本發明涉及殺蟲劑，具體涉及一種紅火蟻觸殺殺蟲劑及氟蟲腈在滅殺紅火蟻中的應用。

背景技術：

紅火蟻(S.invicta)是最具有入侵性的社會性昆蟲，已經被國際上列為最具入侵性和破壞性的百種外來有害生物之一。紅火蟻食性復雜、習性兇猛、繁殖迅速、競爭力強，能造成重大經濟損失、社會危害和環境影響，紅火蟻的雜食性和攻擊性使其不僅是一種經濟害蟲，還威脅到公眾健康。化學防治措施仍然是防治紅火蟻有效措施，但仍然不能根除紅火蟻。而且長期用化學藥劑對紅火蟻進行控制，會導致意想不到的反彈。

氟蟲腈(商品名：銳勁特)英文通用名稱為fipronil，是原法國羅納-普朗克公司于1981年開發的苯基吡唑類新型廣譜性殺蟲劑，化學名稱：(±)-5-氨基-1-(2，6-二氯-4，4，4-三氟甲苯基)-4-三氟甲基亞硫酰基-3-氰基吡唑。氟蟲腈能與γ-氨基丁酸受體結合，有效阻塞昆蟲中樞神經系統的γ-氨基丁酸調節的氯離子通道，干擾昆蟲中樞神經系統，引起昆蟲神經和肌肉的過度興奮直至死亡。作為控制作物害蟲的殺蟲劑，氟蟲腈活性高，殺蟲譜廣，有觸殺、胃毒和內吸作用，對鱗翅目、同翅目、半翅目、纓翅目和直翅目，鞘翅目和膜翅目的多種害蟲有優良的防效。

氟蟲腈由于具有獨特的作用機制，可有效地控制對有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗性的害蟲。近年來，人們發現一些害蟲對氟蟲腈產生一定程度的抗性。Kolaczinski等(2001)用WHO套裝試劑對5個品系的按蚊進行測試，發現其中兩個品系對氟蟲腈具有抗性。氟蟲腈在動物、植物、環境中代謝生成毒性與氟蟲腈相當或毒性更高的砜化物或亞砜化合物。在動物體內通過吸收、代謝、排泄以和水解、光解等作用，廣泛分布于動物的組織中，特別是在脂肪組織中含量較高。主要的排出途徑是通過糞便。具體途徑如下：

氟蟲腈在動物體內的代謝途徑。

毒死蜱(chlorpyrifos)是一種高效、廣譜的有機磷殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，可用于防治螟蟲、卷葉蟲、粘蟲、介殼蟲、蚜蟲、棉鈴蟲、葉蟬和紅蜘蛛等害蟲毒死蜱對神經系統具有毒性作用，在動物體內能夠轉換為比其本身毒性強3000倍的氧化毒死蜱。在水、空氣、土壤、植物和動物體內的初級代謝物對雞胎盤比毒死蜱毒性高2-3倍。而且毒死蜱和TCP(3，5，6-三氯-2-吡啶酚)有可能存在協同效應。毒死蜱殺蟲劑與細胞色素P450單氧化酶誘導研究多集中于魚類、人類和小鼠中(Wheelock and Eder,2005；Cui et al.,2008；Lee,2009)，在昆蟲中，而對細胞色素P450單氧化酶的研究尚少。最近，于榮榮等(2013)用毒死蜱誘導東亞飛蝗，結果顯示，CYP4G62能被高劑量毒死蜱顯著誘導，CYP9AQ1經毒死蜱處理后，在低、中和高濃度均被顯著誘導。

