本發(fā)明涉及鱟試劑廢料再提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從鱟試劑生產(chǎn)廢料中提取抑菌組合物的方法。
背景技術(shù)：
鱟，又稱馬蹄蟹，是一種生活在海洋中的大型底棲節(jié)肢動(dòng)物,從早古生代的奧陶紀(jì)出現(xiàn)至今已有4億多年的歷史,是動(dòng)物界具有獨(dú)特進(jìn)化地位的“活化石”之一。鱟是無脊椎動(dòng)物血液學(xué)研究的絕好材料,也是目前鱟資源開發(fā)利用和鱟試劑研制的主要原材料,一直受到日、美等國學(xué)者的高度重視。隨著對(duì)鱟血淋巴的免疫功能研究以及和其他無脊椎動(dòng)物血淋巴的免疫學(xué)比較研究,尤其是從鱟血淋巴中分離出許多具有抗菌、抗病毒的活性物質(zhì)。總體而言，鱟作為一種具有巨大醫(yī)藥開發(fā)潛力的重要資源，為世界各國高技術(shù)產(chǎn)業(yè)所矚目。
目前鱟的主要用途是制備鱟試劑。鱟血細(xì)胞中的顆粒細(xì)胞中含有能與內(nèi)毒素起凝集作用的酶系統(tǒng)。根據(jù)此原理，世界各國研究人員經(jīng)不懈努力，開發(fā)出了用于藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的鱟試劑。同時(shí)，鱟試劑還能被β-葡聚糖激活，而1-3-β-d葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的特有成分，從而鱟試劑亦被開發(fā)應(yīng)用于檢測(cè)深度真菌感染。但鱟試劑的提取過程中僅利用到了鱟血細(xì)胞，剩余的其他成分并未得到有效開發(fā)利用。鱟試劑的提取過程由各生產(chǎn)廠家依情況而定，大致工藝包括：
a鱟細(xì)胞裂解液的配制：裂解液為tris-hcl,nacl緩沖液。其中，所述緩沖液為ph7-8，nacl，tris-hcl可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)，一般為50mmol/lnacl，20mmol/ltris-hcl；
b鱟細(xì)胞的裂解乳化：取全血離心后的鱟細(xì)胞，按1:5-1:8.5的比例加入鱟細(xì)胞裂解液，使用高速勻漿機(jī)勻漿5-20分鐘，即得鱟細(xì)胞裂解乳化物。
c鱟細(xì)胞裂解液分離提純：將上述乳化物低溫離心25-30分鐘，取上清液，分裝備用，即為鱟細(xì)胞裂解液。向裂解液中以1:1-1:2的比例加入氯仿溶液，低溫?cái)嚢桦x心后，仔細(xì)取出上清液備用。
d制劑：取c步驟中最終上清液，各生產(chǎn)廠家根據(jù)自身情況，向其中添加多肽顯色基質(zhì)，低溫?cái)嚢璺盅b后，真空冷凍干燥后即得鱟試劑。
另外，由上述鱟試劑的提取過程，也可看出，作為鱟全血的另一組成部分，鱟血漿并未得到有效利用，而是直接被廢棄。
抗菌肽是動(dòng)植物體內(nèi)組成性表達(dá)或誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然免疫物質(zhì),是機(jī)體先天性免疫的重要組成部分。抗菌肽對(duì)病原微生物具有選擇性毒性，殺菌快速，廣譜抗菌且微生物不易產(chǎn)生抗性。目前人們已從鱟血淋巴中分離得到多種抗菌肽，即鱟素肽，對(duì)于大批量鱟素肽的醫(yī)用提取，其提取步驟與鱟試劑的提取過程有所不同，鱟素肽即可以從鱟細(xì)胞中獲得，也可以從鱟試劑提取的廢料中獲得。提取步驟主要包括：
a.將鱟血細(xì)胞或鱟試劑提取廢料懸浮于tris-hcl,nacl緩沖液勻漿。
b.離心30min，棄上清液，所收集的沉淀用同一緩沖液洗兩次；
c.酸解：洗滌后的沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液勻漿，勻漿離心收集上清液，沉淀用酸液重提收集上清反復(fù)3次，3次收集的上清液即為鱟血細(xì)胞酸抽提液；
d.提純：鱟素肽的提純方法不一，對(duì)上述酸抽提液，或經(jīng)凝膠過濾后洗脫獲得單一鱟素肽，或經(jīng)熱變性后超濾獲得高純鱟素肽。
若由鱟細(xì)胞中直接提取鱟素肽，與從鱟試劑廢料中提取鱟素肽相比，最終獲得的鱟素肽含量較高，但是由于與上述鱟試劑提取中的原料(鱟細(xì)胞)沖突，導(dǎo)致提取本身的成本昂貴。若直接從鱟試劑廢料中提取鱟素肽，則鱟素肽含量較低，且后續(xù)純化中步驟繁瑣，工藝成本較高，所以對(duì)于醫(yī)用鱟素肽來說，如何簡(jiǎn)易的獲取鱟素肽，仍舊是一大難點(diǎn)。
鑒于上述背景技術(shù)，為了避免資源浪費(fèi)，如何對(duì)鱟試劑生產(chǎn)廢料進(jìn)行再提取，從中獲得更多可利用的生物活性物質(zhì)，就顯得十分必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中鱟試劑生產(chǎn)廢料浪費(fèi)的現(xiàn)狀，提供一種從鱟試劑生產(chǎn)廢料中提取抑菌組合物的方法。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
一種從鱟試劑生產(chǎn)廢料中提取抑菌組合物的方法，該方法包括步驟如下：
(1)原料處理
a.收集鱟全血，
b.分離鱟血細(xì)胞及血漿，其中，鱟血細(xì)胞先用于鱟試劑生產(chǎn)，在鱟試劑生產(chǎn)過程的鱟血細(xì)胞裂解分純的工藝中，將乳化物離心后的下層沉淀丟棄物作為原料備用，將鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿作為原料備用；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8.0的比例加入20mmol/l的酸液，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s，反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將酸抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍(lán)蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀，將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液；
