本發明涉及一種腫瘤組織冷凍方法。

背景技術：

腫瘤表面標志物是腫瘤細胞生長過程中產生的一種特異性物質，或因細胞病變而過量表達的細胞成分，病理診斷及分型可為腫瘤治療提出合理化方案，因此在改變治療方案時，應參考已有病理結果或重新進行其他方面的病理檢測分析。目前研究的腫瘤治療性疫苗很多，在臨床研究活躍，至2017年1月，美國clinicaltrials.gov網站已登記有1862項臨床研究，其中中國共有71項。能夠在體內介導強烈的抗腫瘤效應的治療型疫苗主要包括：1)重組的腫瘤相關抗原(taa)，有短的合成多肽的組合或全長的蛋白，前者需結合到抗原提呈細胞apc表面的mhc分子上，直接提呈給t細胞，后者需被apc攝取加工后再提呈；2)腫瘤細胞或其裂解物，其中含有taa或與伴侶分子(如熱休克蛋白)復合的taa；3)編碼taa的載體疫苗，包括裸dna、rna和病毒為載體；4)樹突狀細胞(dendriticcell，dc)為基礎的疫苗，包括體外荷載taa融合蛋白的dc。

低溫保護劑的種類按照是否能滲透到細胞內通常將其分為滲透性和非滲透性兩種。滲透性保護劑主要有二甲基亞砜、甘油、丙二醇、乙二醇等等。其特性在于保護劑的小分子結構在溶液中易結合水分子發生水合作用，增加溶液的黏性，從而在降溫的過程中減緩水分子結晶形成，減小“胞內冰晶損傷”，來達到保護細胞、組織的目的。非滲透性冷凍保護劑主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、羥乙基淀粉等等。乙烯吡咯烷酮、羥乙基等為大分子非滲透性物質，雖能溶于水但不能自由進出細胞，其加入到溶液后可以使溶液呈過冷狀態，抑制冰晶形成。可以使特定溫度電解質的濃度降低，減小溶質損傷，并通過改變滲透壓引起細胞脫水減小胞內冰晶形成，從而起到保護作用。在降溫過程中，此類保護劑主要與滲透性保護劑聯合使用，促使細胞完成脫水，同時可以減少滲透性保護劑的使用濃度來減少毒性損害。復溫時，其可以提供一個高滲透壓的環境，防止過多水分進入細胞太快而引起細胞膨脹損傷。白蛋白也是一種常用的非滲透性抗凍劑。

目前，研究者們仍在不斷的研究動物細胞和組織的凍存方法及凍存技術，從種類繁多的保護劑中挑選最優保護劑的種類并研究其配比濃度以及導入、洗脫方法。降溫前要將保護劑導入到組織內，復溫后需要將其洗脫出來，在導入、洗脫過程中，由于細胞膜外溶液濃度的變化造成細胞脫水或腫脹超過一定限度時，會造成組織不可逆損傷，因此在深低溫保存過程中，保護劑的導入和洗脫對組織細胞活性起著重大作用。目前研究中，凍存較多的為質地柔軟的卵巢癌、結腸癌等腫瘤組織、脂肪組織及臍帶華通氏膠組織，凍存液主要為dmso、胎牛血清及培養基按不同配的比混合液，該方法凍存的腫瘤組織一般在凍存半年后細胞活性即開始出現顯著降低現象，主要表現為成瘤率低，僅為50％-70％。這就限制了有計劃地進行經常研究及臨床應用，因而有必要尋找一種能長期保存新鮮標本并保持其生物學特性的方法，從而實現不同質地腫瘤組織的高活性。

技術實現要素：

本發明是要解決現有的組織凍存方法導致復蘇后腫瘤細胞活性顯著降低，成瘤率低的問題，提供一種腫瘤組織塊深低溫冷凍方法。

本發明腫瘤組織塊深低溫冷凍方法，包括以下步驟：

一、凍存液的配制：

用dmem將人血白蛋白(hsa)凍干粉配制成質量濃度為10％～40％的人血白蛋白溶液，用dmem將羥乙基淀粉(hes)配制成質量濃度為15％～25％的羥乙基淀粉溶液，用dmem將乙二醇(eg)配制成質量濃度為20％～30％的乙二醇溶液，三種溶液分別用0.22μm濾器無菌條件下過濾備用；

