本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種促進(jìn)新植馬尾松生長的菌劑及其制作方法。

背景技術(shù)：

馬尾松(pinusmassoiana)是我國南方主要的速生用材樹種之一，是荒山造林的先鋒樹種和農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成樹種。松香和松脂是重要的化工原料，松木在我國工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也有廣泛的應(yīng)用。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對木材的需求不斷增加，馬尾松作為南方主要的用材樹種，其種植面積也不斷擴(kuò)大，短周期的高度集約經(jīng)營，導(dǎo)致馬尾松林土壤肥力衰退。近期，我國南方在大面積集約化經(jīng)營馬尾松人工林過程中，由于馬尾松主根發(fā)達(dá)，側(cè)根較少，導(dǎo)致造林成活率低，早期生長緩慢。加速馬尾松新造林生長、提高造林成活率成為馬尾松速生豐產(chǎn)急需研究解決的問題。

有研究表明，土壤的性狀影響馬尾松根系的生長和分布，最終影響地上生物量的多少。先前有研究者采用過磷鉀肥沾根、苗期截根等多種方法應(yīng)用于馬尾松造林，都取得了一定的成功。李勇和張展華1993年在《福建林學(xué)院學(xué)報(bào)》雜志《馬尾松苗沾根施肥對造林成活率影響的探討》中，公布了馬尾松苗沾根施肥后造林成活率達(dá)96％以上。林志鵬2000年在《西南林學(xué)院學(xué)報(bào)》雜志《切根育苗對馬尾松苗木及幼林生長的效應(yīng)》中，公布了9月初苗期切主根和側(cè)根，切根深度8-10cm，苗木質(zhì)量最優(yōu)，造林成活率可達(dá)96％。余孟楊2009年在《現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技》雜志《復(fù)合微生物菌肥應(yīng)用于馬尾松造林試驗(yàn)研究》中，公布了使用無毒無害、安全可靠、符合環(huán)保要求的具有固氮活性的高效復(fù)合微生物菌肥處理馬尾松苗木，能激活馬尾松根系活力，縮短緩苗期，促進(jìn)馬尾松地徑、樹高、根系等生長。上述用于提高馬尾松造林成活率和促進(jìn)馬尾松生長的文獻(xiàn)報(bào)道較少涉及使用菌劑，且所使用菌劑與本發(fā)明的菌劑不同。中國發(fā)明專利(授權(quán)公告號cn102503722b)公開了一種促進(jìn)馬尾松生長的復(fù)合微生物顆粒劑，該顆粒劑包含粘蓋牛肝菌屬和豆包屬中的一種或幾種外生菌根真菌作為菌根菌，與溶磷黃褐假單胞菌、解鉀菌的固體培養(yǎng)物用包膜材料包膜后，加入氮肥、磷肥、鉀肥、中微量元素和土壤改良劑，混合造粒而成。中國發(fā)明專利(授權(quán)公告號cn102612914b)公開了一種提高馬尾松林抗逆和生產(chǎn)力的施肥方法，其抗逆保健菌根菌劑由橙黃乳菇或紅汁乳菇采用固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵而成的菌根菌劑和萘乙酸或吲哚-3-乙酸復(fù)合配制而成。上述專利中的微生物菌劑均操作繁瑣，且所使用的菌株和功能與本發(fā)明菌劑的菌株和功能不同，而且還需要添加萘乙酸或吲哚-3-乙酸等化學(xué)物質(zhì)。中國發(fā)明專利(授權(quán)公告號cn103194396b)和中國發(fā)明專利(授權(quán)公告號cn103173359b)分別公開了能促進(jìn)木麻黃根系生長的曲霉和葉點(diǎn)霉菌株，但其主要用于促進(jìn)木麻黃而非馬尾松根系生長，且未開發(fā)成菌劑。

目前尚末見有能有效提高新植馬尾松的造林成活率和生長速度的微生物菌劑的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種促進(jìn)新植馬尾松生長的菌劑，通過該菌劑能促進(jìn)新植馬尾松根系對基肥的利用和根系的生長，提高新植馬尾松的造林成活率和生長速度。

本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：

本發(fā)明一種促進(jìn)新植馬尾松生長的菌劑，它由棘孢木霉孢子懸液、巨大芽孢桿菌菌懸液、高嶺土和馬鈴薯浸汁四種組分混合配制而成，各組分的配比如下：

高嶺土:棘孢木霉孢子懸液:巨大芽孢桿菌菌懸液:馬鈴薯浸汁＝1kg:20～50ml:20～100ml:5～50ml。

所述棘孢木霉孢子懸液中含有效活菌數(shù)為1×10⁸個(gè)/ml；所述巨大芽孢桿菌菌懸液中含有效活菌數(shù)為1×10⁸cfu/ml；所述馬鈴薯浸汁的質(zhì)量濃度為1％。

所述棘孢木霉孢子懸液的制備方法是：將棘孢木霉菌在菌株培養(yǎng)基平板中于28℃下靜止培養(yǎng)3d，利用體積濃度為0.05％的吐溫20無菌條件下收集孢子，即制得孢子懸液；所述菌株培養(yǎng)基由以下配比的原料混合配制成：馬鈴薯200g:葡萄糖20g:瓊脂18g:蒸餾水1000ml，配制后于121℃高壓滅菌20min。

