本發明涉及農作物育種及制種領域，具體地說，涉及一種利用水稻隱性畸形穎殼恢復系制種混收并分離雜交種子的方法。

背景技術：

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球一半以上的人口以大米為主食，稻谷的產量關系到世界的糧食安全。自1973年雜交水稻成功實現三系配套以來，雜交水稻的大面積推廣應用為中國乃至世界糧食安全作出了重要貢獻(袁隆平.(2002).雜交水稻學.中國農業出版社.前言.)。但雜交水稻只能利用雙親雜交第一代(f1)，必須年年制種才能保證大田生產用種。傳統雜交水稻制種環節多、工序繁雜、勞動強度大，屬于勞動密集型產業。隨著社會的發展，中國農村勞動力日益缺乏，且價格不斷上漲，雜交水稻的制種成本也隨之上漲。業內比較公認的看法是，進一步提高機械化水平、提高效率、降低成本是未來雜交水稻制種發展的趨勢。

目前，主要有3種可提高雜交水稻制種機械化水平的方法：一是恢復系、不育系分開種植，利用機械收集恢復系花粉為不育系授粉，可單獨收獲雜交種子。此種方法制種最自由，但水稻花粉保持活力的時間很短，技術難度極大，短時期內難以實現；二是恢復系、不育系大廂種植，收割機可分開收獲雜交種子與恢復系。此種方法較為簡便，但恢復系所占比例過大，降低了不育系的比例，且恢復系、不育系距離較遠授粉難度較大，制種產量較低；三是恢復系、不育系混種，利用機械混收雜交種子與恢復系種子，然后再通過機械將雜交種子分離出來。利用恢復系、不育系在某些性狀上的顯著差異，雜交種子和恢復系種子可實現分離。此種方法較為復雜，但不育系比例高，恢復系、不育系距離近且分布均勻，有利于提高制種產量，是目前提高雜交水稻機械化制種水平的較好途徑(王杰,鄧華鳳,張武漢,孫平勇,何強.(2013).雜交水稻機械化制種技術的研究現狀與發展策略.安徽農業科學,41(13):5682-5683.)。

近年來，在實現雜交種子和恢復系種子可分離方面取得了較為豐碩的研究成果。比如，國內科研人員提出了基于雙親在除草劑抗性、穎殼顏色等性狀上的差異實現雜交種子和恢復系種子分離的技術策略。但到目前為止，生產上大面積推廣應用的尚未見報道。這主要是由于以下2個方面的原因：一是這些技術的配套要求高，短時間內難以達到。比如，種子色選機需要較大的投入，相關技術研究需要一定的時間；二是技術本身存在一定的缺陷。比如，授粉后的恢復系對除草劑有一定的抗性，而且同一株水稻上籽粒成熟有先后，植株被殺死時可能有少量種子可以發芽，從而影響雜交種子純度。因此，迫切需要一種能夠與現有種子加工相結合、不需要增添新的機械就能完成雜交種子和恢復系種子分離的機械化制種技術。

技術實現要素：

本發明的目的是解決現有技術存在的不足之處，提供一種制種混收雜交種子可分離的水稻恢復系選育方法及其應用。

本發明的技術方案如下：

本發明首先提供了一種利用水稻隱性畸形穎殼恢復系制種混收并分離雜交種子的方法，包括如下步驟：

(1)選育出綜合性狀優良且具有畸形穎殼性狀的恢復系；

所述畸形穎殼性狀由隱性單基因或寡基因控制；

(2)以步驟(1)選育得到的恢復系為父本，以生產上大面積應用或新選育的不育系為母本，進行廣泛測交，選育出通過省級或國家審定的親本組合；

(3)以所述恢復系作父本，以步驟(2)得到的相應不育系作母本，將二者種子進行混播/混插/混拋，雜交種子成熟后和恢復系種子混收，在種子精選加工過程中去除畸形穎殼的恢復系種子。

進一步地，步驟(1)所述恢復系為通過遺傳改良方法創制出，綜合性狀優良，可直接在生產上應用的的畸形穎殼恢復系。

其中，所述遺傳改良方法包括但不限于雜交、回交、誘變或基因組編輯。

作為優選，當步驟(1)中利用雜交或回交手段選育恢復系時，以隱性單基因或寡基因控制的畸形穎殼材料為供體，通過雜交或回交選育出綜合性狀優良且具有畸形穎殼性狀的恢復系。

作為優選，步驟(3)中，混播/混插/混拋的制種田穗數比例為優良恢復系:不育系＝1:4～1:30。

進一步地，步驟(3)中，待水稻抽穗揚花后，利用人力、無人機或自然風力由恢復系給不育系授粉。

本發明進一步的提供了所述方法在制備水稻雜交種子方面的應用。

本發明涉及到的操作如無特殊說明均為本領域常規操作。

在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發明的有益效果在于：

(1)本發明采用的恢復系具有由隱性基因控制的畸形穎殼性狀，不會對雜交種子及商品糧的穎殼性狀產生影響。同時，在種子的正常精選加工過程中恢復系種子得以巧妙去除，不需要增加新的設備，可節約成本；

(2)本發明采用的畸形穎殼性狀由單基因或寡基因控制，有利于降低育種難度，提高育種效率；

(3)本發明可與現有制種技術體系無縫銜接，有利于簡化雜交種子和恢復系種子混收的制種技術體系。

附圖說明

圖1為隱性畸形穎殼突變體(bls1)穗及籽粒圖。

圖2為隱性畸形穎殼突變體(bls1)散粉圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

本發明優選畸形穎殼水稻恢復系的選育及其在混收式水稻制種過程中的應用，該應用的具體方法為：首先通過雜交、回交或誘變、基因組編輯等遺傳改良方法，選育出綜合性狀優良、具有由隱性基因控制的畸形穎殼恢復系，利用此恢復系與不育系廣泛測交，選育出通過省級或國家審定的組合。制種時，將選育組合的恢復系、不育系種子混播或混插(拋)，利用人力、無人機或自然風力授粉，雜交種子成熟后和恢復系種子混收，在種子精選加工過程中去除具有畸形穎殼的恢復系種子，從而完成制種過程。

