本發明涉及無菌苗法篩選高必需氨基酸且抗鎘的水稻品種，屬于水稻品種的篩選技術領域。

背景技術：
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水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球大約有35％-50％的人以水稻作為主食，它為人類提供大約40％的蛋白質和20％的能量。在過去水稻的研究中，長期以來都是以產量作為主要路線。隨著社會的發展，人們不僅注重產量，更為重要的是對品質要求不斷地提高。水稻的品質特征由碾來品質、外觀品質、蒸煮品質、營養品質4個方面共12項理化指標和食味品質進行綜合評定。然而，水稻中蛋白質含量、氨基酸組成以及必需氨基酸的含量是決定水稻品質優劣的關鍵因素，其中最重要的指標是蛋白質中氨基酸的比例和必需氨基酸的含量。必需氨基酸是人體內必不可少的，而機體又不能合成的，必須從食物中攝取的氨基酸。目前，國內外在研究水稻蛋白質方面較多，而對蛋白質的營養品質及氨基酸的組成研究較為匱乏。

然而，水稻的一系列品質特征在遺傳方面也都有顯著表現。比如蒸煮品質的遺傳，水稻直鏈淀粉含量主要受胚乳基因型控制。水稻品質性狀不僅受到遺傳基因的控制，同時又受到環境因素的影響，對于不同的環境條件具有不同的適應性和穩定性。在早期篩選過程中需要減少環境因素對水稻品質的影響，防止除了遺傳因素以外的其他因素對水稻品種的早期篩選造成影響。

鎘(Cd)是生物毒性極強的重金屬元素，與Pb、Cr、As和Hg合稱為“五毒”，位列第二。近年來，現代工業的發展以及鎘在冶煉、化工、造紙和電子工業等方面的廣泛應用，使得Cd污染日趨嚴重,金屬鎘極易在水稻體內富集，并通過食物鏈進入人體，危害人體健康。我國水稻栽培區耕地土壤鎘污染極其嚴重，因此，研究稻米的抗鎘性能具有重要的意義。

技術實現要素：
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針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供一種無菌苗法篩選高必需氨基酸且抗鎘的水稻品種。

本發明的無菌苗法篩選高必需氨基酸及抗鎘的水稻品種具體方法為：步驟一:無菌苗法篩選高必需氨基酸水稻品種，具體步驟為:

1-1:材料準備，聚丙烯塑料碗，口徑為14-16cm，15個；

微生物搖瓶培養膜，規格15.5cm×16.5cm，15張；

紗布，規格10cm×10cm，60塊；

封口膜；

75％的酒精200ml；

5％的福爾馬林200ml；

0.15％的復合肥溶液200ml；

滅菌水400ml；

1-2：選擇益豐3321、益豐3317、益豐3315、益豐14-24、益豐45為培育的水稻品種，所有的水稻品種均取自湖南永益農業科技發展有限公司；按照4分法每種稱10g進行分種；

1-3：浸種，浸種之前汰除懸浮水面的空癟粒，浸種4-8小時；

1-4：器材的滅菌處理，將15個聚丙烯塑料碗，60塊紗布，2瓶共計400ml的滅菌水一同放入高壓蒸汽滅菌鍋內，在121℃下滅菌20-30min；

1-5水稻種子消毒，消毒過程在超凈工作臺內進行，對每種水稻種子用75％的酒精浸種30秒，浸畢，將酒精倒入廢液缸，然后對每種水稻種子用5％的福爾馬林浸泡5分鐘，浸畢，用滅菌水洗3次；

1-6：播種，每個塑料碗內墊4層紗布，再倒入0.15％復合肥溶液，每個水稻品種播3碗，每碗播種50粒；

1-7：封膜，將透氣性培養膜蓋住碗口，其邊緣用膠帶粘封，防止邊緣漏氣；

1-8：無菌苗培養，將封好膜的塑料碗，置于25℃光照養箱內培養，光照模式為明暗各12時，培養15天；

1-9：取樣并進行前處理，取根頸部以上的秧苗，在80-100℃下烘至恒重，研磨、粉碎過60目篩，檢測氨基酸前再烘干至恒重；

1-10：測定無菌苗中17種氨基酸含量，計算氨基酸總量和8種必需氨基酸之和；必需氨基酸的測定參照GB7649-87《谷物籽粒氨基酸測定的前處理方法》、GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》確定，再通過高效液相色譜對無菌苗氨基酸含量進行測定，采用柱前衍生反向高壓液相色譜的方法測無菌苗中氨基酸的含量，即先將提取的無菌苗中氨基酸樣品在分離前進行水解、衍生，然后用反相色譜分離，最后用熒光檢測器檢測，普通方法測定得到其無菌苗中的氨基酸組成及其含量、必需氨基酸含量，通過數據分析及研究篩選出高必需氨基酸的水稻品種；

