本發明屬于生物植物組織培養、組織快繁技術領域，更具體地說，尤其涉及一種鐵皮石斛原球莖液體靜止懸浮培養快速增殖方法。
背景技術：
鐵皮石解是我國傳統的名貴中藥，具有很高的藥用價值。主要成分為石斛多糖和石斛堿，具有滋陰、益胃、生津止渴、潤肺止咳、強壯及增強免疫活性的作用，為南亞和東南亞地區著名的中草藥。早在1987年就被國務院列為二級保護野生植物。其加工品“西楓斗”是價格昂貴的出口藥材。由于鐵皮石斛生長環境特殊，自身繁殖困難，加上人們無休止地采挖以及自然生境的不斷喪失，導致野生鐵皮石斛愈來愈稀少，以瀕臨滅絕。因此對鐵皮石斛組培繁殖方法進行研究顯得十分必要。利用組織培養技術，對藥用鐵皮石斛進行快速繁殖，是目前解決生產種苗問題的有效方法。不僅對保護瀕危物種有重要意義，而且對發展藥用植物產業具有重要的現實價值。
目前，對石斛組織培養技術的研究與報道很多，其方法也多種多樣。組織培養獲取再生植株的方式主要有以下幾種：(1)種子→原球莖→小植株；(2)種子→原球莖→愈傷組織→叢芽→生根苗；(3)種子→原球莖→無菌苗莖段→小植株；(4)種子→愈傷組織→原球莖→小植株；(5)原球莖→人工種子→幼苗；(6)莖尖→愈傷組織→叢芽→生根苗等。但目前許多組培企業多采用固體培養基培養鐵皮石斛原球莖，其中主要凝固成分為瓊脂，市面上瓊脂價格在110-130元/kg左右，導致生產成本上升；其次固體培養基接種速度慢，導致人力成本上升。且固體培養基增殖石斛原球莖，增殖量小、周期長。一直是制約石斛組培企業及整個石斛產業鏈發展的瓶頸。
其一，某科研團隊建立了鐵皮石解原球莖增殖的液體懸浮培養體系。在名為“鐵皮石斛原球莖懸浮培養研究”的研究中，其技術方法為：首先在添加0.5mg/laba的1/4ms培養基里預培養30d，然后轉入1/4ms+40mg/lvc液體培養基，ph5.6，搖床轉速為50r/min，每15d繼代一次，黑暗培養。原球莖的質量提高、同步性好。無論鮮重還是干重，增長量都比較好。
其操作方案為：選活力強、均勻一致的鮮黃色原球莖稱重，置于裝有液體培養基(ph5.6)的4.5cm培養皿中，每皿接種50個原球莖，培養溫度為(25±1)℃，黑暗中培養，每10d換液一次，60d后，傾去培養液，稱鮮重和干重，同時統計原球莖的數量，并測量其長度。
該技術需要搖床震蕩培養，導致生產設備投入增加，能耗增加。培養鐵皮石斛原球莖的成本提升，且生產工藝繁瑣，嚴重阻礙了該技術的工業化發展。
其二，某科研團隊，在“鐵皮石斛原胚體液體懸浮培養條件”研究中報道，以鐵皮石斛種子誘導的原胚體為材料，在1/2ms+1.0mg/lnaa，ph5.6，蔗糖濃度為3％或含10％香蕉提取物上清液的液體培養基中增殖效果佳，可溶性多糖成分積累相對較高。其接種量為每20ml接種2g石斛原球莖。
其培養條件為：(溫度25±1)℃，光照10h/d，光照強度為60umol*m-2*s-1，轉速100r/min，50d繼代一次。
該技術同樣需要搖床震蕩培養，增加了設備投入及能耗，不利于企業的長遠發展，且培養基成分添加復雜，穩定性差，不可工業化生產。
但以上的設計中，都需要用到搖床震蕩培養，這不僅增加了生產設備的投入，而且增加了能耗、增加了生產環節，從而使生產成本上升，阻礙了液體懸浮培養這一技術的應用及工業化發展。
技術實現要素：