技術實現要素：

為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種紅火蟻觸殺殺蟲劑及氟蟲腈在滅殺紅火蟻中的應用。

本發明的技術方案是：一種紅火蟻觸殺殺蟲劑，其有效成分是氟蟲腈、辛硫磷和或毒死蜱。

本發明的進一步改進包括：

其有效成為是濃度為0.15-0.36μg/ml的辛硫磷或0.26-0.55μg/ml的氟蟲腈或0.34-0.64μg/ml的毒死蜱。

所述的紅火蟻觸殺殺蟲劑是將有效成分溶解于丙酮中制得。

其有效成分是濃度不低于15.168μg/ml氟蟲腈。

本發明的另一目的在于提供了氟蟲腈在滅殺紅火蟻中的應用。

所述的應用，是含有氟蟲腈的殺蟻餌劑被紅火蟻工蟻取食，當餌劑被紅火蟻帶進巢內后，通過工蟻在巢內的頻繁活動和交哺喂食行為，將藥劑傳遞到巢內的工蟻、幼蟻和蟻后，引起全巢紅火蟻中毒死亡。

本發明制備簡單，使用方便，滅殺效果好。

附圖說明

圖1是BSA蛋白含量標準曲線。

圖2.是不同濃度對硝基苯酚的吸光度

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做詳細說明。

實施例1

紅火蟻的防治方法很多，其中化學防治技術是最有效、最深入、應用最為廣泛的防治方法。餌劑的撒播是紅火蟻大面積防治最有效的和持效的方式，灌巢(mound drench)也是和時、有效、快速防治紅火蟻的有效方法之一。本申請選擇7種不同類型的殺蟲劑對紅火蟻的觸殺毒力測定，明確不同藥劑對紅火蟻的毒力差異和不同等級紅火蟻(蟻后和工蟻)對藥劑的敏感度差異。

試驗材料

試蟲和材料

供試紅火蟻采自廣東省廣州增城和華南農業大學校園。參照Kuriachan等(2000)方法，用大塑料桶從田間采回紅火蟻蟻群，放置1-2d，待蟻群在桶內建立了新的群落后，將自來水緩慢滴入桶內，令紅火蟻從群落中自動上移、浮出。用40目的撈網將蟻群轉入盆口涂以爽身粉的塑料盆(7.0L)中，在室內(室溫25℃,RH 65％-80％)用人工飼料飼養一周后供試驗用(曾鑫年等,2006)。工蟻、兵蟻、有翅雄蟻、有翅雌蟻和蟻后和幼蟻的判斷標準參考曾玲等(2005)方法。

供試藥劑

藥劑

96％毒死蜱原粉Chlorpyrifos；

95％高效氯氰菊酯原藥Beta-cypermethrin；

91％辛硫磷乳油Phoxim；

96％毒死蜱Chlorpyrifos；

97％吡蟲啉Imidacloprid；

90％氟蟲腈Fipronil；

95％高效氯氟氰菊酯Ambda-cyhalothrin；

97.2％啶蟲咪Acetamiprid；

96.2％多殺菌素Spinosad；

93.7％阿維菌素Abamectin。

生化試劑

考馬斯亮藍G-250，Coomassie Brilliant Blue G250；

牛血清蛋白(BSA)，Bovine serum albumin；

分析試劑和有機溶劑

磷酸氫二鈉，Disodium hydrogen phospHate，分析純；

磷酸二氫鈉，Sodium dihydrogen phospHate，分析純；

氫氧化鈉，Sodium hydroxide，分析純；

醋酸，Acetate，分析純；

醋酸鈉，Sodium acetate，分析純；

碳酸鈉，Sodium carbonate，分析純；

碳酸氫鈉，Sodium blcarbonate，分析純；

鹽酸，Hydrochlori cacid，分析純；

丙酮，Acetone，分析純。

主要儀器設備

光照培養箱(LRH-300-GH)；

電子天平(BS2190S，精確度0.1mg)；

紫外分光光度計(UV-9100型)；

微量點滴儀(HMA 0807140)；

高速冷凍離心機(M IKRO 22R型)；

微量注射器(1-5μl)；

水浴鍋(HH.S21-4型)；

HOSHIZAKI制冰機(FM-120EE)；

KH-500超聲波清洗器。

試驗方法

觸殺毒力測定

藥膜法:將原藥溶解于適量丙酮中配成一系列濃度的藥劑，移取1ml經預實驗后的丙酮藥液至口徑、底徑、高分別為6.6、4.4和6.8cm的一次性塑料水杯中，水杯的涂藥面積為72.85cm²，轉動水杯使藥液均勻涂布于內壁，待丙酮揮發干后，倒置水杯，在杯口涂抹適量爽身粉，隨機挑選10頭蟻后或50頭工蟻于杯中。每個濃度設3次重復，空白對照為丙酮。觀察記錄24h和48h后的死亡蟻數，計算死亡率。按幾率值法和最小二乘法求取毒力回歸方程，計算致死中濃度(LC₅₀)值。

