本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及苗藥黑骨藤的組培快繁方法。

背景技術：

苗藥黑骨藤(Periploca forrestil Schltr)，又名黑龍骨、滇杠柳等，為蘿藦科杠柳屬藤狀灌木，為苗族民間廣泛應用于治療閉合性軟組織損傷、風濕與類風濕等疾病的民族藥，其富含C21甾類、強心苷類、萜類等物質。黑骨藤作為一種苗藥，其歷史悠久，早在西漢劉向的《世說新語說苑辨物》中便有：“吾聞古之為醫者，曰苗父，醫道精純，方劑獨特，為世人稱道”的記載，清代《馬關縣志風俗篇》中就有“苗人良藥接骨祛風，其效如神”的描述。由于苗族人經常性含服黑骨藤，因此苗族人不易患風濕類疾病。目前已開發出黑骨藤追風活絡膠囊、黑骨藤伸筋透骨液等治療風濕類疾病中成藥。

鑒于目前國內對黑骨藤的組織培養相關研究未見有報道，本發明選擇黑骨藤帶節莖段為外植體，經誘導、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了苗藥黑骨藤的組織培養技術體系。本發明具有技術性強、成本低廉、成苗快等特點，可直接用于黑骨藤種苗的工廠化生產，對于促進苗藥黑骨藤的資源開發利用具有重要的現實意義。

目前，國內外尚未有黑骨藤組織培養技術的報道，也未有黑骨藤組培快繁專利的申請。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種苗藥黑骨藤的組培快繁方法，本發明選擇黑骨藤帶節莖段為外植體，經誘導、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了苗藥黑骨藤的組織培養技術體系，從而實現了本發明的目的。

本發明提供的技術方案為：一種苗藥黑骨藤的組培快繁方法，包括依次進行的如下步驟：獲取黑骨藤的外植體、外植體誘導、不定芽的增殖培養、不定芽的生根培養、試管苗移栽；

所述的外植體誘導的誘導培養基包括：MS培養基、3.0～5.0mg/L KT、1.5～2.0mg/L6-BA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.5～1.0g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的外植體誘導的方法為：將黑骨藤外植體經清洗消毒處理后切成1.5～2.5cm左右的帶節藤莖并接種到誘導培養基中，置于25～28℃進行全暗培養30～35天即可誘導形成不定芽。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，不定芽的增殖培養所用的增殖培養基包括：MS培養基、2.0～3.0mg/L KT、0.5～1.0mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.1～0.5g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的不定芽的增殖培養的方法具體為：將經過外植體誘導得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養基中培養25～30天即可實現不定芽的增殖。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，不定芽的生根培養所用的生根培養基包括：1/2MS培養基、1.0～2.0mg/L GGR、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L瓊脂、0.1～0.3g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的不定芽的生根培養的方法為：從經過增殖培養得到的不定芽的基部切取長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養基中培養25～30天即能實現試管苗的生根。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的試管苗移栽的方法具體為：將經過生根培養得到的生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1～3天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質中栽培成苗即得種苗。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的外植體誘導、不定芽的增殖培養的培養條件均為：培養溫度為25～28℃，光照強度為2000～3000lx，光照時間為10～12小時/天。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，獲取獲取黑骨藤的外植體的具體方法為：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實的帶節藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理。

有益效果：

本發明利用植物組織培養技術建立了苗藥黑骨藤的組織培養技術體系，本發明具有技術性強、成本低廉、成苗快等特點，其成活率達到95％以上，可直接用于黑骨藤種苗的工廠化生產，對于促進苗藥黑骨藤的資源開發利用具有重要的現實意義。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。

實施例一

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實的帶節藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)外植體誘導：當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒15秒鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節藤莖并接種到誘導培養基中，置于25℃進行全暗培養30天即可誘導形成不定芽，誘導率為93.1％，污染率低于10％。所述的誘導培養基為：MS培養基+5.0mg/L KT+2.0mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.4。

(3)不定芽增殖：將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養基中培養25天即可實現不定芽的增殖，增殖系數達到6倍。所述的增殖培養基為：MS培養基+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4。

(4)生根培養：從基部切取步驟(3)增殖得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養基中培養25天即能實現試管苗的生根，生根率達到93％以上。所述的生根培養基為：1/2MS培養基+2.0mg/L GGR(生根粉)+1.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達到95％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養條件為：培養溫度為25℃，光照強度為2000lx，光照時間為10小時/天。

實施例二

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實的帶節藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)外植體誘導：當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒17秒鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒18分鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節藤莖并接種到誘導培養基中，置于27℃進行全暗培養33天即可誘導形成不定芽，誘導率為90％，污染率低于8％。所述的誘導培養基為：MS培養基+4.0mg/L KT+1.7mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.8g/L活性炭，pH為5.6。

(3)不定芽增殖：將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養基中培養28天即可實現不定芽的增殖，增殖系數達到5.3倍。所述的增殖培養基為：MS培養基+2.5mg/L KT+0.8mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.6。

(4)生根培養：從基部切取步驟(3)增殖得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養基中培養27天即能實現試管苗的生根，生根率為91.5％。所述的生根培養基為：1/2MS培養基+1.5mg/L GGR(生根粉)+0.7mg/L NAA+18g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.2g/L活性炭，pH為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為96.7％。

上述步驟(3)～(4)的培養條件為：培養溫度為26℃，光照強度為2300lx，光照時間為11小時/天。

實施例三

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實的帶節藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)外植體誘導：當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒20秒鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節藤莖并接種到誘導培養基中，置于28℃進行全暗培養35天即可誘導形成不定芽，誘導率87.3％，污染率低于3％。所述的誘導培養基為：MS培養基+3.0mg/L KT+1.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.5～1.0g/L活性炭，pH為5.8。

(3)不定芽增殖：將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養基中培養30天即可實現不定芽的增殖，增殖系數達到4倍。所述的增殖培養基為：MS培養基+2.0mg/L KT+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.8。

(4)生根培養：從基部切取步驟(3)增殖得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養基中培養30天即能實現試管苗的生根，生根率達到90％以上。所述的生根培養基為：1/2MS培養基+1.5mg/L GGR(生根粉)+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達到95％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養條件為：培養溫度為28℃，光照強度為2500lx，光照時間為12小時/天。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。