本發明涉及一種負載鋅摻雜氧化銅多刺抗菌材料及其制備方法和應用，屬于生物功能材料制備領域。

背景技術：

近年來，由于細菌和耐藥機制的多樣性，細菌感染仍然是威脅公眾健康的主要問題之一。其中大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）已經表現出顯著增加的抵抗現有抗生素類藥物的抗藥性。氧化石墨烯（GO）是一種具有強氧化性和高親水性的片層狀材料。因其具有較好的生物相容性、較大的比表面積、良好的電導率以及高化學和熱穩定性而被認為是極具前景的二維材料。同時，Fan等人研究報道稱基于氧化石墨烯的抑菌紙表現出對哺乳動物有最小的細胞毒性（W. Hu, C. Peng, W. Luo, D. Li and C. Fan, ACS nano, 2010, 4, 4317）。Elimelech等人提出氧化石墨烯鋒利的邊緣和較高的膜壓力（F. Perreault, S. Nejati and M. Elimelech, ACS nano, 2015, 9, 7226），細菌與之接觸時便會凋亡（V. T. Pham, V. K. Truong, M. D. Quinn, V. A. Baulin and E. P. Ivanova, ACS nano, 2015, 9, 8458）。盡管氧化石墨烯在抗菌方面表現出一定的潛力，但氧化石墨烯在應對耐多藥微生物時表現不足，單純氧化石墨烯的抑菌效果也不盡如人意。

在目前已知的諸多抗菌材料中，金屬氧化物，如氧化鎂、氧化鈦和氧化鈣等由于其價格合理和效果良好因而在臨床及保健品中已有所應用。但納米金屬氧化物抗菌劑在體內的一般作用機制是未知的，其中增強的金屬離子釋放、誘導的氧化應激、活性氧（ROS）的釋放、靜電相互作用等等正在研究中。同時有研究發現，摻雜金屬氧化物如鋅摻雜的氧化銅（Zn-CuO）由于其增加晶體結構的缺陷促進其高效產生活性氧并成為一種較有前景的高效抗菌劑。Gedanken等人研究表明新型鋅摻雜氧化銅納米復合材料對根除多重耐藥性細菌（Eradication of Multi-Drug Resistant Bacteria by a Novel Zn-doped CuO Nanocomposite，Small, 2013, 9, 4069-4076.）和抗生物膜、抗菌活性的抗變形鏈球菌有較好的效果（A Zn-Doped CuO Nanocomposite Shows Enhanced Antibiofilm and Antibacterial Activities Against Streptococcus Mutans Compared to Nanosized CuO ，Adv. Funct. Mater., 2014, 24, 1382-1390），從而證實了鋅摻雜氧化銅的高效抗菌性能。

在此，本專利提出一種抗菌性能顯著增強的氧化石墨烯負載的多刺鋅摻雜氧化銅納米復合材料（Zn-CuO@GO）的制備方法，通過超聲化學原位生成多刺顆粒負載于氧化石墨烯上，使得氧化石墨烯從原有二維轉變為三維立體結構，并保留了鋅摻雜氧化銅的多刺結構。同時，摻雜后的納米復合材料大大提升了對抗耐藥的細菌菌株的能力，材料可以通過多刺結構刺破細菌膜層，破壞膜層的滲透平衡并促進細胞質內脂質分子的破壞性泄漏從而造成細菌凋亡。通過多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒和氧化石墨烯納米片聯合抗菌作用，本材料能夠加速細菌細胞凋亡并在10 min內可以產生高達99%的滅菌效率。

技術實現要素：

針對現有技術中存在不足，本發明提供了一種制備氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的方法。本材料表面刺狀物可以刺破細菌膜層，同時氧化石墨烯的引入大大增加了材料的抗菌性能，促使細菌細胞質的泄漏，從而極大地提高抗菌效率。

本發明是通過以下技術手段實現上述技術目的的。

S1：將醋酸銅和醋酸鋅充分溶解于雙蒸餾水中，所述醋酸銅和醋酸鋅總濃度為0.01-0.02mol/L；

S2：向步驟S1中加入乙醇，獲得一定乙醇/水體積比的溶液；

S3：向步驟S2中加入一定量的氧化石墨烯，隨后超聲處理得到分散均勻的溶液；

S4：向步驟S3中緩慢滴入（28-30 %）氨水調節溶液的pH值至8，調節超聲波功率為500-750W，超聲反應40-60min，后經離心、雙蒸餾水和乙醇逐次洗滌、真空干燥后即可得到所述多刺納米復合材料。

