本發明涉及農藥風險評價方法，具體涉及一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法。

背景技術：

蜜蜂是農業生產中主要的授粉物種。蜜蜂授粉可減少農藥化肥的施用，適宜生態農業和綠色農業的發展；對維護農業生物多樣性、穩定性具有重要生態功能。有研究顯示：全球約87.5％的開花植物依靠昆蟲授粉，其中87種為主要糧食作物，占世界糧食總產量的35％，而蜜蜂約占授粉昆蟲總數的80％，無論是人工飼養還是野生存在，都在作物授粉方面發揮著巨大作用。同時蜜蜂授粉所產生的經濟效益也相當可觀，每年僅我國由蜜蜂傳花授粉帶來的經濟效益就高達150億元。因此，蜜蜂具有重大的生態和經濟價值。但蜜蜂對農藥敏感程度極高，濫用或誤用農藥都將破壞蜜蜂棲息地及其食物來源，從而對蜜蜂產生嚴重威脅。1990年至今，因農藥中毒導致蜜蜂死亡、蜂群數量驟減的現象遍及北美、歐洲、亞洲等許多國家，已成為全球普遍關注的環境污染與生物安全問題。

為保護生態系統健康，從源頭控制高風險性農藥對環境生物產生的潛在不良影響，我國環保部、農業部也逐漸將農藥對蜜蜂生物毒性與安全性評價列為農藥登記管理、農藥使用環境安全管理的重要內容之一，并制定了農藥對蜜蜂急性毒性試驗準則。但迄今為止，我國作為農藥生產和使用第一大國，并未建立完整的農藥對蜜蜂安全性風險評價體系。總體來看：我國農藥對蜜蜂生物安全性風險評價工作比較落后，表現在實驗方法上缺乏亞慢性、慢性試驗方法，評價體系缺乏立體多層次實驗。

技術實現要素：

本發明公開了一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性試驗的方法和藥劑對蜜蜂幼蟲NOEC/NOED值的毒性測定方法，完善了農藥對蜜蜂慢性毒性試驗評價體系。

本發明的實驗方案為：

一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，步驟為：

(1)試驗生物為1日齡的蜜蜂幼蟲，3～6日齡開始暴露染毒；以系列濃度組進行預備試驗；根據預備試驗確定的濃度范圍，正試驗設置不少于5個覆蓋EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的濃度組，同時設空白對照組，當使用溶劑時，增加設置溶劑對照組；

(2)正試驗結果觀察；于第4d～8d及第15d觀察并記錄幼蟲死亡數、其它異常情況，身體僵硬不動或輕微觸碰無反應或第15d未化蛹的幼蟲則判定為死亡，同時將死亡的幼蟲去除，第22d觀察并記錄蛹死亡數、羽化數及觀察到的異常情況；

(3)藥劑對蜜蜂幼蟲EC₅₀/ED₅₀或者NOEC/NOED值的測定；蜜蜂幼蟲毒性試驗以羽化率為主要評價指標，統計蜜蜂發育的幼蟲死亡率、蛹死亡率、羽化率，進行統計學分析計算EC₅₀/ED₅₀及置信限；采用方差分析對各個濃度處理組與對照組間進行差異顯著性分析，獲得供試物對蜜蜂羽化影響的NOEC/NOED。

不同時間觀察并記錄蜜蜂不同蟲態的死亡數、化蛹、羽化成蜂情況。計算幼蟲死亡率、蛹死亡率、羽化率，半效應濃度/半效應劑量(EC₅₀/ED₅₀)；將供試物處理組和空白對照組的羽化率進行差異顯著性分析，確定無可見效應濃度/無可見效應劑量(NOEC/NOED)。不可見效應濃度(NOEC)值用通過方差分析得出：若與空白試驗組沒有顯著性差異的最高濃度，即為NOEC值；或通過濃度-效應關系得出：與空白實驗組相比，根據實驗測試所得的濃度-效應關系，其影響程度低于空白的10％的濃度，即視為NOEC值。