本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種鐵皮石斛原球莖液體靜止懸浮培養快速增殖方法在整個石斛原球莖液體懸浮培養過程中，無需搖床震蕩，完全是靜止培養，使鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養技術真正能走向產業化生產。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種鐵皮石斛原球莖液體靜止懸浮培養快速增殖方法，包括如下步驟：
s1、選擇原材料：采自云南文山廣南山區的自然授粉結實、成熟、未開裂的鐵皮石斛蒴果；
s2、材料消毒：對成熟未開裂蒴果進行消毒處理；
s3、接種：將消毒處理后的蒴果在無菌條件下，用鑷子夾緊果柄一端，用解剖刀將蒴果另一端切一小口，輕輕抖動，將種子均勻撒布在誘導種子萌發培養基上，立即蓋上瓶蓋，放在培養室進行培養；
s4、鐵皮石斛原球莖的選擇：選擇由鐵皮石斛種子誘導出的生長狀態良好、無分化、色澤鮮綠的原球莖為材料，在超凈工作臺里接種，接種原球莖直徑在0.3-0.5cm，質量1-3g為宜；
s5、采用石斛原球莖液體靜止懸浮培養，其培養基配方為:b5培養基+0.4-1.0g/l萘乙酸+50-100g/l土豆+20-30g/l蔗糖，ph值5.5-5.8；基本培養條件：溫度22-28℃,光照12-14h/d，光照強度為3000lx-4500lx，懸浮培養過程中使用150ml的三角燒瓶或玻璃培養瓶作為培養容器。
優選的，在s3中，誘導種子萌發培養基及培養條件：以ms基本培養基，附加瓊脂0.68％，6-芐基氨基嘌呤0.4-0.6mg/l、萘乙酸0.1-0.4mg/l、土豆80-100g/l、吲哚丁酸0.2-0.5mg/l、蔗糖20-30g/l；培養基ph值5.4～5.8；培養條件：溫度25～28℃，光照12h/d，光照強度2000lx。
優選的，在s5中，具體過程如下：
(1)配制b5基礎培養基母液，其中大量元素a為20倍濃縮；微量元素b為1000倍濃縮；鐵鹽c為100倍濃縮；有機d為1000倍濃縮；肌醇為500倍濃縮；
(2)以配制5l為列，選擇5l的量筒，先加入1l的水，然后依次按比例加入0.4-1.0g/l萘乙酸、50-100g/l土豆和20-30g/l蔗糖；
(3)加入土豆汁，土豆清洗后去皮，按配方稱取需要量，榨汁后過濾，去掉土豆渣及上層白沫；
(4)加完培養基成分后，加入去離子水，定容到5l，然后調ph值；
(5)按配方量裝瓶，封口后放入滅菌鍋，121℃高溫高壓濕熱滅菌20-25min；
(6)取出培養基，放入干凈、相對無菌的接種室，放置5-7天，待培養基無染菌現象后接種；
(7)在超凈工作臺里接種，培養基放入超凈工作臺前，用75％酒精霧噴消毒；
(8)把挑選好的鐵皮石斛原球莖，用滅過菌的鑷子夾碎成適當大小，轉接入液體懸浮培養基中，接種量為1-3g。
(9)封口，暗處理1-3天后，放入光照培養室培養。
優選的，在s2中，對成熟未開裂蒴果進行消毒處理方法為：成熟未開裂蒴果→自來水沖洗→75％酒精浸泡1min→0.1％升汞溶液浸泡15min→無菌水沖洗4次→無菌濾紙吸干后備用。
優選的，在s2中，對成熟未開裂蒴果進行消毒處理方法為：成熟未開裂蒴果→75％酒精表面擦拭→75％酒精浸泡1min→無菌濾紙吸干后備用。