進一步的，步驟S1所述醋酸銅和醋酸鋅的摩爾比為3:1。

進一步的，步驟S2中所述乙醇與雙蒸餾水的體積比為9:1。

進一步的，步驟S3中所述加入的氧化石墨烯與醋酸鋅的質量比為1：11-2。

本發明的有益效果：

本發明通過超聲化學在氧化石墨烯表面原位生成多刺顆粒，制備過程綠色環保，使得氧化石墨烯從原有二維轉變為三維立體結構，并保留了鋅摻雜氧化銅的多刺結構。相較于單一氧化石墨烯，摻雜后的納米復合材料大大提升了對抗耐藥的細菌菌株的能力，復合材料可以通過鋅摻雜氧化銅多刺結構和氧化石墨烯片狀邊緣刺破細菌膜層，破壞膜層的滲透平衡并促進細胞質內脂質分子的破壞性泄漏從而造成細菌凋亡。通過多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒和氧化石墨烯納米片復合抗菌作用，本材料能夠加速細菌細胞凋亡并在10 min內可以產生高達99%的滅菌效率。

附圖說明

圖1為醋酸鋅與氧化石墨烯質量比11：1（A、a）和5.5：1(B、b)時的透射電鏡圖及其局部放大圖；圖中A、B為透射電鏡圖，a、b為局部放大圖。

圖2為實施例1所制備的氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料（A）、氧化石墨烯（B）和鋅摻雜氧化銅多刺納米顆粒（C）的XRD圖。

圖3為實施例1所制備的氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的XPS圖。

圖4為未處理時大腸桿菌（A、a）和金黃色葡萄球菌(B、b)的掃描電鏡圖（A、B）及其局部放大圖 (a、b)。

圖5為實施例1所制備氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌（A、a）和金黃色葡萄球菌(B、b)作用后的掃描電鏡圖（A、B）及其局部放大圖(a、b)。

圖6為實施例1所制備氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的透射電鏡圖（TEM）。

具體實施方式

下面結合附圖以及具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于此。

上述技術方案中所述的氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的抗菌性能測試具體為：

實施例1：

一、氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的制備：

將0.15g醋酸銅和0.055g醋酸鋅充分溶解于10毫升雙蒸餾水。隨后加入90毫升乙醇，獲得 體積比9：1的乙醇/水的溶液。加入0.005 g氧化石墨烯，超聲波（20 kHz，750W）處理5分鐘后，緩慢滴入0.8毫升的氨水（28-30 %）調節反應pH至8。超聲反應1小時后，將獲得納米復合材料的離心，并用雙蒸餾水和乙醇逐次洗滌后真空干燥。

圖1為醋酸鋅與氧化石墨烯質量比11：1（A、a）和5.5：1(B、b)時的透射電鏡圖及其局部放大圖；圖中A、B為透射電鏡圖，B、b為局部放大圖。由圖A可知，制備的鋅摻雜氧化銅納米顆粒均勻生長在氧化石墨烯上且其表面分布有明顯的刺狀物。

圖2為實施例1所制備的氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料（A）、氧化石墨烯（B）和鋅摻雜氧化銅多刺納米顆粒（C）的XRD圖。從圖中可以看出氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料兼有氧化銅的和氧化鋅的晶格特征，表明復合成功。

圖3為氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的XPS圖。從圖中可以看出，與XRD數據一致，該多氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料同時兼有鋅元素和銅元素，進一步表明氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的成功形成及其結構的完整性。

二、氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的抗菌性能

（1）菌落計數

將大腸桿菌(購于ATCC 25922)或金黃色葡萄球菌(購于ATCC 29213)保持37 ℃置于營養液中培養，當菌落形成單位達到10⁸時離心收集，并用pH為6的0.85%氯化鈉溶液洗滌兩次。向細菌懸浮液中加入納米復合材料（1 mg/ mL）37℃ 攪拌反應至多3 h（200 轉每分鐘）。在不同時間段（0, 10min, 30min, 1h, 2h, and 3h）取出100 μL，用8倍生理鹽水稀釋后均勻涂布在預先制備好的LB-瓊脂平板上并且在37 ℃生長24 h，接著計算存活細菌的數量。其中初始細菌數量用N₀表示，存活細菌數量用N表示。

結果表明：氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料能夠加速細菌細胞溶解并在10 min內可以產生高達99%的滅菌效率。

表1中為本實施例1所述氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌落計數結果。

表1. 本實施例所制備材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌落計數結果

（2）氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的相互作用：

將多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒與大腸桿菌或金黃色葡萄球菌一起培養30min后，通過4%多聚甲醛溶液將細菌固定（30 min，37 ℃）。隨后通過梯度脫水（30%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%乙醇各10min），將細菌樣本滴在銅箔上用掃描電鏡觀察形態。

結果表明：細菌與氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料接觸后細菌膜完整性被破壞，且多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒可以有效陷入細菌膜層中造成細胞質的泄漏和隨后細菌的凋亡。