所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，蜜蜂幼蟲獲得的方法為：

(1)首先，將蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王產卵器中，禁閉24h，待其產卵后釋放蜂王，產卵75h后用移蟲針將1日齡的幼蟲隨機轉移至溫度34℃～35℃的育王臺基中，每個臺基放入1只幼蟲，然后將移入了幼蟲的王臺基置于24或48孔細胞培養板；每個培養板含有來自3個種群的幼蟲；幼蟲在試驗條件下，用人工飼料飼養；

(2)在化蛹培養板中放入紙巾；將巾貼合孔的底部和邊緣，將蛹培養板和蓋子進行紫外滅菌15分鐘；當D6～D8蜜蜂幼蟲消耗完所有食物時，就將幼蟲從培養板轉移到化蛹培養板中；

(3)在幼蟲或預蛹轉至化蛹板之前，保持相對濕度95％±5％；預蛹轉至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前，保持相對濕度80％±5％，化蛹板放入孵化盒之后至試驗結束，保持相對濕度50％～80％；試驗期間將干燥器放置于蜜蜂幼蟲孵化器中，使干燥器溫度均勻保持在34℃～35℃，黑暗的條件下進行；蜜蜂幼蟲達到3日齡開始試驗。

優選的，步驟(2)中的紙巾為：1m×2cm的紙巾，可以使用Kimwipe紙巾。

優選的，步驟(1)移蟲前將培養板、移蟲針、人工育王臺基浸沒在70％酒精(V/V)至少30min進行殺菌后，晾干待用；移蟲時每個培養板≤20分鐘；每移8只幼蟲后使用酒精和水給移蟲工具滅菌；使用移液器向每個王臺基內供應食物，飼喂時避免接觸或浸沒幼蟲。

優選的，所述的幼蟲人工飼料的成分包括但不限于蜂皇漿、酵母提取物、果糖、葡萄糖；蜜蜂幼蟲使用的三種飼料的成分及重量份為：

飼料A為：酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿＝0.9:5.3:5.3:44.25:44.25；

飼料B為：酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿＝1.3:6.4:6.4:42.95:42.95；

飼料C：酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿＝2:9:9:30:50；

1日齡飼喂20μL飼料A，2日齡不進行飼喂，3日齡飼喂20μL飼料B、4日齡飼喂30μL飼料C、5日齡飼喂40μL飼料C、6日齡飼喂50μL飼料C。

優選的，飼料配置時需先將果糖、葡萄糖和酵母提取物完全溶解于無菌水后再與新鮮王漿混勻；混勻食物采用采用手動攪拌和渦旋振蕩的方法；飼料新鮮配制并保存在0～5℃的冰箱里；或提前制備，冷凍保存直至使用。

優選的，所述的暴露染毒的步驟為：每天用混有供試物的飼料飼喂蜜蜂幼蟲，3日齡飼喂20μL飼料B、4日齡飼喂30μL飼料C、5日齡飼喂40μL飼料C、6日齡飼喂50μL飼料C；使用水溶解的供試物，投喂的含毒飼料中受試溶液的量為≤10％；或使用有機溶劑溶解，投喂的含毒飼料中受試溶液的量≤2％。

優選的，暴露染毒過程中溫度為23-40℃，每24h內出現偏差次數≤1次。

優選的，預備試驗使用24孔細胞培養板，設置空白與溶劑對照組：每個濃度3個重復，每個重復12頭幼蟲。

優選的，正試驗為：根據預備試驗確定的濃度范圍，按幾何級差應≤3倍設置不少于5個覆蓋EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的濃度組；設空白對照組，當使用溶劑時，增加設置溶劑對照組，對照組及每一劑量組均設3個重復，每個重復16只幼蟲。