點滴法：將原藥溶解于適量丙酮中配成一系列濃度的藥劑，挑選蟻后、有翅雌蟻各10頭、工蟻30頭，用微量點滴儀移取1μl經預實驗后的上述濃度的藥液，點滴于試蟲前胸背板，置于一次性塑料水杯中，在杯口涂抹適量爽身粉，以小棉球供應10％的蔗糖水，每個濃度設3次重復，對照用丙酮點滴。觀察記錄24h死亡蟲數，按(2.1)和(2.2)分別計算死亡率(％)和校正死亡率(％)。結果統計用SPSS(軟件統計處理，求出毒力回歸方程和LC₅₀和LC₉₀。

統計分析方法

生物測定數據均采用數據統計軟件POLO進行分析，應用Microsoft EXCEL2010軟件整理和運用GraphPad InStat軟件對數據進行統計分析(one-way ANOVA and Tukey’s test,P<0.05)。

結果與分析

種殺蟲劑對紅火蟻工蟻觸殺毒力作用

室內條件下，采用藥膜法測定7種殺蟲劑對紅火蟻工蟻24h觸殺毒力試驗結果見表2-1。結果顯示，辛硫磷對工蟻的LC₅₀和LC₉₀分別為：0.15和0.36μg/ml，高效氯氟氰菊酯對工蟻的LC₅₀和LC₉₀分別為：0.24和0.38μg/ml；氟蟲腈對工蟻的LC₅₀和LC₉₀分別為：0.26和0.55μg/ml；毒死蜱對工蟻的LC₅₀和LC₉₀分別為：0.34和0.64μg/ml；吡蟲啉對工蟻的LC₅₀和LC₉₀分別為：663.46和877.43μg/ml；多殺菌素對工蟻的LC₅₀和LC₉₀分別為：1068.90和1351.11μg/ml。這表明，紅火蟻工蟻對大多殺蟲劑較敏感，所試7種藥劑中有5種殺蟲劑處理24h的LC₅₀值低于0.5μg/ml；多殺菌素觸殺毒力雖不和上述四種農藥，但相對較好，只有阿維菌素的觸殺毒力最弱。氟蟲腈，辛硫磷和毒死蜱也具有良好的觸毒殺活性。

表2-1. 7種殺蟲劑對紅火蟻工蟻的觸殺毒力(1.6mg/頭)

χ²(df)：卡方值(自由度)。

氟蟲腈對工蟻和蟻后的觸殺毒力

室內條件下，采用點滴法測定氟蟲腈紅火蟻工蟻與蟻后的24h觸殺毒力試驗結果(表2-2)可見，氟蟲腈對工蟻與蟻后的LC₅₀分別為5.12和15.168μg/ml。氟蟲腈對紅火蟻工蟻與蟻后個體對藥劑的敏感性差異很大，毒力可以相差2-3倍左右。

表2-2.氟蟲腈對紅火蟻工蟻和蟻后的觸殺毒力

χ²(df)：卡方值(自由度)。

小結

室內條件下，采用藥膜法測定7種殺蟲劑對紅火蟻工蟻24h觸殺毒力。結果顯示，紅火蟻工蟻對大多殺蟲劑較敏感，所試7種藥劑中有5種殺蟲劑處理24h的LC₅₀值低于0.5μg/ml；多殺菌素觸殺毒力雖不如上述四種農藥，但效果相對較好，只有阿維菌素的觸殺毒力最弱。氟蟲腈，辛硫磷和毒死蜱也具有良好的觸毒殺活性。同時采用點滴法測定氟蟲腈對紅火蟻工蟻與蟻后的24h觸殺毒力試驗，結果顯示，氟蟲腈對工蟻與蟻后的LC₅₀分別為4.604和15.168μg/ml。氟蟲腈對紅火蟻工蟻與蟻后個體對藥劑的敏感性差異很大，毒力可以相差2-3倍。蟻后較工蟻表現出一定的耐藥性。

