本發明涉及植物組織培養領域，尤其涉及一種沼澤小葉樺離體芽快繁方法。技術背景我國大陸沿海海岸線長18000km，擁有灘涂面積21709km2，且以每年300km2的速度繼續淤長。灘涂生態系統受海陸系統的雙重干擾，土壤發育時間短，鹽分含量高，造成了灘涂自然生態新系統的脆弱性和不穩定性。加之臺風、暴雨、冰雹、龍卷風等災害性天氣頻繁，每年造成的經濟損失達10.6億元，當地生態安全和社會經濟發展受到嚴重影響。目前，沿海灘涂造林樹種缺乏，大面積的灘涂處于荒蕪狀態，選育和引進耐鹽樹種成為沿海灘涂造林綠化、合理開發和利用的關鍵。沼澤小葉樺為落葉小喬木，具有較強的耐鹽和耐水能力，可在高鹽、高水位環境下生長，在沿海和低濕地上具有應用的潛力。調查發現，我國約有500余種鹽生植物，其中木本植物所占比例稀少，由于沼澤小葉樺在改造和利用鹽漬土方面特性，將是優良的候選樹種之一。在我國廣闊的東部沿海灘涂地區，如果能將沼澤小葉樺引種到這些地區，將能豐富該地區的植被類型，改善生態環境。然而，沼澤小葉樺是極為稀有和瀕臨滅絕的溫帶落葉闊葉樹種，為國家二級重點保護瀕危植物，其嫩枝扦插極難生根，目前主要采用種子繁殖，不能規模化育苗，嚴重限制了沼澤小葉樺的引種移栽及深入研究。因此，需要采取其他方式來提高其繁殖能力。技術實現要素：本發明目的在于克服現有技術存在的外植體污染、褐化、玻璃化現象等阻礙植物組培工作的問題，提供一種繁殖速度快，生產周期短、增殖系數高且成活率高的沼澤小葉樺離體芽快繁方法，通過外植體選擇及消毒、啟動誘導培養、繼代增殖培養、生根誘導培養、煉苗移栽等過程實現沼澤小葉樺離體快繁。為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，包括以下步驟：1)挑選株高1～1.5m的未萌動的健壯植株，4～5月份采主枝頂芽、主枝側芽、側枝頂芽的新生芽作為外植體；2)在超凈工作臺上，先用70％的酒精處理外植體20s，再用0.1％升汞消毒5～20min，10％naclo消毒0～20min，用無菌水沖洗數次；3)將處理好的外植體在無菌的條件下接種到初代培養基上，初代培養基成分為：ms+0.6～1.5mg/l6-ba+0.5～1.0g/lpvp，培養20d以上；4)將外植體轉入增殖培養基，增殖培養基成分為：ms+0.4～0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，培養時間20d以上獲得小苗；5)將小苗進行生根培養，生根培養基成分：ms+0.1～0.5mg/lnaa，或1/2ms+0～0.5mg/lnaa，培養20d以上；7)煉苗移栽：選擇健壯的無菌苗，用多菌靈溶液浸泡清洗后，移栽到已消毒的蛭石+珍珠巖的基質中，先保濕培養一周，逐漸去掉蓋子。步驟1)中，在新生芽萌動前，用50％的多菌靈可濕性粉劑噴灑植株，一周兩次，直到植株吐芽、取材為止。步驟1)中，從健壯枝條上采回新生芽，用試管刷蘸洗衣粉輕輕刷洗，流水沖洗表面污物2～3h。步驟2)中，先用70％酒精處理20s，再配合0.1％升汞處理10min，后用無菌水沖洗4-5次。步驟3)中，初代培養基成分為：ms+0.8～1.0mg/l6-ba+1.0g/lpvp。步驟4)中，增殖培養基成分為：ms+0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，或ms+0.4mg/l6-ba+0.02mg/lnaa。步驟5)中，生根培養基成分：ms或1/2ms+0.1或0.5mg/lnaa。有益效果：與現有的技術相比，本發明以沼澤小葉樺離體芽為外植體，建立了組培繁殖體系。通過酒精和升汞預處理母本材料，大大降低了外植體的污染率，使外植體成活率最高可達74.19％，污染率降為25.81％。初代培養基中添加pvp，使褐化現象消失，大大降低了組培風險，提高了成活率。本方法得到的組培苗具有增殖系數高，生根率高，栽植成活力高等特點。有利于沼澤小葉樺的保護與開發，具有廣泛應用前景。附圖說明圖1是6-ba濃度過高時，初生代培養無菌苗圖。圖2是取材時間對污染率的影響結果圖。圖3是不同植物調節劑對沼澤小葉樺無菌苗生根的影響圖(a.ms無添加劑的生根；b.0.1mg/lnaa生根；c.少量多效唑生根；d.多量多效唑生根)。