然后將人血白蛋白溶液、羥乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亞砜(dmso)按體積比為(25-30)：(10-15)：(8-12)：(1-1.5)比例混合，得到凍存液，4℃預冷備用。

二、組織塊的處理：

將腫瘤組織塊用含雙抗的hank’s液漂洗后，用不含雙抗的生理鹽水洗滌組織2～3次，用手術剪剪碎至1～2mm³的塊狀，然后加入步驟一配好的凍存液重懸組織塊，按每管1ml分裝到凍存管中；

先于4℃平衡50min，使dmso滲入組織，然后采用程控降溫儀降溫，具體為：20℃/min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升溫至-20℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接著以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃長期保存。

三、凍存腫瘤組織塊復蘇：

凍存12～24個月后，將凍存管從液氮中取出于37～38℃水浴快速解凍，凍存管內剩余1～2mm³冰塊時停止水浴；取無菌的離心管，加入4℃預冷dmem后將解凍后的組織塊加入離心管中，4℃，1500～2000rpm離心5～10min后棄上清，用含3％～10％人血白蛋白的pbs洗滌組織兩次后重懸組織于pbs中用于相關驗證實驗。

進一步的，步驟二中含雙抗的hank’s液為含有100u/ml氨芐青霉素和100g/ml鏈霉素的hank’s液。

本發明的有益效果：

(1)細胞發生癌變后往往出現異型細胞，即細胞大小不一，形狀不規則，細胞核增大，核漿比例增大，核分裂象增多，甚至有病理性核分裂，細胞極性紊亂等，因此，凍存時凍存液需選擇毒性極低，滲透損傷較小的配方，且凍存復蘇需選擇較柔和、舒緩的方法，這樣才能保證組織中各種異型細胞均保持最佳狀態。另外軟組織凍存時，凍存液容易接觸內部細胞，較易凍存，硬組織需要保證凍存液的滲透，因此需要將組織處理更小一些，且需要加入小分子滲透性凍存劑。

(2)本發明利用滲透性和非滲透性凍存保護劑結合的方法進行腫瘤組織凍存，同時對試劑的配制比例進行優化，使凍存液中dmso的比例降低到2％，降低了組織細胞毒性，對凍存后的組織起到很好的保護作用，凍存12～24個月，腫瘤組織復蘇后具有較高的小鼠成瘤性，成瘤率達到90％以上(而現有常規方法的凍存腫瘤組織，復蘇后成瘤率僅為50％～70％)。

(3)將腫瘤組織切割并剪碎至1-2mm³大小，使凍存液更易接觸滲入組織中的細胞，使細胞內水分脫出，在冷凍過程中可更好的保護組織細胞的活性。復蘇時，組織中細胞受熱均勻，且容易去除滲入的凍存液，有助于維持組織中細胞活力。

(4)本發明的復溫、洗脫方法為：37℃水浴快速解凍，待組織凍存液融化至剩余約1mm³冰塊時停止水浴，以減少組織內外成分的快速置換，同時組織洗滌時向pbs中加入終濃度為5％的人血白蛋白，以減少洗滌過程中細胞膜內外滲透壓差所引起細胞滲透性損傷。

(5)本發明中包含了凍存及復溫的整套的腫瘤組織塊深低溫冷凍技術，整套技術的應用有利于保護劑的導入和洗脫，對組織細胞活性起著重大作用。本發明利用質地較硬的腫瘤組織進行實驗，因此該方法同樣適用于質地較軟的腫瘤組織，該方法保存的腫瘤組織塊具有與新鮮組織類似的分子水平特征及細胞擴增能力，復蘇擴增后可進行腫瘤診斷及治療方面的應用。

附圖說明

圖1為rt-pcr對內參基因β-actin的檢測結果；

圖2為western對內參基因β-actin的檢測結果。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式腫瘤組織塊深低溫冷凍方法，包括以下步驟：

一、凍存液的配制：

用dmem將人血白蛋白凍干粉配制成質量濃度為10％～40％的人血白蛋白溶液，用dmem將羥乙基淀粉配制成質量濃度為15％～25％的羥乙基淀粉溶液，用dmem將乙二醇配制成質量濃度為20％～30％的乙二醇溶液，三種溶液分別用0.22μm濾器無菌條件下過濾備用；