實施例2

細胞色素P450(Cytochrome P450，簡稱P450)是多功能氧化酶系的核心部分，在整個酶系的氧化代謝中起著末端氧化的作用(邱立紅等,1999；Isin and Guengerich,2007)。P450能夠參與昆蟲體內多種外源物質和內源物質的代謝。細胞色素P450活性測定常用以下幾種方法：1.O-脫乙基法：通過7-乙氧基香豆素脫乙基酶(7-ethoxycoumarin O-deacthylase，ECOD)的活性表征細胞色素P450酶系的活性。7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)脫乙基作用后轉化成7-羥基香豆素(7-hydroxycoumarin)后熒光值可產生變化(激發波長368nm，發射波長456nm)，利用熒光分光光度計，測7-羥基香豆素生成量產生的熒光值的變化表征細胞色素P450的活性(Ullrich,1972；Aitio,1978)。2.O-脫甲基法：利用對硝基苯甲醚(p-nitroanisole)在細胞色素P450的O-脫甲基作用下生成對硝基苯酚(p-nitrophenol)，可用分光光度計(Fredand and Hodgson,1980)檢測堿性條件下p-nitrophenol在405nm處的吸收峰。艾國民建立用乙酸乙酯/正己烷作為終止劑和萃取劑，通過高效液相色譜梯度洗脫，分析對硝基苯酚的生成量，顯著提高了測試的靈敏度和分辨度(艾國民等,2009)；3.艾氏劑環氧化法(aldrinepoxidation,AE)：在細胞色素P450環氧化作用下艾氏劑生成狄氏劑，然后再通過氣相色譜檢測狄氏劑的量，從而測定細胞色素P450的活性(Hammock et al.,1975；Yu et al.,1982)。

本申請采用P450O-脫甲基法測定紅火蟻P450的酶活性，以對硝基苯甲醚(p-nitroanisole)為底物，探究紅火蟻工蟻與蟻后P450酶活性差異以和殺蟲劑對紅火蟻細胞色素P450O-脫甲基活性的誘導作用。明確了外源化合物對紅火蟻工蟻P450酶活性誘導的時間效應和劑量效應，從而為進一步研究紅火蟻的耐藥性機制和紅火蟻的科學治理提供理論依據。

材料與方法

供試蟲源和飼養

同實施例1。

化學試劑

NADPH(98％純度)、牛血清白蛋白(BSA)；Tris-base、二硫蘇糖醇(DTT，99％純度)；苯基硫脲(PTU)；苯基硫脲(PTU)；苯甲基磺酰氟(PMSF)；乙二胺四乙酸(EDTA)，7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)、7-羥基香豆素(7-hydroxycoumarin)；對硝基苯甲醚，p-nitroanisole；對硝基苯酚p-nitrophenol；考馬斯亮藍G-250；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、甘氨酸(Gly)、三氯乙酸(TCA)、甘油、85％磷酸、丙酮、NaH₂PO₄和Na₂HPO₄。

實驗儀器

5417C/R型臺式高速冷凍離心機(Eppendorf，Germany)；LS-55熒光分光光度計(Perkin Elmer，USA)；Bio-40紫外-可見分光光度儀(Perkin Elmer，USA)；Sartorius 2004M電子天平(Opton，13Germany)；SPH-100B型搖床；水浴鍋。

實驗方法

選取發育整齊的紅火蟻工蟻成蟲若干頭，分別用氟蟲腈LC₅₀(0.25μg/ml)、毒死蜱LC₅₀(0.34μg/ml)處理，用丙酮處理作為對照。放入涂有藥膜的一次性塑料杯中，置于環境條件為溫度26±2℃、相對濕度50％-60％、光周期16h：8h(L：D)的溫室內，分別在處理后24、48、72和96h取樣，保存于-80℃冰箱中用于測定P-NA O-脫甲基活性。

