儀的FLl通道檢測DCF熒光，從而測定細胞內(nèi)活性氧水平。4.3.2血細胞呼吸爆發(fā)的測定方法
取200 μ I的血細胞懸液，加入200 μ I PBS緩沖液(MAS抗凝劑進行稀釋)，混勻，調(diào)整細胞的濃度為I X IO6個/ml左右，使用熒光染料2，7-二氯氫化熒光素二脂(DCFH-DA)(終濃度10 μ Μ) 25°C下避光染色30min。然后使用200目的篩網(wǎng)過濾將細胞懸液轉(zhuǎn)移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測，并用Cellquest軟件分析DCF平均熒光強度的變化。結(jié)果顯示:A，B, C三組魚 受到低溫10±0.5°C應(yīng)激后，應(yīng)激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的魚血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))并沒有明顯差異。隨著應(yīng)激時間的延長，血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))水平不斷升高，在6小時達到最大值，并且A，B組的活性氧含量明顯高于C組。應(yīng)激12小時后，A，B, C三組的血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))均有下降，但是C組的血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))明顯低于A，B組(見圖12)。4.4細胞凋亡測定
4.4.1血細胞凋亡的測定原理
細胞凋亡是細胞程序性死亡，當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時候，細胞膜的通透性增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。血淋巴細胞凋亡的測定原理:在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂 酰絲氨酸(PS)由膜脂內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。用標(biāo)記了FITC的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。碘化丙唳(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠細胞膜與細胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。在雙參數(shù)流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FIT C — / PI—)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FIT C + / PI + );而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC + / PI —)。4.4.2血淋巴細胞凋亡的測定方法
使用Annexin V/PI apoptosis kit,購自聯(lián)科生物。具體步驟:
收集血細胞，用MAS抗凝劑進行稀釋，調(diào)整血細胞濃度大約為IXlO6 -5X IO6 cells/ml，取200μ I稀釋的血細胞，在細胞懸浮液中加入5μ I Annexin V-FITC和10 μ I PI后輕輕混勻，在黑暗環(huán)境下靜置5分鐘，然后使用200目的篩網(wǎng)過濾將細胞懸液轉(zhuǎn)移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測。結(jié)果表明:Α，B, C三組魚受到低溫10±0.5°C應(yīng)激后，應(yīng)激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的魚血細胞的細胞凋亡數(shù)目并沒有明顯差異。隨著應(yīng)激時間的延長,血細胞的細胞凋亡數(shù)目不斷增加，A、B組血細胞的細胞凋亡數(shù)目增加比C組多，在6小時達到最大值，并且A、B組的細胞凋亡數(shù)目明顯高于C組。應(yīng)激12小時后，A、B、C三組的血細胞的細胞凋亡數(shù)目均有下降，但是C組的血細胞的細胞凋亡數(shù)目明顯少于A、B組，并且差異顯著(見圖13)。以上實驗表明:實驗組C組，食用了含有重組蛋白CaM的飼料后，在低溫應(yīng)激過程中，其抗應(yīng)激能力明顯優(yōu)于對照組A、B。由此可見，重組蛋白CaM能夠提高魚類尤其是石斑魚的免疫力，可用于制備水產(chǎn)動物免疫制劑或飼料添加劑。以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
權(quán)利要求
1.斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.一種克隆載體，含有權(quán)利要求2或3所述的基因。
5.—種表達載體,含有權(quán)利要求2或3所述的基因。
6.生產(chǎn)斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白的方法，包括將權(quán)利要求5所述的表達載體導(dǎo)入宿主細胞中，表達得到斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備水產(chǎn)動物免疫增強劑中的應(yīng)用。
9.一種免疫增強劑，含有權(quán)利要求1所述的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白基因、載體、重組菌株和蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明首次獲得了斜帶石斑魚的鈣調(diào)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。經(jīng)實驗證明，斜帶石斑魚鈣調(diào)蛋白可以提高石斑魚抗應(yīng)激能力，可以應(yīng)用于制備與水產(chǎn)動物相關(guān)的免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應(yīng)用潛力。
文檔編號C07K14/46GK103172722SQ201310073460
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者王維娜, 羅盛偉, 祁增華 申請人:華南師范大學(xué)