然后將人血白蛋白溶液、羥乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亞砜按體積比為(25-30)：(10-15)：(8-12)：(1-1.5)比例混合，得到凍存液，4℃預冷備用；

二、組織塊的處理：

將腫瘤組織塊用含雙抗的hank’s液漂洗后，用不含雙抗的生理鹽水洗滌組織2～3次，用手術剪剪碎至1～2mm³的塊狀，然后加入步驟一配好的凍存液重懸組織塊，按每管1ml分裝到凍存管中；

先于4℃平衡50min，使dmso滲入組織，然后采用程控降溫儀降溫，具體為：20℃/min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升溫至-20℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接著以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃長期保存；

三、凍存腫瘤組織塊復蘇：

凍存12～24個月后，將凍存管從液氮中取出于37～38℃水浴快速解凍，凍存管內剩余1～2mm³冰塊時停止水浴；取無菌的離心管，加入4℃預冷dmem后將解凍后的組織塊加入離心管中，4℃，1500～2000rpm離心5～10min后棄上清，用含3％～10％人血白蛋白的pbs洗滌組織兩次后重懸組織于pbs中用于相關驗證實驗。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中制成質量濃度為20％～30％的人血白蛋白溶液。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一中制成質量濃度為18％的羥乙基淀粉溶液。其它與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：步驟一中制成質量濃度為25％的乙二醇溶液。其它與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟一中將人血白蛋白溶液、羥乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亞砜按體積比為25：14：10：1比例混合。其它與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟三中用含5％人血白蛋白的pbs洗滌組織。其它與具體實施方式一至五之一相同。

下面對本發明的實施例做詳細說明，以下實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方案和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

試驗1：本試驗進行凍存液的配制及三種腫瘤組織塊的凍存：

一、凍存液的配制：

用dmem將人血白蛋白凍干粉配制成濃度為20％人血白蛋白溶液，將羥乙基淀粉配制成濃度為18％的羥乙基淀粉溶液，將乙二醇配制成25％的乙二醇溶液，三種溶液分別用0.22μm濾器無菌條件下過濾備用；

將人血白蛋白溶液、羥乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亞砜按體積比為25：14：10：1比例混合，得到凍存液，4℃預冷備用。

二、組織塊的處理：

將腫瘤組織塊用含雙抗的hank’s液漂洗后，用不含雙抗的生理鹽水洗滌組織兩次，用手術剪剪碎至1-2mm³的塊狀；加入配好的凍存液重懸組織塊，然后按每管1ml分裝到凍存管中；先于4℃平衡50min，使dmso滲入組織，然后采用程控降溫儀降溫，具體為：20℃/min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升溫至-20℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接著以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃長期保存。所述腫瘤組織塊為乳腺癌組織、胰腺癌組織和肝癌組織。

試驗2：本試驗進行組織塊的復蘇及生物大分子完整性、腫瘤形成率檢測

一、凍存腫瘤組織塊復蘇：

凍存12個月后，將三種組織的凍存管從液氮中取出于37℃水浴快速解凍，凍存管內剩余約1mm³冰塊時停止水浴；取無菌的離心管，加入4ml4℃預冷dmem后將解凍后的的組織塊加入其中，4℃，1500rpm離心5min后棄上清，含5％人血白蛋白pbs洗滌組織兩次后重懸組織于pbs中用于相關驗證實驗。

二、rt-pcr進行mrna完整性檢測

凍存12個月后，取三種復蘇后的腫瘤組織各0.1g，液氮中進行研磨成粉末后轉入1.5mlep管，并加入1mltrizol于冰上裂解15min，4℃12000rpm15min離心取上清，用氯仿抽提后將上層的透明水相轉移至另外的ep管中，用500μl異丙醇沉淀rna，12000rpm15min離心后用75％乙醇洗滌2次，用rnase-freewater溶解管底的沉淀，用核酸分析儀測定所提取的總rna的純度和濃度；利用總rna為模板，根據m-mlv逆轉錄酶的說明書進行cdna第一鏈的合成，以下列引物進行β-actin內參基因的pcr反應，驗證mrna完整性。

上游：5’-ctgtccctctacgcctctg-3’

下游：5’-ggcggtgatctccttctg-3’