圖4為未處理時大腸桿菌（A、a）和金黃色葡萄球菌(B、b)的掃描電鏡圖（A、B）及其局部放大圖 (a、b)。

圖5為實施例1所制備氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌（A、a）和金黃色葡萄球菌(B、b)作用后的掃描電鏡圖（A、B）及其局部放大圖(a、b)。由圖A可知，納米復合材料可以有效刺入并陷入大腸桿菌膜層中，從而達到迅速滅菌的效果。由圖B可知，即使金黃色葡萄球菌有兩層膜層，該納米復合材料依然可以刺入細胞膜并造成細菌的凋亡。

圖6為氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的透射電鏡圖（TEM）。與掃描電鏡結果一致，該納米復合材料可以有效地將其表面的刺狀物刺入細菌膜層，破壞細菌膜，造成細胞質的泄漏和細菌的凋亡。

實施例2：

一、氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的制備：

將0.15g醋酸銅和0.055g醋酸鋅充分溶解于10毫升雙蒸餾水。隨后加入90毫升乙醇，獲得 體積比9 ：1的乙醇/水的溶液。加入0.01 g氧化石墨烯，超聲波（20 kHz，600W）處理5分鐘后，緩慢滴入0.8毫升的氨水（28-30 %）調節反應pH至8。超聲反應50分鐘后，將獲得納米復合材料的離心，并用雙蒸餾水和乙醇逐次洗滌后真空干燥。

二、氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的抗菌性能

（1）菌落計數

將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌保持37 ℃置于營養液中培養，當菌落形成單位達到10⁸時離心收集，并用pH為6的0.85%氯化鈉溶液洗滌兩次。向細菌懸浮液中加入納米復合材料（1 mg/ mL）37℃ 攪拌反應至多3 h（200 轉每分鐘）。在不同時間段（0, 10min, 30min, 1h, 2h, and 3h）取出100 μL，用8倍生理鹽水稀釋后均勻涂布在預先制備好的LB-瓊脂平板上并且在37 ℃生長24 h，接著計算存活細菌的數量。其中初始細菌數量用N₀表示，存活細菌數量用N表示。

結果表明：氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料能夠加速細菌細胞溶解并在30 min內可以產生高達99%的滅菌效率。

表2中為本實施例2所述氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌落計數結果。

表2. 本實施例所制備材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌落計數結果

（2）氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的相互作用：

將多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒與大腸桿菌或金黃色葡萄球菌一起培養30min后，通過4%多聚甲醛溶液將細菌固定（30 min，37 ℃）。隨后通過梯度脫水（30%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%乙醇各10min），將細菌樣本滴在銅箔上用掃描電鏡觀察形態。

結果表明：細菌與氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料接觸后細菌膜完整性被破壞，且多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒可以有效陷入細菌膜層中造成細胞質的泄漏和隨后細菌的凋亡。

實施例3：

一、氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的制備：

將0.15g醋酸銅和0.055g醋酸鋅充分溶解于10毫升雙蒸餾水。隨后加入90毫升乙醇，獲得 體積比9:1的乙醇/水的溶液。加入0.02 g氧化石墨烯，超聲波（20 kHz，500W）處理5分鐘后，緩慢滴入0.8毫升的氨水（28-30 %）調節反應pH至8。超聲反應40分鐘后，將獲得納米復合材料的離心，并用雙蒸餾水和乙醇逐次洗滌后真空干燥。

二、氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的抗菌性能

（1）菌落計數

將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌保持37 ℃置于營養液中培養，當菌落形成單位達到10⁸時離心收集，并用pH為6的0.85%氯化鈉溶液洗滌兩次。向細菌懸浮液中加入納米復合材料（1 mg/ mL）37℃ 攪拌反應至多3 h（200 轉每分鐘）。在不同時間段（0, 10min, 30min, 1h, 2h, and 3h）取出100 μL，用8倍生理鹽水稀釋后均勻涂布在預先制備好的LB-瓊脂平板上并且在37 ℃生長24 h，接著計算存活細菌的數量。其中初始細菌數量用N₀表示，存活細菌數量用N表示。

結果表明：氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料能夠加速細菌細胞溶解并在60 min內可以產生高達99%的滅菌效率。

表3中為本實施例3所述氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌落計數結果。

表3. 本實施例所制備材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后的菌落計數結果

（2）氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料的相互作用：

將多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒與大腸桿菌或金黃色葡萄球菌一起培養30min后，通過4%多聚甲醛溶液將細菌固定（30 min，37 ℃）。隨后通過梯度脫水（30%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%乙醇各10min），將細菌樣本滴在銅箔上用掃描電鏡觀察形態。

結果表明：細菌與氧化石墨烯負載鋅摻雜氧化銅多刺納米復合材料接觸后細菌膜完整性被破壞，且多刺鋅摻雜氧化銅納米顆粒可以有效陷入細菌膜層中造成細胞質的泄漏和隨后細菌的凋亡。