優選的，幼蟲的培養條件：試驗至少需準備兩個密閉干燥器和一個孵化器，一個干燥器用于幼蟲培養階段，另外一個干燥器用于預蛹和化蛹階段，使用時表面用10％漂白劑溶液進行清潔，待其表面完全干燥后方可進行試驗；飽和硫酸鉀溶液(160克的硫酸鉀溶解到1升水中)和飽和氯化鈉溶液(400克氯化鈉溶解到1升水中)溶液制備時，水溫需控制在45℃。將孵化箱設置到35℃，變化不超過0.5℃，將帶有溫濕度記錄儀的干燥皿放入孵化箱中，記錄試驗期間的溫濕度。

本發明的有益效果：

1、本發明建立了農藥對蜜蜂幼蟲毒性試驗方法為該領域的創新。試驗方法科學可行。

2、國內外研究尚少，且無具體指導準則，本發明屬于創新型評價方法。

3、探索農藥對蜜蜂幼蟲發育、化蛹以及羽化狀況產生的效應影響，為農藥對蜜蜂提供高階段的風險評估方法，同時完善農藥對蜜蜂整個世代影響的評估手段。

4、保護有益生物蜜蜂種群、保護生態環境。

5、試驗通過探索農藥對蜜蜂幼蟲發育、化蛹以及羽化產生的毒性影響，為農藥對蜜蜂提供高階段的風險評估方法，同時完善農藥對蜜蜂整個世代影響的評估手段，從而保護有益生物蜜蜂總群，保護生態環境。

附圖說明：

圖1：幼蟲D4-D8累積死亡率曲線；

圖2：幼蟲成蛹率；

圖3：羽化率。

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發明，但不用來限制本發明的發明范圍。該技術領域的技術工程師可根據上述發明的內容作出一些非本質性的改進和調整。

試驗材料與方法

1.1供試農藥

98％氟鈴脲原藥

1.2供試生物

本試驗使用的供試生物為意大利蜜蜂(Apis mellifera L)幼蟲，由北京依科世福科技有限公司室外人工馴養。

1.3幼蟲來源

試驗在蜂王產卵的時候進行，幼蟲來源于同一種群的意大利蜜蜂，蜂群應該飼喂充足、健康，無病無螨害。首先，蜂王被限制在有工蜂和空巢脾的幽王產卵器中，禁閉24h左右，檢查產卵量后釋放蜂王。

1.4幼蟲采集

在第一天(D1)，將一齡幼蟲從蜂脾轉移到實驗室的培養箱中(維持外界環境溫度不低于20℃)，隨后放置于干凈條件用于嫁接。由于幼蟲的不均一性，為了避免偏差，應選擇新孵化的還未形成“C”形的幼蟲。為了評估充足的LD₅₀范圍，根據蜜蜂急性毒性試驗結果，預實驗設置6個處理組，使用24孔培養板，每個處理組3個重復，每個重復取12只幼蟲；正式試驗設置8個處理組，使用48孔培養板，每個處理3個重復，每個重復取16只幼蟲。設置空白對照和溶劑對照。

1.4試劑

氯化鈉、硫酸鉀、濃硫酸、乙醇、丙酮、吐溫80、無菌水、二甲基甲酰胺

1.5試驗設備及器材

高壓滅菌鍋、24孔培養板、48孔培養板、干燥器、人工氣候箱、移蟲針、真空泵、幽王產卵器、移液器、天平、USB數碼電子顯微鏡。

1.6幼蟲食物

幼蟲食物所需的主要成分有四種：皇漿、酵母提取物、果糖、葡萄糖。幼蟲不同生長階段所需營養成分配比稍有不同，按幼蟲發育天數將其分為食物A、食物B和食物C(見表1)。食物需新鮮配制并保存在0-5℃的冰箱里(但不冷凍)。也可以提前制備，冷凍保存直至使用。

表1 不同年齡段幼蟲食物量和食物成分變化

注：D＝day天數

1.7培養條件

幼蟲培養在透明24/48孔聚苯乙烯培養板中，培養板事先進行紫外滅菌。這些培養板D1到D8期間置于含硫酸鉀飽和液或10％濃硫酸的干燥器中，以保證95％±5％的濕度；幼蟲化蛹于D8，置于含氯化鈉飽和液的干燥器中，以保證80％±5％的濕度。干燥器提前用75％的乙醇擦洗消毒。試驗期間將干燥器放置于人工氣候箱中，使干燥器溫度均勻保持在34到35℃，并且在試驗的整段時期內無較大偏差。