三、westernblotting進行蛋白完整性檢測

凍存12個月后，取三種復蘇后的腫瘤組織各0.1g，液氮中進行研磨成粉末后轉入1.5mlep管中，加入1ml組織裂解液于冰上裂解10min，4℃12000rpm5min離心取上清進行sds-page電泳分離。采用濕轉法(恒流，230ma)將凝膠上的蛋白轉移至膜上。將膜置于5％的脫脂牛奶室溫封閉2h后，分別用1：500稀釋的兔抗人β-actin抗體4℃輕搖孵育過夜，pbs洗膜3次，10min/次。再用羊抗兔hrp-二抗37℃孵育1h，pbs洗膜3次，10min/次。用化學發光底物檢測試劑檢測反應信號。

四、建立pdtt移植瘤模型，操作步驟如下：

將4周齡的balb/c裸鼠于spf級屏障環境中飼養，并適應環境三天以上，每種腫瘤組織模型動物各30只；將動物用戊巴比妥鈉麻醉，背部皮膚消毒，無菌棉球擦干后在裸鼠一側的肋部切開一小口，18號穿刺針頭鈍性分離皮膚與皮下，使成一皮帶，將準備好的腫瘤碎片用12g套管針送入其中，切口滴加一滴雙抗(100×青霉素/鏈霉素)；每天觀察腫瘤生長狀況，并且每周用游標卡尺測定瘤體體積，三個月后剝離瘤體計算成瘤率；

對照組與實驗組的操作相同，只是對照組將凍存液更換為常規凍存液，具體配方為：10％dmso、10％fbs、80％dmem；對照組凍存管從液氮中取出于37℃水浴快速解凍，凍存液完全融化后停止水浴，同時組織洗滌時的pbs中不加入人血白蛋白。

結果如下：

(一)mrna完整性檢測

圖1為rt-pcr對內參基因β-actin的檢測結果，m代表dl2000marker，a1代表對照組中乳腺癌檢測結果，b1代表對照組中胰腺癌檢測結果，c1代表對照組中肝癌檢測結果，a2代表實驗組中乳腺癌檢測結果，b2代表實驗組中胰腺癌檢測結果，c2代表實驗組中肝癌檢測結果。觀察圖中條帶面積及亮度可知，兩組中的各腫瘤組織均具有較好的mrna完整性，且實驗組的pcr結果優于對照組。

(二)蛋白完整性檢測

圖2為western對內參基因β-actin的檢測結果，a1代表對照組中乳腺癌檢測結果，b1代表對照組中胰腺癌檢測結果，c1代表對照組中肝癌檢測結果，a2代表實驗組中乳腺癌檢測結果，b2代表實驗組中胰腺癌檢測結果，c2代表實驗組中肝癌檢測結果。觀察圖中條帶面積可知，兩組中的各腫瘤組織均具有較好的蛋白完整性，且實驗組中乳腺癌與胰腺癌的檢測結果較對照組更好，說明本研究的腫瘤組織凍存及復蘇技術有利于保持組織中蛋白完整性，利于腫瘤特異性物質的保存。

(三)pdtt移植瘤模型對組織成瘤率的檢測

表1為各腫瘤組織的裸鼠pdtt移植瘤模型研究結果，a1代表對照組中乳腺癌檢測結果，b1代表對照組中胰腺癌檢測結果，c1代表對照組中肝癌檢測結果，a2代表實驗組中乳腺癌檢測結果，b2代表實驗組中胰腺癌檢測結果，c2代表實驗組中肝癌檢測結果。由表中數據可知，凍存一年時，對照組中各腫瘤組織的成瘤率較低，說明其凍存復蘇后組織細胞的成活率較低，該凍存方法凍存對組織傷害較大，不宜于長期組織凍存；實驗組中各腫瘤組織的成瘤率明顯高于對照組且均高于90％，說明該方法可以更好的保護組織免受環境變化影響，能夠對組織進行長期凍存。

表1

序列表

<110>黑龍江天晴干細胞股份有限公司

<120>一種腫瘤組織塊深低溫冷凍方法

<160>2

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mrna完整性驗證的上游引物。

<400>1

ctgtccctctacgcctctg19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mrna完整性驗證的下游引物。

<400>2

ggcggtgatctccttctg18