(4)血漿中sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為sod粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍(lán)蛋白粗提液，10-20份的sod粗提液混合，使用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)ph值4-5后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
而且，所述步驟(5)中的ph調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
而且，作為所述抑菌組合物，鱟素肽粗提液﹕血藍(lán)蛋白粗提液﹕sod粗提液的最佳配比為：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是：
1、本專利對(duì)鱟試劑生產(chǎn)廢料進(jìn)行了充分提取。主要提取了鱟血細(xì)胞提取廢料中的鱟素肽及血漿中的血藍(lán)蛋白及超氧化物歧化酶(sod)等成分，將其混合后用于其他產(chǎn)品的制備,
2、由于本發(fā)明發(fā)法的最終抑菌組合物應(yīng)用的領(lǐng)域?yàn)橐话阈匀粘？咕祝栏灶I(lǐng)域，因此，鱟素肽的提取采用的是快速，便捷的低成本提取方式，提取出的鱟素肽粗提液完全能夠滿足日常性抗菌，消炎，防腐性用品的需要。
2、本專利方法獲得的組合物能有效的抑制各類細(xì)菌及真菌的生長。較傳統(tǒng)化學(xué)抑菌產(chǎn)品而言，更為安全溫和有效，無毒副作用，能避免常規(guī)抑菌產(chǎn)品耐藥性和過敏現(xiàn)象的發(fā)生。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種從鱟試劑生產(chǎn)廢料中提取抑菌組合物的方法，該方法包括步驟如下：
(1)原料處理
a.收集鱟全血，
b.分離鱟血細(xì)胞及血漿，其中，鱟血細(xì)胞先用于鱟試劑生產(chǎn)，在對(duì)鱟試劑生產(chǎn)過程的鱟血細(xì)胞裂解分純的工藝中，將乳化物離心后的丟棄物下層沉淀作為原料備用，將鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿作為原料備用；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液(20mmol/l)，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s。反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍(lán)蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀，將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液；
(4)血漿中sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為sod粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍(lán)蛋白提取液，10-20份的sod提取液混合，使用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)ph值4-5后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
其中，所述ph調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
實(shí)例1
(1)原料處理
a.收集鱟全血，
b.分離鱟血細(xì)胞及血漿，其中，鱟血細(xì)胞先用于鱟試劑生產(chǎn)，在對(duì)鱟試劑生產(chǎn)過程的鱟血細(xì)胞裂解分純的工藝中，將乳化物離心后的丟棄物下層沉淀作為原料備用，將鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿作為原料備用；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5的比例加入酸液(20mmol/l)，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s。反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過濾得鱟素肽粗提液。
(3)血漿中粗提液的制備
取上述備用的血漿，血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀。將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液。
(4)sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取上述備用的血漿100份鱟血漿，加入34份,0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻。將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液。即為sod粗提液。
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60份的鱟素肽粗提液，20份的血藍(lán)蛋白提取液，20份的sod提取液混合，并調(diào)節(jié)ph后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
實(shí)例2
(1)原料處理
a.收集鱟全血，
b.分離鱟血細(xì)胞及血漿，其中，鱟血細(xì)胞先用于鱟試劑生產(chǎn)，在對(duì)鱟試劑生產(chǎn)過程的鱟血細(xì)胞裂解分純的工藝中，將乳化物離心后的丟棄物下層沉淀作為原料備用，將鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿作為原料備用；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:8的比例加入酸液(20mmol/l)，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s。反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過濾得鱟素肽粗提液。