所述巨大芽孢桿菌菌懸液的制備方法是：取保存的巨大芽孢桿菌菌株，在lb固體培養(yǎng)基平板中于37℃下活化培養(yǎng)2～3d后，用接種環(huán)取少量接種于裝有50mllb液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于37℃、180r/min震蕩培養(yǎng)72h，將培養(yǎng)后的菌懸液倒入滅菌的離心管中，于4℃、5000r/min下離心5min，倒去上清液，再用生理鹽水潤洗菌體兩次，最后根據(jù)離心管內(nèi)菌體的數(shù)量適量加入生理鹽水，混勻后即得到巨大芽孢桿菌菌懸液；所述lb固體培養(yǎng)基由以下配比的原料混合配制成：蛋白胨10g：酵母膏粉5g：氯化鈉5g：葡萄糖1g：瓊脂15g：蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.0±0.2，配制后于121℃高壓滅菌20min；所述lb液體培養(yǎng)基由以下配比的原料混合配制成：蛋白胨10g：酵母膏粉5g：氯化鈉5g：葡萄糖1g：蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.0±0.2，配制后于121℃高壓滅菌20min。

本發(fā)明將配制好的菌劑粉碎過60目篩后制得粉狀菌劑。

本發(fā)明制得的菌劑中，棘孢木霉的有效活菌數(shù)為1×10⁶個(gè)/g，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)為1×10⁶個(gè)/g。

本發(fā)明促進(jìn)新植馬尾松生長的菌劑具有如下有益效果：

1)本發(fā)明菌劑能高效分解基肥中的有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)新植馬尾松根系對基肥的利用，能實(shí)現(xiàn)菌劑和基肥的無縫銜接，節(jié)約施用成本和人力。

2)本發(fā)明菌劑中包含產(chǎn)吲哚-3-乙酸的菌株，適宜條件下培養(yǎng)24h吲哚-3-乙酸產(chǎn)量高達(dá)50.02mg/l；且該菌株與分解有機(jī)質(zhì)的菌株之間無拮抗作用，可以協(xié)同共生。

3)制備工藝簡便，成本低。本發(fā)明產(chǎn)品與中國發(fā)明專利cn102612914b公開的抗逆保健菌根菌劑相比，不需要另外添加吲哚-3-乙酸；與中國發(fā)明專利cn102503722b相比，不需要進(jìn)行包膜和添加土壤改良劑。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述：

本案發(fā)明人通過大量菌株分離、實(shí)驗(yàn)篩選和拮抗試驗(yàn)，獲得了可以高效分解基肥中有機(jī)質(zhì)的棘孢木霉菌菌株，對其菌株的dna進(jìn)行了初步鑒定，它的活性成分包括棘孢木霉菌(trichodermaasperellum)；獲得了能夠分泌吲哚-3-乙酸的菌株，其與棘孢木霉菌之間無拮抗作用，可以協(xié)同共生，對其菌株的dna進(jìn)行了初步鑒定，它的活性成分包括巨大芽孢桿菌(bacillusmegatherium)。

本發(fā)明促進(jìn)新植馬尾松生長的菌劑的制備方法是：

采用濃度為1×10⁸個(gè)/ml的棘孢木霉孢子懸液、1×10⁸cfu/ml的巨大芽孢桿菌菌懸液、質(zhì)量濃度為1％的馬鈴薯浸汁與高嶺土拌合制成菌劑，各組分的配比如下：高嶺土:孢子懸液:菌懸液:馬鈴薯浸汁＝1kg:20～50ml:20～100ml:5～50ml。

所述濃度為1×10⁸個(gè)/ml的棘孢木霉孢子懸液的制備方法是：

將棘孢木霉菌在菌株培養(yǎng)基平板中28℃，靜止培養(yǎng)3d，利用體積濃度為0.05％(v：v)吐溫20無菌條件下收集孢子，制備孢子懸液。孢子懸液經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)和稀釋，濃度達(dá)到1×10⁸個(gè)/ml，即制得孢子懸液。所述菌株培養(yǎng)基由以下配比的原料混合制成：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，配制后于ph自然、121℃高壓滅菌20min

所述濃度為1×10⁸cfu/ml的巨大芽孢桿菌菌懸液的制備方法是：

取保存的巨大芽孢桿菌菌株，在lb固體培養(yǎng)基平板中于37℃下活化培養(yǎng)2～3d后，用接種環(huán)取少量接種于裝有50mllb液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于37℃、180r/min震蕩培養(yǎng)72h。將菌懸液倒入滅菌的離心管中，于4℃、5000r/min離心5min，倒去上清液，再用生理鹽水潤洗菌體兩次，最后根據(jù)離心管內(nèi)菌體的數(shù)量適量加入生理鹽水，混勻后即為菌懸液(od600＝1.5～2，菌落數(shù)達(dá)到1×10⁸cfu/ml)。所述lb固體培養(yǎng)基由以下配比的原料混合配制成：蛋白胨10g：酵母膏粉5g：氯化鈉5g：葡萄糖1g：瓊脂15g：蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.0±0.2，配制后于121℃高壓滅菌20min。所述lb液體培養(yǎng)基由以下配比的原料混合配制成：蛋白胨10g：酵母膏粉5g：氯化鈉5g：葡萄糖1g：蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.0±0.2，配制后于121℃高壓滅菌20min。