1-11：測定結果的分析與研究，無菌苗氨基酸含量的分析：把實驗所選擇的益豐3321、益豐3317、益豐3315、益豐14-24、益豐45五種水稻測定的氨基酸組成及其含量、必需氨基酸含量通過數據分析及研究篩選出高必需氨基酸的水稻品種；

步驟二:采用無菌苗法篩選抗鎘水稻品種；具體的步驟與步驟一中無菌苗法篩選高必需氨基酸水稻品種的步驟大體相同，不同之處在于在培養過程中，在復合肥溶液中按3mg/L加入氯化鎘，培養15天，且培養完成后截取無菌苗水面以上的部分進行檢測，含鎘最少的即為抗鎘水稻品種；

步驟三：用篩選出的高必需氨基酸水稻品種和抗鎘水稻品種作為親本，雜交培養出高必需氨基酸及抗鎘水稻品種。

本發明的有益效果：1.環境可控，它能克服現有技術的弊端，選育過程簡單，在選育過程中水稻品質性狀完全受遺傳基因的控制，不受環境因素影響，可防止除了遺傳因素以外的其他因素對本研究的影響；2.在較短時期內可篩選大量樣品；3.可大大縮短育種年限；4.可節省大量人力，物力，財力。

附圖說明：

為了易于說明，本發明由下述的具體實施及附圖作以詳細描述。

圖1為本發明實施例中5種水稻無菌苗氨基酸測定結果圖；

圖2為本發明實施例中5種水稻無菌苗必需氨基酸測定結果圖；

圖3為本發明實施例中5種水稻稻谷氨基酸含量測定結果圖；

圖4為本發明實施例中5種水稻無菌苗必需氨基酸含量數據圖；

圖5為本發明實施例中5種水稻無菌苗必需氨基酸含量方差分析圖；

圖6為本發明實施例中5種水稻無菌苗必需氨基酸含量方差分析差異比較結果圖；

圖7為本發明實施例中5種水稻稻谷必需氨基酸含量分析數據圖；

圖8為本發明實施例中5種水稻稻谷必需氨基酸含量方差分析圖；

圖9為本發明實施例中5種水稻稻谷必需氨基酸含量方差分析差異比較結果圖；

圖10為本發明實施例中5種水稻精米必需氨基酸測定結果圖；

圖11為人體不同年齡階段每日必須氨基酸需要量估計及氨基酸需要量模式圖。

圖12為本發明實施例中5種水稻品種中無菌苗鎘含量與相應品種精米鎘含量比較圖。

具體實施方式：

本具體實施方式采用以下實施例進一步表述：

實施例：

步驟一:無菌苗法篩選高必需氨基酸水稻品種，具體步驟為:

1-1:材料準備，聚丙烯塑料碗，口徑為14-16cm，15個；

微生物搖瓶培養膜，規格15.5cm×16.5cm，15張；

紗布，規格10cm×10cm，60塊；

封口膜；

75％的酒精200ml；

5％的福爾馬林200ml；

0.15％的復合肥溶液200ml；

滅菌水400ml；

1-2：選擇益豐3321、益豐3317、益豐3315、益豐14-24、益豐45為培育的水稻品種，所有的水稻品種均取自湖南永益農業科技發展有限公司；按照4分法每種稱10g進行分種；

1-3：浸種，浸種之前汰除懸浮水面的空癟粒，浸種6小時；

1-4：器材的滅菌處理，將15個聚丙烯塑料碗，60塊紗布，2瓶共計400ml的滅菌水一同放入高壓蒸汽滅菌鍋內，在121℃下滅菌20min；

1-5:水稻種子消毒，對每種水稻種子用75％的酒精浸種30秒，浸畢，將酒精倒入廢液缸，然后對每種水稻種子用5％的福爾馬林浸泡5分鐘，浸畢，用滅菌水洗3次；

1-6：播種，每個塑料碗內墊4層紗布，再倒入0.15％復合肥溶液，每個水稻品種播3碗，每碗播種50粒；

1-7：封膜，將透氣性培養膜蓋住碗口，其邊緣用膠帶粘封，防止邊緣漏氣；

1-8：無菌苗培養，將封好膜的塑料碗，置于25℃光照養箱內培養，光照模式為明暗各12時，培養15天；

1-9：取樣并進行前處理，取根頸部以上的秧苗，在80℃下烘至恒重，研磨、粉碎過60目篩，檢測氨基酸前再烘干至恒重；

1-10：測定無菌苗中17種氨基酸含量，計算氨基酸總量和8種必需氨基酸之和，其中必需氨基酸的測定參照GB7649-87《谷物籽粒氨基酸測定的前處理方法》、GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》確定，再通過高效液相色譜對無菌苗氨基酸含量進行測定，采用柱前衍生反向高壓液相色譜的方法測無菌苗中氨基酸的含量，即先將提取的無菌苗中氨基酸樣品在分離前進行水解、衍生，然后用反相色譜分離，最后用熒光檢測器檢測，普通方法測定得到其無菌苗中的氨基酸組成及其含量、必需氨基酸含量，通過數據分析及研究篩選出高必需氨基酸的水稻品種；