(3)血漿中粗提液的制備
取上述備用的血漿，血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀。將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液。
(4)sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取上述備用的血漿100份鱟血漿，加入34份,0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻。將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液。即為sod粗提液。
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按80份的鱟素肽粗提液，10份的血藍(lán)蛋白提取液，10份的sod提取液混合，并調(diào)節(jié)ph后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
實(shí)例3
(1)原料處理
a.收集鱟全血，
b.分離鱟血細(xì)胞及血漿，其中，鱟血細(xì)胞先用于鱟試劑生產(chǎn)，在對(duì)鱟試劑生產(chǎn)過程的鱟血細(xì)胞裂解分純的工藝中，將乳化物離心后的丟棄物下層沉淀作為原料備用，將鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿作為原料備用；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:7的比例加入酸液(20mmol/l)，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s。反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過濾得鱟素肽粗提液。
(3)血漿中粗提液的制備
取上述備用的血漿，血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀。將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液。
(4)sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取上述備用的血漿100份鱟血漿，加入34份,0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻。將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液。即為sod粗提液。
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按70份的鱟素肽粗提液，15份的血藍(lán)蛋白提取液，15份的sod提取液混合，并調(diào)節(jié)ph后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
抑菌組合物的抑菌試驗(yàn)
a實(shí)驗(yàn)材料
由鱟素肽粗提液、血藍(lán)蛋白提取液、sod提取液組合的抑菌組合物。
b受試菌種
細(xì)菌：金黃色葡萄球菌：(staphylococcusaureus)atcc6538
大腸埃希氏菌：(escherichiacoli)atcc8739
銅綠假單胞菌：(pseudomonas.aeruginosa)atcc9027
注：上述菌株均由中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)微生物菌種庫提供。
c培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)基：卵磷脂吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min后制成斜面?zhèn)溆谩?/p>
d菌懸液的制備
實(shí)驗(yàn)前將各個(gè)菌株分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，細(xì)菌(金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌)均于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48小時(shí)。分別挑取適量菌落于無菌生理鹽水中混勻，制成一定濃度的混合菌懸液。混合細(xì)菌懸液總濃度約為1.0×108cfu/ml。置于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
e抑菌組合物抑菌液的制備
按照正交設(shè)計(jì)法確定各提取液組合的配比，將四種提取液按表1的方案分別進(jìn)行配制后，備用。
表1抑菌組合物抑菌作用考察因素及水平
f抑菌組合物的抑菌試驗(yàn)
采用濾紙片擴(kuò)散法，無菌條件下進(jìn)行，將濾紙用打孔器打成直徑6mm的圓形濾紙片，置于潔凈干凈的小燒杯，121℃干熱滅菌20min后，分別放入4種不同比例提取液復(fù)配液中充分浸泡，每只試管放入8片備用。將已配制好的固體培養(yǎng)基融化，分別倒入培養(yǎng)皿中，121℃滅菌20min，待冷卻凝固后，吸取0.1ml菌懸液于平板上涂布均勻。用無菌鑷子分別夾取已在提取物原液中浸泡過的直徑為6mm圓形濾紙片，貼在含菌平板上，每個(gè)平板內(nèi)貼5片，以無菌水浸泡的濾紙片作為空白對(duì)照，將各培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中平板倒置培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑的大小，設(shè)3個(gè)重復(fù)，取其平均值。混合細(xì)菌懸液的抑菌圈直徑見表2
表2
由抑菌圈大小可以看出，提取液配比為8：1：1或6：2：2時(shí)，抑菌作用明顯。