1.一種農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:步驟為:
(1)試驗生物為1日齡的蜜蜂幼蟲,3~6日齡開始暴露染毒;以系列濃度組進行預備試驗;根據預備試驗確定的濃度范圍,正試驗設置不少于5個覆蓋EC50/ED50和/或NOEC/NOED的濃度組,同時設空白對照組,當使用溶劑時,增加設置溶劑對照組;
(2)正試驗結果觀察:于第4d~8d及第15d觀察并記錄幼蟲死亡數、其它異常情況,身體僵硬不動或輕微觸碰無反應或第15d未化蛹的幼蟲則判定為死亡,同時將死亡的幼蟲去除,第22d觀察并記錄蛹死亡數、羽化數及觀察到的異常情況;
(3)藥劑對蜜蜂幼蟲EC50/ED50或者NOEC/NOED值的測定:蜜蜂幼蟲毒性試驗以羽化率為主要評價指標,統計蜜蜂發育的幼蟲死亡率、蛹死亡率、羽化率,進行統計學分析計算EC50/ED50及置信限;采用方差分析對各個濃度處理組與對照組間進行差異顯著性分析,獲得供試物對蜜蜂羽化影響的NOEC/NOED。
2.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:蜜蜂幼蟲獲得的方法為:
(1)首先,將蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王產卵器中,禁閉24h,待其產卵后釋放蜂王,產卵75h后用移蟲針將1日齡的幼蟲隨機轉移至溫度34℃~35℃的育王臺基中,每個臺基放入1只幼蟲,然后將移入了幼蟲的王臺基置于24或48孔細胞培養板;每個培養板含有來自3個種群的幼蟲;幼蟲在試驗條件下,用人工飼料飼養;
(2)在化蛹培養板中放入紙巾,將紙巾貼合孔的底部和邊緣,將蛹培養板和蓋子進行紫外滅菌15分鐘;當D6~D8蜜蜂幼蟲消耗完所有食物時,就將幼蟲從培養板轉移到化蛹培養板中;
(3)在幼蟲或預蛹轉至化蛹板之前,保持相對濕度95%±5%;預蛹轉至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前,保持相對濕度80%±5%,化蛹板放入孵化盒之后至試驗結束,保持相對濕度50%~80%;試驗期間將干燥器放置于蜜蜂幼蟲孵化器中,使干燥器溫度均勻保持在34℃~35℃,黑暗的條件下進行;蜜蜂幼蟲達到3日齡開始試驗。
3.如權利要求2所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:幼蟲人工飼料的成分包括但不限于蜂皇漿、酵母提取物、果糖、葡萄糖;蜜蜂幼蟲使用的三種飼料的成分及重量份為:
飼料A為:酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿=0.9:5.3:5.3:44.25:44.25;
飼料B為:酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿=1.3:6.4:6.4:42.95:42.95;
飼料C:酵母提取物:葡萄糖:果糖:無菌水:鮮蜂王漿=2:9:9:30:50;1日齡飼喂20μL飼料A,2日齡不進行飼喂,3日齡飼喂20μL飼料B、4日齡飼喂30μL飼料C、5日齡飼喂40μL飼料C、6日齡飼喂50μL飼料C。
4.如權利要求3所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:飼料配置時需先將果糖、葡萄糖和酵母提取物完全溶解于無菌水后再與新鮮王漿混勻;混勻食物采用采用手動攪拌和渦旋振蕩的方法;飼料新鮮配制并保存在0~5℃的冰箱里;或提前制備,冷凍保存直至使用。
5.如權利要求2所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:步驟(2)中的紙巾為:1m×2cm的紙巾。
6.如權利要求2所述的方法,其特征在于:步驟(1)移蟲前將培養板、移蟲針、人工育王臺基浸沒在70%酒精至少30min進行殺菌后,晾干待用;往每個培養板移蟲時間≤20分鐘;使用移液器向每個王臺基內供應食物。
7.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:所述的暴露染毒的步驟為:每天用混有供試物的飼料飼喂蜜蜂幼蟲,3日齡飼喂20μL飼料B、4日齡飼喂30μL飼料C、5日齡飼喂40μL飼料C、6日齡飼喂50μL飼料C;使用水溶解的供試物,投喂的含毒飼料中受試溶液的量為≤10%;或使用有機溶劑溶解,投喂的含毒飼料中受試溶液的量≤2%。
8.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:預備試驗使用細胞培養板,設置空白與溶劑對照組:每個濃度3個重復,每個重復12頭幼蟲。
9.如權利要求1所述的農藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法,其特征在于:正試驗為:根據預備試驗確定的濃度范圍,按幾何級差應≤3倍設置不少于5個覆蓋EC50/ED50和/或NOEC/NOED的濃度組;設空白對照組,當使用溶劑時,增加設置溶劑對照組,對照組及每一劑量組均設3個重復,每個重復16只幼蟲。
10.如權利要求1所述的方法,其特征在于:暴露染毒過程中溫度為23-40℃,每24h內出現偏差次數小于≤1次。