本發(fā)明通過將培養(yǎng)獲得的棘孢木霉孢子懸液和巨大芽孢桿菌菌懸液以及馬鈴薯浸汁經(jīng)高嶺土吸附，然后拌合均勻，粉碎包裝制得本發(fā)明產(chǎn)品。將菌劑粉碎過60目篩后制得粉狀菌劑。所制得的菌劑中，棘孢木霉的有效活菌數(shù)為1×10⁶個(gè)/g，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)為1×10⁶個(gè)/g。

以下通過優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，然而本發(fā)明范圍不僅僅限于下列實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：

原料配方：含1×10⁸個(gè)/ml的棘孢木霉孢子懸液50ml，1×10⁸cfu/ml的伯克氏菌菌懸液100ml，1％(w：v)的馬鈴薯浸汁50ml，高嶺土1kg。

制備方法：取收集的棘孢木霉孢子懸液，濃度達(dá)到1×10⁸個(gè)/ml；取收集的巨大芽孢桿菌菌懸液，濃度達(dá)到1×10⁸cfu/ml，與馬鈴薯浸汁進(jìn)行拌合，再與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保棘孢木霉的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，即得本發(fā)明成品。

將本發(fā)明產(chǎn)品0.5kg，配合基肥施加到馬尾松新植穴中，一個(gè)月后，與不施加本發(fā)明菌劑相比，馬尾松平均苗高增加20％，平均地徑增加18％，平均根系長度增加10％，平均根系生物量增加6％。造林成活率為99％，比不施加本發(fā)明菌劑提高4％。

實(shí)施例2：

原料配方：含1×10⁸個(gè)/ml的棘孢木霉孢子懸液20ml，1×10⁸cfu/ml的伯克氏菌菌懸液100ml，1％(w：v)的馬鈴薯浸汁5ml，高嶺土1kg。

制備方法：取收集的棘孢木霉孢子懸液，濃度達(dá)到1×10⁸個(gè)/ml；取收集的巨大芽孢桿菌菌懸液，濃度達(dá)到1×10⁸cfu/ml，與馬鈴薯浸汁進(jìn)行拌合，再與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保棘孢木霉的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，即得本發(fā)明成品。

將本發(fā)明產(chǎn)品0.5kg，配合基肥施加到馬尾松新植穴中，一個(gè)月后，與不施加本發(fā)明菌劑相比，馬尾松平均苗高增加12％，平均地徑增加7％，平均根系長度增加8％，平均根系生物量增加5％。造林成活率為98％，比不施加本發(fā)明菌劑提高3％。

實(shí)施例3：

原料配方：含1×10⁸個(gè)/ml的棘孢木霉孢子懸液50ml，1×10⁸cfu/ml的伯克氏菌菌懸液20ml，1％(w：v)的馬鈴薯浸汁50ml，高嶺土1kg。

制備方法：取收集的棘孢木霉孢子懸液，濃度達(dá)到1×10⁸個(gè)/ml；取收集的巨大芽孢桿菌菌懸液，濃度達(dá)到1×10⁸cfu/ml，與馬鈴薯浸汁進(jìn)行拌合，再與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保棘孢木霉的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，即得本發(fā)明成品。

將本發(fā)明產(chǎn)品0.5kg，配合基肥施加到馬尾松新植穴中，一個(gè)月后，與不施加本發(fā)明菌劑相比，馬尾松平均苗高增加15％，平均地徑增加9％，平均根系長度增加4％，平均根系生物量增加2％。造林成活率為97％，比不施加本發(fā)明菌劑提高2％。

實(shí)施例4：

原料配方：含1×10⁸個(gè)/ml的棘孢木霉孢子懸液50ml，1×10⁸cfu/ml的伯克氏菌菌懸液50ml，1％(w：v)的馬鈴薯浸汁50ml，高嶺土1kg。

制備方法：取收集的棘孢木霉孢子懸液，濃度達(dá)到1×10⁸個(gè)/ml；取收集的巨大芽孢桿菌菌懸液，濃度達(dá)到1×10⁸cfu/ml，與馬鈴薯浸汁進(jìn)行拌合，再與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保棘孢木霉的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)達(dá)到1×10⁶個(gè)/g，即得本發(fā)明成品。

將本發(fā)明產(chǎn)品0.5kg，配合基肥施加到馬尾松新植穴中，一個(gè)月后，與不施加本發(fā)明菌劑相比，馬尾松平均苗高增加16％，平均地徑增加13％，平均根系長度增加7％，平均根系生物量增加6％。造林成活率為98％，比不施加本發(fā)明菌劑提高3％。