2試驗方法

試驗前3天(D-3),將蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王產卵器中,禁閉24h左右，檢查產卵量后在D-2釋放蜂王，并在蜂箱里培養幼蟲直至D-1。預試驗使用24孔培養板，設置空白與溶劑對照組：幼蟲12×3重復＝36幼蟲；6個濃度處理組(通過試驗初步設置范圍濃度分別為0.0001μg/幼蟲，0.0005μg/幼蟲，0.005μg/幼蟲，0.05μg/幼蟲，0.5μg/幼蟲，1.0μg/幼蟲)；正式試驗使用48孔培養板，設置空白與溶劑對照組：幼蟲16×3重復＝48幼蟲；8個濃度處理組(通過預實驗所得結果設置濃度分別為0.0005μg/幼蟲，0.001μg/幼蟲，0.002μg/幼蟲，0.004μg/幼蟲，0.008μg/幼蟲，0.016μg/幼蟲，0.032μg/幼蟲，0.064μg/幼蟲)：幼蟲16×3重復＝48幼蟲。測試環境為全黑暗，溫度控制在34℃～35℃。

試驗第一天(D1)，將新孵化的還未形成“C”形的一齡幼蟲從蜂脾轉移到實驗室的培養箱中(維持外界環境溫度不低于30℃)。移蟲在34到35℃的24/48孔培養板上進行，使用移液器向每個王臺基內供應食物。飼喂幼蟲時應避免接觸或浸沒其身體，食物順著王臺基壁放置在幼蟲的旁邊。試驗第2d(D2)只觀察不喂食。根據時間表，試驗第3d(D3)到第6d(D6)，分別飼喂含有不同濃度測試溶液的食物(D3為食物B，D4到D6為食物C)，根據食物C的配制比例，將不同濃度測試溶液溶入無菌水中，并在染毒前配制好食物C。根據幼蟲不同年齡段分施用不同食物量進行飼喂。每個處理組包括食物都需使用不同槍頭，避免污染，并記錄第2d(D2)施藥前食物剩余量。食物使用前應進行加熱。試驗第8d(D8)對幼蟲進行化蛹，將幼蟲轉移至帶有濾紙的培養板里并將培養板放置于適合蛹生長的干燥器中。試驗第15d(D15)觀察幼蟲成蛹情況并記錄。試驗第22d(D22)觀察并記錄羽化和未羽化的成蜂，D3第一次染毒開始后，在飼喂階段觀察記錄D3～D7,D8和D15的死亡率。對于不動的幼蟲或用嫁接工具接觸無反應的幼蟲被記錄為死亡，對于D15未轉化為蛹的幼蟲被記錄為死亡。D22觀察記錄羽化的成蜂、未羽化的蜂以及行為表現異常的蜂。最終計算成年蜂的羽化率(成年蜂的羽化率＝D22羽化的成蜂/D3開始施藥時幼蟲的總數)、成蛹率(成蛹率＝D15成蛹幼蟲數/D3開始施藥時幼蟲的總數)、幼蟲的死亡率(幼蟲的死亡率＝在D3-D8幼蟲期蜜蜂死亡數/開始施藥時D3幼蟲的總數)

3結果與分析

根據表2可知，在試驗濃度范圍內分別觀察D4～D7，D8，D15，D22天幼蟲的死亡情況以及蛹的羽化情況。

表2 試驗期間累計死亡情況

注：D＝day天數；CK₁代表空白對照；CK₂代表溶劑對照

表3 幼蟲成蛹和羽化情況

注：D＝day天數；CK1代表空白對照；CK2代表溶劑對照

3.1幼蟲死亡率

根據試驗連續喂藥4天140μL，觀察D4～D8的死亡數(圖1)。其D4-D7內幼蟲的各濃度的累積死亡率計算得：4.17％，0，4.17％，4.17％，4.17％，6.25％，10.42％，12.50％。對于幼蟲在喂食期間D8的NOEC估計值為0.004μg/幼蟲(具體通過SPSS分析與溶劑對照組對比得到)。在實驗所設濃度范圍內，觀察其濃度效應曲線(圖2)。

