本發明涉及一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用，屬于林業病蟲害防治技術領域。

背景技術：
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松材線蟲病，又稱松萎蔫病(Pine wilt disease，PWD)，是一種極具毀滅性的松樹病害,松樹一經感染，蔓延迅速，涉及數十種松屬植物，世界多個國家存在疫情。我國內地于1982年在南京中山陵園風景區首次發現松材線蟲病，現已擴展至江蘇、安徽、浙江、福建、江西、山東、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、重慶、四川、貴州、云南、陜西等16個地區，蔓延迅速，發生面積不斷擴大，危害程度不斷加重，對我國的松樹資源、自然景觀和生態環境構成了嚴重威脅。

松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是松材線蟲病主要的病原，松材線蟲的防控對于控制松材線蟲病至關重要。目前防控松材線蟲最直接、有效的殺線蟲劑主要是廣譜性合成藥劑，線蟲易產生耐藥性，且存在高毒、高殘留、污染環境、對非靶標有益生物構成威脅等缺陷，這使得生態友好的天然殺線劑的開發顯得尤為迫切。

自然界植物資源豐富，植物源殺線劑近些年一直是松材線蟲病研究的熱點。獨活是傘形科植物重齒毛當歸(Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干燥根，是我國的傳統中草藥，湖北、四川、陜西為主要栽培地，現有多處有大規模種植基地，來源豐富。獨活可用于風寒濕痹、腰膝疼痛、少陰伏風頭痛、四肢麻痹等病癥的治療，我們在對獨活生物活性成分的研究過程中發現，一種提取物具有很強殺的松材線蟲活性。國內外還未見有關于獨活提取物對松材線蟲有殺滅活性的報道。

本發明首次公布了獨活提取物在殺滅松材線蟲中的應用，以期為新型天然植物源松材線蟲防治藥物的開發奠定一定的基礎。

技術實現要素：
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本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用。獨活提取物具有強烈的殺松材線蟲的活性，安全低毒，提取方法簡單，成本低廉，其中的主要殺松材線蟲活性成分確定，可為仿生合成獲得更高活性的天然衍生物提供化學結構模型。

為了實現上述發明目的，本發明以粉碎的獨活干粉為原料，經溶劑浸提、減壓濃縮、有機溶劑萃取等方法得到一種獨活的提取物，在1mg/mL濃度下能有效殺滅松材線蟲。本發明方法按照如下步驟操作：

第一步，取干燥的獨活于植物粉碎機中粉碎得獨活干粉，加入無水乙醇室溫下超聲波震蕩輔助避光浸提48小時，其中，獨活干粉與乙醇料液比為50:1(g/L)，然后真空過濾去渣，得乙醇提取液，重復提取一次，合并提取液；

第二步，提取液采用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮得棕色乙醇粗提物；

第三步，乙醇粗提物經體積比為1：1的乙酸乙酯-水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相；

第四步，減壓蒸餾，獲得具有強殺松材線蟲活性的獨活提取物。

取以上所得獨活提取物適量，采用5％的二甲基亞砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)溶解，配制成濃度為1mg/mL的溶液，取50μL，加入到24孔板相應的孔中，再加入50μL線蟲懸浮液，混勻，以5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)為對照，置于26℃培養箱中避光培養，分別于24小時,48小時,72小時后取出，在體式顯微鏡下觀察線蟲存亡情況(線蟲僵直并以解剖針觸動無反應確定為死亡狀態)，根據如下公式計算各處理線蟲的校正死亡率：

結果表明這種獨活提取物在1mg/mL濃度下72小時后對松材線蟲的校正死亡率達95.27％。

以上得到的具有殺松材線蟲活性的獨活提取物進行硅膠柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫(石油醚：乙酸乙酯體積比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯)，洗脫組分經硅膠薄層層析(GF₂₅₄)檢測，合并相同組分，得到10個組分：Fr.1-Fr.10，經殺線活性測試確定F5和F6為高活性組分(1mg/mL，72小時校正死亡率>50％)；對兩組分進一步分離純化，F5組分再進行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)洗脫，得到兩個組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結晶得香豆素類化合物蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯；F6組分經再次硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)洗脫，得到兩組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結晶得香豆素類化合物佛手柑內酯和花椒毒素。

蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯、花椒毒素這4種香豆素類化合物，化學結構式分別為：

蛇床子素的特征常數為：無色到白色針狀晶體(石油醚-乙酸乙酯)，EIMS(m/z):244[M·]⁺,¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ6.26(1H，d，H-3)，7.63(1H，d，H-4)，7.29(1H，t，H-5)，6.85(1H，d，H-6)，3.94(3H，s，OCH3)，5.24(1H，m，H-2，)，3.56(2H，d，H-1’),1.84(3H，s，H-4’)，1.67(3H，s，H-5’)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ160.30(C-2)，113.08(C-3)，143.68(C-4)，126.18(C-5)，107.40(C-6)，161.32(C-7)，107.40(C-8)，152.93(C-9)，118.14(C-10)，21.97(C-1’)，121.1(C-2’)，132.64(C-3’)，25.76(C-4’)，17.93(C-5’)，56.08(OCH₃)。