具體實施方式以下結合實例對本發明進一步詳細說明。以下實施例中，所使用的材料和試劑如下：材料：挑選株高1～1.5m左右的未萌動的健壯植株，3～7月間采健壯枝條上的新生芽作為試材。在新生芽萌動前，用50％的多菌靈可濕性粉劑噴灑植株，一周兩次，直到植株吐芽、取材為止。從健壯枝條上采回新生芽，用試管刷蘸洗衣粉輕輕刷洗，流水沖洗表面污物2～3h，在無菌條件下，用70％酒精進行表面消毒，再用消毒劑溶液處理。消毒后切除芽體基部與藥液接觸的部分，接種于無菌培養基上。ms培養基：瓊脂粉7.0g/l，蔗糖30g/l，用1mol/l的hcl和naoh將培養基ph調到6.0，煮沸，待瓊脂徹底融化后，分裝到廣口培養瓶中，用透氣性無菌塑料封口膜包扎培養瓶，在121℃下，高壓滅菌20min，后取出，放于培養室內，冷卻凝固后待用。若無特殊說明，所有培養條件均為：日光燈照明，培養溫度為(25±2)℃，空氣相對濕度50～60％，光照時間12～13h/d，光強為1500～2000lx。數據統計與分析方法：用excel進行數據處理和作圖，spss軟件進行數據分析。污染率(％)＝污染的外植體數/接種外植體總數×100％；死亡率(％)＝未污染外植體的死亡數/接種外植體總數×100％；萌芽率(％)＝未污染外植體芽萌動個數/接種外植體總數×100％；增殖系數＝增殖周期結束時苗高大于1.0cm的芽苗總數/增殖周期起始時的芽苗數平均株高(cm)＝培養周期結束時幼苗株高之和/接種時幼苗總數；生根率(％)＝生根的苗數/培養的苗數×100％；平均根數(條)＝根總數/生根株數；平均根長(cm)＝生根苗根總長/生根苗總數。實施例1沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，以沼澤小葉樺的新生芽為外植體，在超凈工作臺上，先用70％的酒精處理20s，后用0.1％的hgcl2或10％的naclo消毒劑采用不同的消毒時間(表1)消毒后，用無菌水沖洗5次。經消毒后的外植體放到鋪有無菌濾紙的培養皿中，吸干材料表面的水分，用手術刀切掉基部與藥液接觸的部分，將芽鱗和未展開的托葉切除，接種到ms+6-ba1.0mg/l生長培養基上，每個處理接12瓶，每瓶接3個外植體，定期觀察記錄，接種25d后統計污染率、死亡率及萌芽率。表1不同消毒劑和消毒時間的設計處理號70％酒精(s)0.1％hgcl2(min)10％naclo(min)120002205032010042015052020062005720010820015920020外植體消經毒處理后接種到培養基中培養，2～3d后部分外植體基部接觸培養基的部分周圍有水浸狀物質產生，呈無色或透明乳白色。隨著時間的延長，部分該物質逐漸消失。5d左右，部分培養基表面變得粗糙，有細菌污染的現象，菌落點點狀或帶水狀，顏色紅色或黃色等。一周左右開始有霉菌污染，主要分布在芽的表面或芽鱗片的傷口處，菌絲有白色或黑色，并且呈逐漸擴大的趨勢。部分芽無污染，不啟動，褐變死亡。在只用70％酒精處理20s時，污染很嚴重，成活率極低，雖然存活下來的外植體生長良好，也不能將其作為消毒的最佳方式(表2)。而當70％酒精和0.1％hgcl2或10％naclo搭配使用時，外植體消毒效果明顯改善，污染率降低，且成活率顯著提高。0.1％的hgcl2處理時，最佳消毒時間為10min，成活率最高達74.19％，并且外植體長勢良好，葉片深綠。10％naclo處理的最佳時間為10min，成活率最高可達72.22％，葉片淺綠色，長勢良好。當兩種消毒劑處理20min時，污染率雖降低，但由于時間過長，外植體成活率明顯下降，生長狀況不理想，長勢不佳。表2不同消毒處理的影響處理號接種總數污染率成活率生長狀況13683.00％10.10％葉片深綠，長勢良好23635.00％65.00％葉片深綠，長勢良好33625.81％74.19％葉片深綠，長勢良好43620.57％71.43％葉片深綠，長勢一般53617.89％42.11％萌動較慢63638.89％61.11％葉片淺綠，長勢良好73627.78％72.22％葉片淺綠，長勢良好83622.22％66.67％葉片淺綠，長勢良好93616.67％47.78％葉片淺綠，莖稈細弱實施例2一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，包括以下步驟：1)外植體的建立：挑選株高1～1.5m左右的未萌動的健壯植株，4～5月份采主枝頂芽、側芽以及側枝頂芽等新生芽作為植體材料。