P450酶活性測定

酶液的制備

參照于彩虹等(2002)的方法并稍作修改，取紅火蟻若干，按60頭/ml比例加入一定量的0.1mol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(含1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、1mmol/L DTT和10％甘油)勻漿，4℃，10800rpm離心20min，用脫脂棉過濾上清液作為酶液，用于P-NA O-脫甲基活性和蛋白含量的測定。

P-NA O-脫甲基活性測定

參照Yu等(1992)并加以改進、反應：取375μl 2mM PNA、30μl 9.6mM NADPH，和345μl的粗酶源混合，34℃暴露在空氣中水浴30min，在酶標板中加入200μl的反應液，在405nm處測定吸光度。以對硝基苯酚量計算生成的結果，酶活力單位為：μmol/pro(mg)/30min。

對硝基苯酚標準曲線制作

1、10^-5mol/L對硝基苯酚溶液：精確稱取0.03478g對硝基苯酚溶于2.5ml的乙醇中，待用時再用乙醇稀釋10000倍即可。

2、0.5mol/L NaOH溶液：精確稱取0.1g NaOH完全溶解于5ml的蒸餾水中。

3、按0,20,40,80,120,160,200μl的標準將10^-5mol/L對硝基苯酚溶液分別加入到酶標板孔中，不足250μl，用0.5mol/L NaOH溶液補平。每個濃度至少重復3次。

4、在A405處用酶標儀測定其吸光度(OD值)，繪制標準曲線。

蛋白含量測定

參照Bradford(1976)的考馬斯亮藍G-250的方法，用牛血清白蛋白(BSA)制作蛋白質標準曲線。將試管分成7組，每組設3個重復，建立3ml的反應體系(如表3-1)。

表3-1.蛋白質標準曲線測定

Table 3-1.The method of protein standard curve

2.5ml G-250+0.5ml測定液液混勻，室溫放置5min，用紫外-可見分光光度儀測定595nm處吸光值。以OD值為橫坐標，BSA濃度為縱坐標做出蛋白質標準曲線。測定酶液蛋白含量時，將原酶液稀釋30-50倍，同樣采用3ml的反應體系，其中酶液0.5ml，G-250 2.5ml，室溫反應5min后測定595nm處吸光值，根據蛋白質標準曲線計算出酶液中的蛋白含量。

數據統計分析

根據比活力公式計算紅火蟻對硝基苯甲醚(p-nitroanisole)在細胞色素P450的O-脫甲基作用的活性：

比活力(μmol/min/mgPro.)＝(OD×V總/(T×Pro.×V酶)

其中，OD為反應產物對硝基苯酚(p-nitrophenol)(μmol/ml)在405nm處的吸光值；V總為反應總體積(ml)；T為反應時間(min)；Pro.為原酶液蛋白含量(mg/ml)；V為反應酶液體積(ml)。

結果與分析

蛋白質含量標準曲線

測定結果如圖1所示。牛血清蛋白含量(μg/ml)為自變量(X)，以OD₅₉₅值為因變量(Y)，擬合蛋白質含量標準曲線方程為：Y＝0.0067x+0.1154，R2＝0.9948，對標準曲線方程的回歸關系進行t檢驗,表現為差異顯著。

對硝基苯酚的標準曲線

測定結果如圖2所示。以對硝基苯酚的濃度值(nmol/L)作自變量(X)，OD₄₀₀值作因變量(Y)，擬合對硝基苯酚的標準曲線方程為：Y＝3.18×10^-2+1.41×10^-2X，R²＝0.9996，對標準曲線方程的回歸關系進行t檢驗，表現為差異顯著。

不同等級紅火蟻(蟻后和工蟻)細胞色素P450O-脫甲基酶活性

紅火蟻不同等級(蟻后和工蟻)細胞色素P450O-脫甲基酶測定結果見表3-2.，紅火蟻蟻后細胞色素P450O-脫甲基酶活性低于工蟻且差異顯著，其比活力分別為3.23和5.35μmol/mg/pro/30min，相差1.66倍。

表3-2.不同等級紅火蟻(蟻后和工蟻)細胞色素P450O-脫甲基酶活性測定

Table 3-2.The specific activities of cytochrome P450of different castes of S.invicta

注：表中數值為平均值±標準誤(μmol/mg/30min protein)，同列中不同小寫字母表示不同處理差異顯著(ANOVA,P＜0.05)，括號內數值為工蟻與蟻后組的比值.

