本發明涉及一種白僵蠶的人工制備方法。
背景技術：
白僵蠶為蠶蛾科動物家蠶蛾的幼蟲感染白僵菌而僵死的全蟲。白僵蠶是一味藥用價值較高的中藥，其味咸、辛，性平，可治面上黑及礙容性疾病，白僵蠶含有氨基酸和活性絲光素，有營養皮膚和美容作用；含蛋白質有刺激上皮脂腺，調節性激素分泌的作用；含維生素E，能清除自由基，抗脂質氧化形成的老年斑；含活性絲光素能促使皮膚細胞新生，調節皮脂，改善皮膚微循環，可增白防曬。
過去白僵蠶均為自然死亡，后來進行人工接種培養，在蠶4次蛻皮，接種后，蠶陸續發病死亡，及時揀出，另行攤放，保持同樣溫度，待其充分發僵變白后，置于通風處，風干或弱光下曬干。然而現有的人工生產的白僵蠶，仍然存在一些問題，如感染后的蠶體從死亡到僵化時間較長，白僵蠶的僵化率較低，僵化時間不整齊，質量不穩定，產量較低，成本也較高，不能達到產業化生產。
技術實現要素：
有鑒于此，本申請提供一種白僵蠶的人工制備方法，其采用的球孢白僵菌孢子液經過復壯，提高了攻毒活性，僵化率高，通過攻毒、蠶體培養、白僵蠶培養過程中溫度、濕度等條件的改進，縮短了白僵蠶成品的制備周期，提高了白僵蠶的產量和質量。
為解決以上技術問題，本發明提供的技術方案是一種白僵蠶的人工制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養后得球孢白僵菌孢子液；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液在制成后的45min內，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施完成后密閉蠶房1-1.5h；
(3)蠶體培養：打開步驟(2)所述蠶房，對蠶體喂食，每隔3-4h喂食一次，直至蠶體死亡；
(4)白僵蠶培養：將步驟(3)死亡后的蠶體轉移至蠶座上，在溫度為25-28℃，濕度為95-98％的條件下繼續培養至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥至水分小于10％，即得白僵蠶成品。
優選的，步驟(1)所述一級斜面培養的溫度為25-28℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的溫度為5-10℃。
優選的，步驟(1)所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10-20％馬鈴薯淀粉、5-20％蔗糖、10-15％蛋白胨、0.1-0.5％磷酸二氫鉀、0.01-0.05％硫酸鎂、5-15％蠶蛹粉、0.01-0.05％維生素B、0.01-0.05％維生素C、0.05-0.1％氯化鐵、0.05-0.1％氯化鈣。
更為優選的，步驟(1)所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：補充18％馬鈴薯淀粉、15％蔗糖、12％蛋白胨、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％硫酸鎂、12％蠶蛹粉、0.03％維生素B、0.02％維生素C、0.08％氯化鐵、0.06％氯化鈣。
優選的，步驟(2)所述病原攻毒的溫度為22-24℃，濕度為98％以上。
優選的，所述步驟(2)噴施球孢白僵菌孢子液時，噴施的次數為3-4次，每次噴施的間隔時間為10-20min。
優選的，步驟(2)所述的球孢白僵菌孢子液的濃度為4.8-5.8萬個/cm3。
優選的，步驟(3)所述蠶體培養中，保持溫度在24-25℃，濕度為94-95％。
優選的，步驟(3)所述喂食采用桑葉、蒲公英葉、柘樹葉、生菜葉中的任意一種。
優選的，步驟(5)所述干燥的溫度為40-50℃，干燥時間為24-30h。
所述的PDA培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的簡稱，即Potato Dextrose Agar Medium。其做法是：稱取200g洗凈去皮的馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20—30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八層紗布過濾，加熱，再根據實驗需要加1—10g瓊脂，繼續加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至1000毫升，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，115℃滅菌20分鐘后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后即得。
在本申請技術方案中，所述人工制備方法包括了球孢白僵菌孢子液制備、病原攻毒、蠶體培養、白僵蠶培養、白僵蠶成品制備的步驟，直接將白僵蠶蠶體浸泡清洗過濾，得到的濾液中含有大量的球孢白僵菌孢子，通過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養進行復壯，得到的球孢白僵菌孢子液具有較高的活性，在進行病原攻毒時毒性較強；其中，控制一級斜面培養的溫度在常溫條件，使菌體快速并大量繁殖，控制二級種子培養和三級擴大培養在5-10℃的低溫條件下，可保證菌體的活性，同時減少雜菌率；此外，二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分包括了菌體生長必須的碳源、氮源之外，還增加了磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鐵、氯化鈣，提供菌體生長所需元素，同時還增加了維生素B和維生素C，二者可以提高菌體生長速度，提高孢子量，以上復配，可以在保證球孢白僵菌活性的同時，大大減少培養的周期，提高生產效率。將球孢白僵菌孢子液在制成之后的45min內噴施于家蠶的蠶體上，可保證在球孢白僵菌活性較高的情況下攻毒，提高病原攻毒的有效率；控制較常溫低的攻毒溫度和較高的攻毒濕度，保證蠶體此時最易被侵染；病原攻毒之后需要對蠶體進行繼續培養，每隔3-4h喂食一次，喂食的食物采用桑葉、蒲公英葉、柘樹葉、生菜葉中的任意一種，能夠促進蠶體在侵染之后繼續發育，提高白僵蠶成品的質量；蠶體培養致死后，需要及時將其挑揀出，轉移至白僵菌生長適宜的條件下培養，控制溫度在25-28℃，并控制較高的濕度95-98％，使死亡蠶體上白僵菌迅速生長，加快蠶體僵化，以及分生孢子的生成；分生孢子生成之后需要將其干燥至水分小于10％，避免雜菌污染后的腐爛，另外，在干燥時需控制干燥的溫度在40-50℃之間，避免溫度過高，此外干燥時間應控制在24-30h，同時避免熱風干燥。
與現有技術相比，本申請技術方案所述的白僵蠶的人工制備方法，其采用的球孢白僵菌孢子液經過復壯，提高了攻毒活性，僵化率高，通過攻毒、蠶體培養、白僵蠶培養過程中溫度、濕度等條件的改進，縮短了白僵蠶成品的制備周期，提高了白僵蠶的產量和質量。
具體實施方式
為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1
本實施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養的溫度為26℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的溫度為6℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充18％馬鈴薯淀粉、15％蔗糖、12％蛋白胨、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％硫酸鎂、12％蠶蛹粉、0.03％維生素B、0.02％維生素C、0.08％氯化鐵、0.06％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為5.5萬個/cm3，其在制成后的45min內，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數為4次，每次噴施的間隔時間為15min，噴施完成后密閉蠶房1.5h，其中，病原攻毒的溫度為23℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為94％，對蠶體喂食，每隔3.5h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用桑葉；