在新生芽萌動前，用50％的多菌靈可濕性粉劑噴灑植株，一周兩次，直到植株吐芽、取材為止。為減少材料污染，從健壯枝條上采回新生芽，用試管刷蘸洗衣粉輕輕刷洗，流水沖洗表面污物2～3h。2)外植體的消毒：用步驟1)得到的外植體，在超凈工作臺上，先用70％的酒精處理20s，再用0.1％升汞消毒10min，用無菌水沖洗5次。3)初代培養：將處理好的外植體在無菌的條件下接種到初代培養基上，成分為：ms+1.0mg/l6-ba+0～1.0g/lpvp，培養溫度：25±2℃，空氣相對濕度50～60％，光照時間：12～13h/d，光強：1500～2000lx，培養時間：25d。初代培養處理好的外植體需放到鋪有無菌濾紙的培養皿中，吸干材料表面的水分，用手術刀切掉基部與藥液接觸的部分，將芽鱗和未展開的托葉切除。5)增殖培養：將外植體轉入增殖培養基，成分為：ms+1.0g/lpvp+0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，培養時間25d。6)生根培養：將小苗進行生根培養，生根培養基成分：ms+1.0g/lpvp+0.1～0.5mg/lnaa，培養至25d。7)煉苗移栽：選擇健壯的無菌苗，用多菌靈溶液浸泡清洗后，移栽到已消毒的蛭石+珍珠巖(體積比1:1)的基質中，先保濕培養一周，逐漸去掉蓋子。采用pvp防治外植體的褐化，向培養基中添加不同濃度的pvp(表3)，接種處理好的外植體，每處理10瓶，每瓶3個，定期觀察記錄，25d后統計褐化率、褐斑直徑大小。表3不同濃度的pvp防褐化處理從表3可以看出，防治外植體褐化的最佳處理為3號處理，即在培養基中添加1.0g/l的pvp，可以有效降低褐化率，達到較好的防治效果，后續實施例君采用此操作。未添加pvp的1號處理，接種當天外植體基部即出現淺色褐斑，3～4天時褐斑顏色最深，褐斑直徑最大可達1.2cm。隨時間延長，褐斑有變淺消失的跡象，但外植體長勢不佳，基部切口處有長約0.2cm變的干枯、褐色，植株吸收營養受限制，生長受到抑制，嚴重時褐變死亡，如1號、2號處理。4號處理雖無褐化現象發生，但由于pvp濃度偏高，外植體葉尖有干黃現象發生。實施例3一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，同實施例2，其中在初生代培養時，以ms為基本培養基，在培養基中添加1.0g/l的pvp和不同濃度的6-ba(表4)，每個處理10瓶，每瓶3個外植體，25d后統計萌芽率。表4表明，外植體的萌芽率隨著6-ba濃度的增加而升高。未添加6-ba時，萌芽率最低，為16.67％，無愈傷形成，但生長較為緩慢；添加量大于0.8mg/l時萌芽率可達90％以上，雖基部有半球狀愈傷形成，但植株長勢良好；添加量為1.5mg/l時，萌芽率最高為96.67％，此時莖稈細長，基部愈傷呈球狀(圖1a)，較大較硬，葉片較薄，顏色發黃，長勢不佳(圖1b)。表4外植體萌芽率結果實施例4一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，同實施例2，其中分別于2013年3～7月份取當年生新芽，經70％酒精處理20s，再用0.1％hgcl2處理10min后，接種于ms+6-ba1.0mg/l+1.0g/lpvp。每個處理15瓶，每瓶3個外植體，接種25d后統計污染率、死亡率及啟動率。由圖2可以看出外植體的污染率呈先降低后升高的趨勢，在4月份取最低值為30％，到7月份污染率最高為66.67％；成活率曲線先升高后緩慢降低，4月份的成活率為70％，5月份成活率為73.33％，然后緩慢下降，7月份雖有66.67％，但明顯高出3月的成活率很多。外植體的死亡率在3月份最高，5月份最低，6、7月份稍有增加，但仍明顯低于3月份。綜合3條曲線來看，外植體的最佳取材時間為4月底至5月底。