本發明的技術效果和優點：本發明提供的一種鐵皮石斛原球莖液體靜止懸浮培養快速增殖方法，與傳統的技術相比，本發明使鐵皮石斛原球莖能高效、高質、低成本快速擴繁，為石斛苗組培企業提供充足的石斛球莖種源，滿足市場對鐵皮石斛的巨大需求，緩解鐵皮石斛瀕臨滅絕的危機；在整個液體懸浮培養過程中無需搖床震蕩培養，在生產設備投入和能耗上節約了大量資本，突破了鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養工業化生產技術瓶頸，有力推動了石斛組培企業及石斛相關產業的發展，可用于蘭科石斛屬的原球莖及類原球莖增殖，以達到快速擴繁和保種的目的。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1
一種鐵皮石斛原球莖液體靜止懸浮培養快速增殖方法，包括如下步驟：
s1、選擇原材料：采自云南文山廣南山區的自然授粉結實、成熟、未開裂的鐵皮石斛蒴果；
s2、材料消毒：對成熟未開裂蒴果進行消毒處理；成熟未開裂蒴果→自來水沖洗→75％酒精浸泡1min→0.1％升汞溶液浸泡15min→無菌水沖洗4次→無菌濾紙吸干后備用；
s3、接種：將消毒處理后的蒴果在無菌條件下，用鑷子夾緊果柄一端，用解剖刀將蒴果另一端切一小口，輕輕抖動，將種子均勻撒布在誘導種子萌發培養基上，立即蓋上瓶蓋，放在培養室進行培養；誘導種子萌發培養基及培養條件：以ms基本培養基，附加瓊脂0.68％，6-芐基氨基嘌呤0.4mg/l、萘乙酸0.1mg/l、土豆80g/l、吲哚丁酸0.2mg/l、蔗糖20g/l；培養基ph值5.4；培養條件：溫度25℃，光照12h/d，光照強度2000lx；
s4、鐵皮石斛原球莖的選擇：選擇由鐵皮石斛種子誘導出的生長狀態良好、無分化、色澤鮮綠的原球莖為材料，在超凈工作臺里接種，接種原球莖直徑在0.3-0.5cm，質量1-3g為宜；
s5、采用石斛原球莖液體靜止懸浮培養，其培養基配方為:b5培養基+0.4g/l萘乙酸+50g/l土豆+20g/l蔗糖，ph值5.5；基本培養條件：溫度22℃,光照12h/d，光照強度為3000lx，懸浮培養過程中使用150ml的三角燒瓶或玻璃培養瓶作為培養容器。
在s5中，具體過程如下：
(1)配制b5基礎培養基母液，其中大量元素a為20倍濃縮；微量元素b為1000倍濃縮；鐵鹽c為100倍濃縮；有機d為1000倍濃縮；肌醇為500倍濃縮；
(2)以配制5l為列，選擇5l的量筒，先加入1l的水，然后依次按比例加入0.4-1.0g/l萘乙酸、50-100g/l土豆和20-30g/l蔗糖；
(3)加入土豆汁，土豆清洗后去皮，按配方稱取需要量，榨汁后過濾，去掉土豆渣及上層白沫；
(4)加完培養基成分后，加入去離子水，定容到5l，然后調ph值；
(5)按配方量裝瓶，封口后放入滅菌鍋，121℃高溫高壓濕熱滅菌20-25min；
(6)取出培養基，放入干凈、相對無菌的接種室，放置5-7天，待培養基無染菌現象后接種；
(7)在超凈工作臺里接種，培養基放入超凈工作臺前，用75％酒精霧噴消毒；
(8)把挑選好的鐵皮石斛原球莖，用滅過菌的鑷子夾碎成適當大小，轉接入液體懸浮培養基中，接種量為1-3g。
(9)封口，暗處理1-3天后，放入光照培養室培養。
實施例2
一種鐵皮石斛原球莖液體靜止懸浮培養快速增殖方法，包括如下步驟：
s1、選擇原材料：采自云南文山廣南山區的自然授粉結實、成熟、未開裂的鐵皮石斛蒴果；
s2、材料消毒：對成熟未開裂蒴果進行消毒處理；成熟未開裂蒴果→75％酒精表面擦拭→75％酒精浸泡1min→無菌濾紙吸干后備用；