98％氟鈴脲原藥對蜜蜂幼蟲慢性毒性試驗每個濃度劑量處理組的累積死亡率曲線圖與兩組空白對照比較，可以看出0.0005μg/幼蟲，0.002μg/幼蟲，0.004μg/幼蟲，0.008μg/幼蟲劑量處理組與空白與溶劑對照試驗組的累計死亡率曲線圖相似，但是是否在統計學上具有顯著相關性需進一步由SPSS進行驗證。根據SPSS軟件處理可知，空白對照和溶劑對照的無顯著性差異(P>0.05)，故各濃度處理組與溶劑對照比較。用不同劑量處理組與溶劑試驗組做SPSS分析數據發現，根據結果可知，P在劑量為0.008μg/幼蟲處理濃度下為小于0.05(P＝0.016<0.05)，且濃度為0.004μg/幼蟲P值大于0.05與溶劑對照試驗組沒有顯著性差異且為最高濃度的一組，因此LOEC為0.008μg/幼蟲，NOEC估計值為0.004μg/幼蟲。

3.2成蛹率

D15觀察并記錄幼蟲的成蛹情況，并最終計算成蛹率。成蛹率＝D15成蛹數/D3開始染毒時幼蟲的總數。空白對照、溶劑對照以及各濃度梯度的蛹的羽化率分別為：75.00％，60.42％，60.42％，58.33％，60.42％，52.08％，47.92％，22.92％，12.50％，10.42％。溶劑與空白對照組的成蛹率超過60％且死亡數大致相同，空白對照組與溶劑對照組間經證明無顯著差異(P>0.05)，故各濃度組可與溶劑對照組比較差異是否顯著。在0.0005μg/幼蟲，0.001μg/幼蟲，0.002μg/幼蟲，0.004μg/幼蟲，0.008μg/幼蟲處理組與空白與溶劑對照試驗組的成蛹率相似，并且經過SPSS軟件計算可知其濃度P>0.05，證明其與溶劑對照組無顯著相關性，在濃度為0.016μg/幼蟲對幼蟲成蛹的過程產生影響效應，其結果可知P＝0.001<0.05證明其與溶劑對照顯著不相關，且濃度為0.008μg/幼蟲P值大于0.05與溶劑試驗組沒有顯著性差異且為最高濃度的一組，故成蛹階段的LOEC為0.016μg/幼蟲，NOEC估計值為0.008μg/幼蟲。

3.3羽化率

D22觀察并記錄蛹的羽化情況(見圖3)，記錄羽化的成蜂并最終計算羽化率。成年蜂的羽化率＝D22羽化的成蜂/D3開始施藥時幼蟲的總數。空白對照、溶劑對照以及各濃度梯度的蛹的羽化率分別為：64.58％，54.17％，56.25％，50.00％，52.08％，43.75％，37.50％，16.67％，6.25％，0。對照組的羽化率超過50％，空白對照組與溶劑對照組間經證明無顯著差異(P>0.05)，故各濃度組可于溶劑對照組比較差異是否顯著。在0.0005μg/幼蟲，0.001μg/幼蟲，0.002μg/幼蟲處理組與空白與溶劑對照試驗組的羽化率相似，并且經過SPSS軟件計算可知其濃度P>0.05，證明其與溶劑對照組無顯著相關性，在濃度為0.016μg/幼蟲對幼蟲成蛹的過程產生影響效應，其結果可知P＝0.001<0.05證明其與溶劑對照顯著不相關，且濃度為0.008μg/幼蟲P值大于0.05與溶劑試驗組沒有顯著性差異且為最高濃度的一組，故羽化階段的LOEC為0.016μg/幼蟲，NOEC估計值為0.008μg/幼蟲。