實施例5一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，同實施例3，其中于4月下旬取主枝和側枝的頂芽和側芽，經70％酒精處理20s，在用0.1％hgcl2處理10min后，接種于ms+6-ba1.0mg/l+1.0g/lpvp。每處理15瓶，每瓶3個外植體，接種后25d統計污染率、死亡率、啟動率及外植體生長狀況。對比不同取材部位外植體萌動情況如表5，結果表明主枝頂芽的萌芽率最高達83.33％，與主枝側芽、側枝頂芽的萌芽率沒有顯著差異，而與側枝側芽的萌芽率50％差異顯著，并且其萌動快、葉色綠、苗健壯，是最佳的取材部位。由于頂芽的頂端優勢，使得側枝頂芽的萌芽率73.33％與主枝上營養較為充足的側芽萌芽率76.67％間差異不顯著，外植體生長狀況較好，可以作為摘取外植體的選擇部位。因此，此試驗應選取主枝頂芽、主枝側芽、側枝頂芽為外植體，三者平均萌芽率為77.77％。表5不同取材部位外植體萌動情況比較不同部位萌芽率(％)苗高生長狀況主枝頂芽83.33±14.14a3.5cm萌動快，后期苗高生長快，健壯主枝側芽76.67±4.72a2.8cm萌動慢，長勢較均勻，苗高較低側枝頂芽73.33±9.42ab3.2cm萌動較快，苗高生長較快，較健壯側枝側芽50.00±4.71b2.5cm萌動慢，長勢較弱，苗高較低實施例6一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，同實施例2，其中在增殖培養階段，以ms為基本培養基，添加6-ba、naa，濃度及組合配比如(表6)，每處理10瓶，每瓶3個外植體，定期觀察芽的長勢，培養25d后，統計增殖芽的數目，并計算增殖系數。不同濃度的6-ba和naa對繼代苗增殖的影響如表6所示，4號處理組合即ms+0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa的增殖系數最高，增殖系數達3.70，顯著高于其他處理組合；其次是8號處理，增殖系數為3.40；再次優選處理組合為3號，即ms+0.4mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，增殖系數為2.80；增殖系數最小的是13號組合ms+0.05mg/l6-ba+1.5mg/lnaa，增殖系數僅為1.07。試驗過程中，繼代苗的生長狀態相差很大。1～4號處理中繼代苗基部無愈傷產生，形成腋芽及叢生芽，且長勢良好；13～16號處理中，繼代苗基部腫大，有愈傷組織形成，愈傷組織上產生大量的不定根，并且下部葉片的切口和葉脈處也形成了大量的不定根，不定根較短，外披絨毛，植株葉片發黃，長勢不佳，可以看出此類不定根的吸收功能較差。表6植物生長調節劑對繼代苗增殖的影響編號6-banaa增殖系數10.10mg/l0.02mg/l1.53±0.12defg20.20mg/l0.02mg/l1.80±0.36d30.40mg/l0.02mg/l2.80±0.18c40.60mg/l0.02mg/l3.70±0.14a50.10mg/l0.05mg/l1.20±0.09ij60.20mg/l0.05mg/l1.50±0.17efg70.40mg/l0.05mg/l1.70±0.50edf80.60mg/l0.05mg/l3.40±0.18b90.10mg/l0.10mg/l1.27±0.13ij100.20mg/l0.10mg/l1.53±0.13defg110.40mg/l0.10mg/l1.67±0.07edf120.60mg/l0.10mg/l1.77±0.12de130.05mg/l1.50mg/l1.07±0.06j140.10mg/l1.50mg/l1.17±0.06ij150.15mg/l1.50mg/l1.43±0.09fgh160.20mg/l1.50mg/l1.17±0.08ij實施例7一種沼澤小葉樺的離體芽快繁方法，同實施例2，其中在生根培養階段，選用材料為1.5～2.0cm，較健壯、長勢一致的無根苗。選用1/3ms培養基、1/2ms培養基和ms培養基作為不同處理，相互對照。每個處理20瓶，每瓶3株無根苗，進行生根培養。25d后統計每個處理的生根率、平均生根條數、平均根長和植株生長狀況。待小苗長至2.0～3.0cm，接種到生根培養基中進行生根培養。一周左右在無菌苗的基部產生白色點狀突起，隨著時間的延長，這些點狀突起繼續伸長，長出白色的根。