s3、接種：將消毒處理后的蒴果在無菌條件下，用鑷子夾緊果柄一端，用解剖刀將蒴果另一端切一小口，輕輕抖動，將種子均勻撒布在誘導種子萌發培養基上，立即蓋上瓶蓋，放在培養室進行培養；誘導種子萌發培養基及培養條件：以ms基本培養基，附加瓊脂0.68％，6-芐基氨基嘌呤0.5mg/l、萘乙酸0.3mg/l、土豆90g/l、吲哚丁酸0.3mg/l、蔗糖25g/l；培養基ph值5.6；培養條件：溫度26℃，光照12h/d，光照強度2000lx；
s4、鐵皮石斛原球莖的選擇：選擇由鐵皮石斛種子誘導出的生長狀態良好、無分化、色澤鮮綠的原球莖為材料，在超凈工作臺里接種，接種原球莖直徑在0.4cm，質量2g為宜；
s5、采用石斛原球莖液體靜止懸浮培養，其培養基配方為:b5培養基+0.8g/l萘乙酸+80g/l土豆+25g/l蔗糖，ph值5.6；基本培養條件：溫度26℃,光照13h/d，光照強度為3800lx，懸浮培養過程中使用150ml的三角燒瓶或玻璃培養瓶作為培養容器。
在s5中，具體過程如下：
(1)配制b5基礎培養基母液，其中大量元素a為20倍濃縮；微量元素b為1000倍濃縮；鐵鹽c為100倍濃縮；有機d為1000倍濃縮；肌醇為500倍濃縮；
(2)以配制5l為列，選擇5l的量筒，先加入1l的水，然后依次按比例加入0.8g/l萘乙酸、80g/l土豆和25g/l蔗糖；
(3)加入土豆汁，土豆清洗后去皮，按配方稱取需要量，榨汁后過濾，去掉土豆渣及上層白沫；
(4)加完培養基成分后，加入去離子水，定容到5l，然后調ph值；
(5)按配方量裝瓶，封口后放入滅菌鍋，121℃高溫高壓濕熱滅菌20-25min；
(6)取出培養基，放入干凈、相對無菌的接種室，放置5-7天，待培養基無染菌現象后接種；
(7)在超凈工作臺里接種，培養基放入超凈工作臺前，用75％酒精霧噴消毒；
(8)把挑選好的鐵皮石斛原球莖，用滅過菌的鑷子夾碎成適當大小，轉接入液體懸浮培養基中，接種量為2g。
(9)封口，暗處理1-3天后，放入光照培養室培養。
綜上所述：在鐵皮石解原球莖增殖培養過程中，在相同外界條件下，無論從生物量還是多糖產量上看，液體懸浮培養均優于固體培養基培養。其原因可能是液體培養一方面能使外植體充分接觸培養基，供給充足的養分，使芽數多，增殖迅速，增殖指數高于固體培養。同時在液體懸浮培養時，用細胞培養技術對鐵皮石解原球莖多糖的生產進行生理生化調控已取得初步成果，懸浮培養的原球莖多糖含量可達20.1％，與野生鐵皮石解多糖接近。以上研究表明通過液體懸浮培養生產鐵皮石解原球莖從而提取石解多糖相對于固體培養具有很大的優勢，而且從液體懸浮培養原球莖中提取石解多糖取代原藥材提取具有可行性。滿足藥材市場的需求，提高效率，以組織培養物代替其原植株成為可能。藥源是解決鐵皮石解對野生和栽培依賴的有效途徑之一。
通過植物細胞工程的手段進行人參、紫草、雪蓮等藥用植物的工業化生產已經初步獲得成功，并產生了可觀的經濟效益和良好的社會效益，尤其是鐵皮石解的組培快繁中存在著組培苗生產成本高、移栽苗成活率低、標準化生產程度低等技術瓶頸，所以通過液體懸浮培養大規模地生產鐵皮石解的原球莖是解決鐵皮石解資源緊缺、栽培困難等問題的有效途徑，具有廣闊的應用前景。
最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換,凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。