(4)白僵蠶培養：將步驟(3)死亡后的蠶體轉移至蠶座上，在溫度為26℃，濕度為988％的條件下繼續培養至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為45℃，干燥時間為28h，即得白僵蠶成品。
本實施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時間為90-100h，僵化率為90％，產量為白僵蠶1.5kg/g蠶種，水分含量為8.5％，白僵蠶成品出現玻璃口，質量好。
實施例2
本實施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養的溫度為25℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的溫度為5℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10％馬鈴薯淀粉、5％蔗糖、10％蛋白胨、0.1％磷酸二氫鉀、0.01％硫酸鎂、5％蠶蛹粉、0.01％維生素B、0.01％維生素C、0.05％氯化鐵、0.05％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為4.8萬個/cm3，其在制成后的45min內，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數為3次，每次噴施的間隔時間為10min，噴施完成后密閉蠶房1h，其中，病原攻毒的溫度為22℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在24℃，濕度為94％，對蠶體喂食，每隔3h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用蒲公英葉；
(4)白僵蠶培養：將步驟(3)死亡后的蠶體轉移至蠶座上，在溫度為25℃，濕度為95％的條件下繼續培養至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為40℃，干燥時間為24h，即得白僵蠶成品。
本實施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時間為120-130h，僵化率為86％，產量為白僵蠶1.2kg/g蠶種，水分含量為8.9％，白僵蠶成品出現玻璃口，質量好。
實施例3
本實施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養的溫度為28℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的溫度為10℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充20％馬鈴薯淀粉、20％蔗糖、15％蛋白胨、0.5％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、15％蠶蛹粉、0.05％維生素B、0.05％維生素C、0.1％氯化鐵、0.1％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為5.8萬個/cm3，其在制成后的45min內，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數為4次，每次噴施的間隔時間為20min，噴施完成后密閉蠶房1.5h，其中，病原攻毒的溫度為24℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為95％，對蠶體喂食，每隔4h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用柘樹葉；
(4)白僵蠶培養：將步驟(3)死亡后的蠶體轉移至蠶座上，在溫度為28℃，濕度為98％的條件下繼續培養至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為50℃，干燥時間為30h，即得白僵蠶成品。
本實施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時間為90-95h，僵化率為90％，產量為白僵蠶1.4kg/g蠶種，水分含量為7.8％，白僵蠶成品出現玻璃口，質量好。
實施例4
本實施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養的溫度為28℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的溫度為10℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10％馬鈴薯淀粉、20％蔗糖、10％蛋白胨、0.5％磷酸二氫鉀、0.01％硫酸鎂、15％蠶蛹粉、0.01％維生素B、0.05％維生素C、0.05％氯化鐵、0.1％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為4.5萬個/cm3，其在制成后的45min內，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數為4次，每次噴施的間隔時間為10min，噴施完成后密閉蠶房1.2h，其中，病原攻毒的溫度為22℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為95％，對蠶體喂食，每隔4h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用生菜葉；
(4)白僵蠶培養：將步驟(3)死亡后的蠶體轉移至蠶座上，在溫度為28℃，濕度為98％的條件下繼續培養至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為50℃，干燥時間為30h，即得白僵蠶成品。
本實施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時間為95-110h，僵化率為91％，產量為白僵蠶1.4kg/g蠶種，水分含量為8.2％，白僵蠶成品出現玻璃口，質量好。
實施例5
本實施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經過一級斜面培養、二級種子培養、三級擴大培養后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養的溫度為28℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的溫度為5℃，所述二級種子培養和三級擴大培養的培養基，其組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充20％馬鈴薯淀粉、5％蔗糖、15％蛋白胨、0.1％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、5％蠶蛹粉、0.05％維生素B、0.01％維生素C、0.1％氯化鐵、0.05％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為4.5萬個/cm3，其在制成后的45min內，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數為3次，每次噴施的間隔時間為10min，噴施完成后密閉蠶房1.5h，其中，病原攻毒的溫度為23℃，濕度為99％；
(3)蠶體培養：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為95％，對蠶體喂食，每隔4h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用桑葉；
(4)白僵蠶培養：將步驟(3)死亡后的蠶體轉移至蠶座上，在溫度為25℃，濕度為98％的條件下繼續培養至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為50℃，干燥時間為24h，即得白僵蠶成品。
本實施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時間為100-110h，僵化率為88％，產量為白僵蠶1.5kg/g蠶種，水分含量為8.5％，白僵蠶成品出現玻璃口，質量好。
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。