表7中可以看出，1/3ms培養基生根較早，生根率為86.67％，但平均生根條數和根的長度均較1/2ms和ms培養基的少和短，并且由于大量元素的不足，無菌苗莖稈細長葉片發黃，植株長勢不佳。1/2ms培養基的生根率最高，為90.0％，但平均生根條數低于ms培養基，且沒有側根形成。ms培養基的生根率較低，但無菌苗植株健壯，根較粗有側根形成，長勢良好。表7不同培養基對生根的影響以1/2ms培養基和ms培養基以及不同濃度的naa組合成10個處理(表8)，每個處理接種10瓶，每瓶3個外植體，25d后統計各處理的生根率、平均生根數、平均根長以及植株生長狀況。表8生根培養基中naa濃度添加量處理號1/2ms(mg/l)ms(mg/l)10.1-20.5-31.0-41.5-52.0-6-0.17-0.58-1.09-1.510-2.0不同濃度的naa對生根的影響如表9和圖3a、圖3b所示，以1/2ms為基本培養基時，隨著naa濃度的增加，無菌苗的生根率逐漸降低，最高94.44％，最低為61.11％；平均生根數逐漸升高，最低3.12，最高9.45；根長下降趨勢明顯，最長為4.0～4.5cm，最短1.5～2.0cm；以ms為基本培養基時，除生根率先升高后降低外，平均生根數、根長范圍的變化規律均與1/2ms培養基一致。結果表明，naa在調節沼澤小葉樺無菌苗生根過程中起著重要的促進所用，，但濃度高于1.0mg/l時，無菌苗基部愈傷較大，分化出大量的根，這些根呈短粗的錐形，土黃色或淺紅色，根尖紅色，暴露在培養基外部的根有絨毛，上部植株矮小，葉片枯黃，發育不良。控制naa濃度在0.1～0.5mg/l時促進單株生根，促進根長生長。表9不同濃度naa對生根的影響以ms為基本培養基，添加不同濃度的多效唑(表10)，研究多效唑對生根的影響。每個處理接種8瓶，每瓶3株無根苗，25d后統計各處理的生根率、平均生根條數、平均根長及植株生長狀況。多效唑對無菌苗生根的作用見表10和圖3c、圖3d，相對于零添加的ms培養基，0.25mg/l的多效唑對無菌苗生根具有促進作用，可使生根率達83.33％，平均生根數為3.40，根長稍短縮，為2.5～3.0cm。多效唑濃度增加，生根率呈逐漸降低至33.33％，根伸長減短至1.0cm以下，而已生根的無菌苗平均生根數變化規律不明顯。多效唑的應用，使得無菌苗植株節間短縮，株高生長不明顯，苗高在1.5～2.5cm間；每株3～6片葉不等，葉片生長受到抑制，較小較厚，葉色深綠；基部無愈傷組織形成，根較短較粗，呈均勻短棒形，隨時間的延長由米白色漸變為褐色或黑色，發生老化。表10不同濃度多效唑多生根的影響將優選的基本培養基和添加naa、多效唑的優選生根培養基進行差異顯著性分析如表11，添加naa的2、3、5、6號培養基的生根率與其他培養基差異顯著，生根率最高為97.30％；就平均生根比較，3、5、6、8號培養基明顯優于其他生根方法，平均生根最多的為8號處理，3.93，其次是6號處理平均生根3.83；多效唑的添加明顯抑制了根的伸長生長，最佳處理為添加naa的2、3、5、6號培養基。對比分析，得出最佳生根培養方法是6號處理，即ms+0.5mg/lnaa，獲得無菌苗植株健壯，株高5.0～6.0cm，葉片綠色，根星狀分布，白色，細長，部分有側根形成。表11優選生根培養基的對比分析編號生根方法生根率/％生根數(條)根長(cm)11/2ms90.00±2.36b2.78±0.65d3.75±0.54a21/2ms+0.1mg/lnaa94.44±2.21a3.12±0.11cd4.25±0.26a31/2ms+0.5mg/lnaa94.44±0.85a3.59±0.12abc4.25±0.42a4ms81.66±1.75c2.90±0.22d3.75±0.21a5ms+0.1mg/lnaa94.44±3.56a3.71±0.15ab4.25±0.39a6ms+0.5mg/lnaa97.30±1.46a3.83±0.14ab4.25±0.23a7ms+0.25mg/l多效唑83.33±3.00c3.40±0.64bc2.75±0.22b8ms+0.5mg/l多效唑77.78±1.04d3.93±0.13a1.25±0.23c當前第1頁12