Note:The results are shown as mean±S.E(μmol/mg/30min protein)；different lowercase letters in the same column mean significant difference(ANOVA,P＜0.05),data in bracket denote fold between workers/queens.

氟蟲腈和毒死蜱對紅火蟻P450活性誘導作用

采用藥膜法用氟蟲腈LC₅₀和毒死蜱LC₅₀分別處理紅火蟻工蟻，測定的細胞色素P450活性結果見表3-3.。紅火蟻工蟻P450活性結果顯示，24h時，氟蟲腈處理組和毒死蜱處理組P450活性顯著高于對照組，分別為對照組的1.97倍和1.71倍；48h時，兩處理組P450活性明顯達到最高值，分別為對照組的3.00倍和1.96倍；72h時，兩處理組P450活性均降低，毒死蜱處理組降低更為明顯，分別為對照組的2.43倍和1.27倍。96h時，兩處理組P450活性仍然高于對照組，分別為對照組的2.26倍和1.12倍，毒死蜱處理組P450活性基本與對照組相平。

表3-3.氟蟲腈LC₅₀(0.05μg/ml)和毒死蜱LC₅₀(0.15μg/ml)理后的紅火蟻(1.25mg/頭)P450活性

注：表中數值為平均值±標準誤(μmol/mg/30min protein)，同一時間點不同小寫字母表示不同處理差異顯著(ANOVA,P＜0.05)，括號內數值為同一時間點處理組與對照組的比值.

小結

紅火蟻不同等級(蟻后和工蟻)細胞色素P450O-脫甲基酶測定結果顯示，紅火蟻蟻后細胞色素P450O-脫甲基酶活性低于工蟻且差異顯著，其比活力分別為3.23μmol/mg/pro/30min和5.35μmol/mg/pro/30min，相差1.66倍。可能因為紅火蟻蟻后與工蟻功能的不同，蟻后是整個蟻巢的中心，負責調控蟻群種群數量，性別比例等，很少出去蟻巢外活動，而工蟻經常出去從事覓食等活動，很容易接觸到外源化合物而使解毒代謝酶含量升高。顯示了細胞色素P450在工蟻對藥物解毒代謝功能的重要性。

采用藥膜法用氟蟲腈LC₅₀和毒死蜱LC₅₀分別處理紅火蟻工蟻，測定的細胞色素P450活性顯示，24h時，氟蟲腈處理組和毒死蜱處理組P450活性顯著高于對照組，分別為對照組的1.97倍和1.71倍；48h時，兩處理組P450活性明顯達到最高值，分別為對照組的3.00倍和1.96倍；72h時，兩處理組P450活性均降低特別毒死蜱處理組明顯下降，分別為對照組的2.43倍和1.27倍。96h時，兩處理組P450活性仍然高于對照組，分別為對照組的2.26倍和1.12倍，毒死蜱處理組P450活性基本與對照組相平。從整體看，相對于毒死蜱，氟蟲腈對紅火蟻有較好的觸殺和誘導作用，且具有持久性。氟蟲腈是一種含氟吡唑類殺蟲劑，活性高、殺蟲譜廣，美國環境保護組織將氟蟲腈定為可代替有機磷類防治螞蟻的一種藥劑(U.S.EPA,2000)。同時本實驗室研究表明，氟蟲腈殺蟻餌劑對紅火蟻具有優良的胃毒作用，紅火蟻工蟻取食，當餌劑被紅火蟻帶進巢內后，通過工蟻在巢內的頻繁活動和交哺喂食行為，將藥劑傳遞到巢內的工蟻、幼蟻和蟻后，引起全巢紅火蟻中毒死亡，達到滅殺紅火蟻蟻巢的目的。

以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。