二氫歐山芹醇當歸酸酯的特征常數為：白色晶體(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):328[M·]⁺；¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ6.23(1H，d,H-3)，7.65(1H，d，H-4)，7.28(1H，d，H-5)，6.76(1H，d，H-6)，5.14(1H，dd，H-2’)，3.40(2H，t，H-3’)，1.66(3H，s，H-5’)，1.60(3H，s，H-6’)，5.99(1H，dd,H-8’)，1.69(3H，s，H-10’),1.90(3H，dd,H-11)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ161.00(C-2)，112.23(C-3)，143.95(C-4)，128.82(C-5)，106.66(C-6)，164.05(C-7)，112.23(C-8)，151.34(C-9)，113.57(C-10)，89.30(C-2’)，27.67(C-3’)，82.07(C-4’)，21.25(C-5’)，22.36(C-6’)，167.12(C-7’)，128.74(C-8’)，137.53(C-9’)，15.59(C-10’)，20.5(C-11’)。

佛手柑內酯的特征常數為：白色微針狀晶體(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):216[M·]⁺,¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ4.27(3H,s,OCH₃),6.27(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),7.03(1H,d,J＝2.4Hz,H-3’),7.13(1H,s,H-8),7.60(1H,d,J＝2.4Hz,H-2’),8.15(1H,d,J＝9.8Hz,H-4).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ60.01(C-OCH₃),93.90(C-8),105.09(C-3’),106.43(C-10),112.58(C-3),112.72(C-6),139.39(C-4),144.88(C-2’),149.50(C-5),152.73(C-9),158.31(C-7),161.4(C-2)。

花椒毒素的特征常數為：無色到白色針晶(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):216[M·]⁺,¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ6.39(1H,d,H-3)，7.78(1H,d,H-4)，7.37(1H，s，H-5)，4.32(3H,s,OCH₃)，6.84(1H,d,H-2’)，7.71(1H,d,H-3’)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ160.41(C-2)，114.84(C-3)，144.27(C-4)，112.91(C-5)，126.16(C-6)，147.81(C-7)，132.92(C-8)，143.13(C-9)，116.58(C-10)，61.35(OCH₃)，146.65(C-2’)，106.74(C-3’)。

將從獨活提取物中分離得到的4種香豆素類化合物蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯、花椒毒素分別采用5％的二甲基亞砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)配成200-1000μM的梯度濃度溶液，按照以上獨活提取物的殺松材線蟲活性測試方法進行活性測試，獲得各試液對松材線蟲72小時的校正死亡率，通過SPSS 17.0數據處理軟件進行統計分析，結果顯示蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯和花椒毒素72小時內對松材線蟲的半致死濃度LC₅₀分別為：489.17μM、406.74μM、430.08μM和435.66μM，都具有明顯的殺松材線蟲的活性。

本發明操作方法簡單，原料來源便捷，成本低廉，高效低毒，安全環保，獨活提取物在控制松材線蟲病方面具有開發潛力，可應用于殺松材線蟲的天然制劑。

具體實施方式：

下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述。

實施例1、殺滅松材線蟲的獨活提取物的制備

將干燥的獨活50g于植物粉碎機中粉碎，加入無水乙醇1L室溫下超聲波振蕩輔助避光浸提48小時，真空過濾去渣，得乙醇提取液，重復提取一次，合并提取液，提取液采用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮得棕色乙醇粗提物6.3g；乙醇粗提物經乙酸乙酯(1L)和蒸餾水(1L)分液萃取3次，乙酸乙酯相合并后減壓濃縮至約2.5g，得獨活的乙酸乙酯提取物。

實施例2、獨活提取物的殺松材線蟲活性測定

將獨活的乙酸乙酯提取物采用5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)溶解，配制成濃度為1mg/mL的溶液，取50μL加入到24孔板相應的孔中，再分別加入50μL線蟲懸浮液(約2條/μL)，混勻，以5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)為對照，每處理4個重復。置于26℃培養箱中避光培養，分別于24小時,48小時,72小時后取出，在體式顯微鏡下觀察線蟲存亡情況(線蟲僵直并以解剖針觸動無反應確定為死亡狀態)根據如下公式計算各處理線蟲的校正死亡率：

結果顯示，獨活提取物在1mg/mL濃度下72小時后對松材線蟲的校正死亡率達95.27％，具有強殺松材線蟲活性。

實施例3、獨活提取物中殺松材線蟲活性成分的分離

將獨活的乙酸乙酯萃取物2.5g進行硅膠柱層析(200-300目，200g)，采用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫(石油醚：乙酸乙酯體積比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯)，洗脫組分經硅膠薄層層析(GF₂₅₄)檢測，合并相同，得到10個組分：Fr.1-Fr.10，經殺線活性測試確定F5和F6為高活性組分(1mg/mL，72小時校正死亡率>50％),對兩組分進一步分離純化；F5組分再進行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)洗脫，得到兩個組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結晶得香豆素類化合物蛇床子素(73mg)和二氫歐山芹醇當歸酸酯(11mg)；F6組分經再次硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)洗脫，得到兩組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結晶得香豆素類化合物佛手柑內酯(7mg)和花椒毒素(3mg)。

實施例4、從獨活提取物中分離得到的4種香豆素類化合物殺松材線蟲活性測試

將4種從獨活的乙酸乙酯萃取物中分離得到的香豆素類化合物蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯及花椒毒素分別采用5％的二甲基亞砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)配成200-1000μM的梯度濃度溶液，按照以上獨活提取物的殺松材線蟲活性測試方法進行活性測試，獲得各試液對松材線蟲72小時的校正死亡率，通過SPSS 17.0數據處理軟件進行統計分析。

結果顯示，蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯和花椒毒素對松材線蟲72小時的半致死濃度LC₅₀分別為：489.17μM、406.74μM、430.08μM和435.66μM。