1-11：測定結果的分析與研究，無菌苗氨基酸含量的分析：把實驗所選擇的益豐3321、益豐3317、益豐3315、益豐14-24、益豐45五種水稻測定的氨基酸組成及其含量、必需氨基酸含量進行比較分析，氨基酸測定結果如下圖1，必需氨基酸測定結果如圖2,由圖1和圖2可知,無菌苗中氨基酸總量及八種必需氨基酸的含量最高的為益豐3321；

把實驗所選擇的益豐3321、益豐3317、益豐3315、益豐14-24、益豐45五種水稻稻谷進行氨基酸含量的檢測，得到其數據見圖3，從圖3可知，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的35％-40％之間，與無菌苗法篩選結果基本一致，且益豐3321的氨基酸含量最高；接著對水稻無菌苗氨基酸的方差分析，參照圖4和圖5，根據圖4數據以及下列公式計算出其處理方差、重復方差、誤差方差得出：

總自由度df＝nk-1

處理自由度dft＝k-1

重復自由度dfr＝n-1

誤差自由度dfe＝df-dft-dfr

查統計表得出，當dfe＝8，dfr＝4時，顯著點的F值為3.84(1％)，F＝39.626大于3.84，說明品種間必需氨基酸含量具有顯著差異。根據鄧肯氏多重復差異比較，計算水稻品種間的差異性。

圖6為無菌苗必需氨基酸含量方差分析差異比較結果，參照圖6得出以下結論：無菌苗中必需氨基酸含量占氨基酸總量約在30％-40％，其中，益豐3321氨基酸含量較其他4個品種的高。益豐3321相對其他品種品質較好。

參照圖7，根據圖7的數據以及下列公式計算出其處理方差、重復方差、誤差方差，結果見圖8得出：

總自由度df＝nk-1

處理自由度dft＝k-1

重復自由度dfr＝n-1

誤差自由度dfe＝df-dft-dfr

查統計表得知：當dfe＝8，dfr＝4時，顯著點的F值為3.84(1％)，F＝39.626大于3.84，說明品種間必需氨基酸含量具有顯著差異。根據鄧肯氏多重復差異比較，計算水稻品種間的差異性。圖9為稻谷必需氨基酸含量方差分析差異比較結果。根據稻谷氨基酸含量的測定與方差分析結果表明，益豐3321必需氨基酸含量和氨基酸總量均高于其他4個品種。

精米必需氨基酸含量的測定，將實驗所選擇的益豐3321、益豐3317、益豐3315、益豐14-24、益豐45五種水稻品種的精米進行氨基酸的提取及測定，總共檢測出17種氨基酸，其中包括8種必需氨基酸和9種非必需氨基酸。必需氨基酸的測定結果如圖10。

由圖10可知，精米必需氨基酸含量最高為益豐3317，但在無菌苗以及稻谷必需氨基酸含量方差分析中卻分別屬于C類和b類，而在之前篩選出來的優質品種益豐3321在精米必需氨基酸含量上也擁有較高水平，僅次于益豐3317。因此在生產上可以直接選用益豐3321和益豐3317作為高必需氨基酸水稻品種；

圖11為人體不同年齡階段每日必須氨基酸需要量估計及氨基酸需要量模式圖，由圖11可知，根據不同年齡每日必需氨基酸需求量估計以及對比圖10五種水稻精米中必需氨基酸的含量可知，每100g精米中已基本滿足不同年齡階段每日必需氨基酸的需求。

步驟二：采用無菌苗法篩選抗鎘水稻品種；具體的步驟與無菌苗法篩選高必需氨基酸水稻品種的步驟大體相同，不同之處在于在培養過程中，在復合肥溶液中按3mg/L加入氯化鎘，培養15天，且培養完成后截取無菌苗水面以上的部分進行檢測，含鎘最少的即為抗鎘水稻品種；參照圖12所示,圖12為不同水稻品種無菌苗鎘含量與相應品種精米鎘含量比較圖,由圖12所得益豐3321無菌苗鎘含量和精米鎘含量最低,因此益豐3321具有較好的抗鎘性能。

步驟三：將篩選出的高必需氨基酸水稻品種益豐3317和抗鎘水稻品種益豐3321作為親本，雜交培養出高必需氨基酸及抗鎘水稻品種。

以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。