經上述應用后混收得到的雜交種子純度一般在98％以上，可達我國規定的二級種子96％以上的基本要求。

實施例1恢復系的選育

通過雜交、回交或誘變、基因組編輯等遺傳改良方法，選育出綜合性狀優良、具有由隱性基因控制的畸形穎殼優良恢復系。水稻中畸形穎殼資源比較豐富，本發明優選為單基因控制的隱性性狀，有利于降低育種難度。如本發明優選的bls1三角穎突變體(xiaodingma等.beaklikespikelet1isrequiredforlateraldevelopmentoflemmaandpaleainrice.plantmolecularbiologyreporter,2013,31(1):98-108)，bls1突變體的特點是穎殼高度開裂、千粒重大幅降低(千粒重降至野生型的一半左右，約12g)，但花粉數量、活力以及散粉習性較好，對不育系的授粉能力較強。

以具有隱性畸形穎殼性狀的水稻資源作親本，與其它優良恢復系(如華占、揚稻6號等)、常規稻(如黃華占、五山絲苗等)或育種中間材料進行雜交、回交，利用常規育種方法可從雜交、回交后代中選育出綜合性狀優良但具有畸形穎殼的恢復系。

或者利用誘變方法，如物理誘變、化學誘變或物理化學誘變復合處理生產上大面積應用的優良恢復系(如華占、揚稻6號等)，從大群體中篩選具有隱性畸形穎殼性狀的優良恢復系。這種方法的缺點是突變方向和頻率不可控，只能依靠擴大群體來增加獲得目標突變體的可能性；優點是一旦獲得目標突變體，可快速在生產上推廣應用。

也可利用基因組編輯的方法，選用優良恢復系(如華占、揚稻6號等)、常規稻(如黃華占、五山絲苗等)或育種中間材料，對本發明優選的三角穎基因bls1(loc_os02g56610)進行敲除。然后通過自交篩選或與野生型雜交、自交篩選去除轉基因成分，從而育成不攜帶轉基因成分，同時具有畸形穎殼性狀的優良恢復系。該技術成熟高效，大部分從事生物技術研究的實驗室均可順利完成。而且，目前已經有生物技術公司提供此方面的商業服務，如武漢伯遠生物科技有限公司等。

總之，本發明選育的恢復系除了具有隱性基因控制的畸形穎殼性狀外，與目前雜交水稻育種上主流的恢復系選育方法并無其它差異。因此，對本領域內的技術人員來說，實施本發明時可操作性強，而且可根據實際情況選用切實可行的技術路線。

實施例2組合選育過程

首先利用實施例1選育的恢復系進行廣泛測交、品比，篩選出比對照(不同生態區、不同熟期的對照不同，一般以當地同類型主栽品種為對照)在產量、米質、抗性上有改良、達到審定要求(每個省及生態區均有相關規定，并且不斷修正)的新組合。然后，經過相應程序后，進入省級或國家級區域試驗。經2～3年試驗并達到相應標準后，通過省級或國家級審定。

需要說明的是，品種審定制度本身在不斷的更新、完善。2014年，國家農作物品種審定委員會下發了《國家級水稻玉米品種審定綠色通道試驗指南》，符合相關資質的種子企業可以自行開展自有品種區域試驗、生產試驗，進一步拓展了品種審定的渠道，更有利于滿足市場需求。對本領域內的技術人員來說，這是眾所周知和必須遵循的，本發明并沒有例外和特殊之處。

總之，本發明的組合選育與目前主流的組合選育方法及程序并無差異。由于水稻是中國主要農作物之一，國家規定必須通過審定才能在生產上應用。因此，本步驟也是必不可少的，但對本領域內的技術人員來說，實施本步驟并無新的技術難題，故本實施例對此不再詳細說明。

實施例3制種過程

以恢復系作為父本，不育系作為母本。

一、恢復系、不育系混播混收型

當恢復系、不育系播差期＜3天時，可通過水分調節、催芽控制等措施達到雙親花期理想相遇。水分調節主要是針對恢復系、不育系對缺水的敏感性存在差異進行。若恢復系早于不育系，可在1期至3期控水曬田，控制恢復系發育；若不育系早于恢復系，則在此1期至3期灌水，促進恢復系生長發育。一般可調節推遲或提早2～3d。催芽控制采取生育期短的親本不催芽、生育期長的親本催芽等措施，可以微調雙親在播始歷期上存在的差異。如果恢復系、不育系抽穗揚花完美相遇，不需要進行花期調節，是最理想的。恢復系和不育系在育秧或直播時就可均勻混播，一方面可省工節本，另一方面可使恢復系在不育系群體中的分布更加均勻，有利于授粉提高結實率。栽培方面，接近普通水稻栽培。如果是通過育秧方式，利用機械插秧技術可降低成本；如采用直播方式，注意苗期草害的防治，勤曬田扎深根防倒伏。注意氮磷鉀肥的配合使用，不要過多施用氮肥。根據恢復系、不育系特征特性和當地生態條件，有針對性防治病蟲草害。恢復系、不育系抽穗揚花后，分1～3次噴施“920”。每天10:00-13:00趕粉2～4次，每次趕粉能觀察到較為明顯的“粉霧”。本類型較為理想，省工節本，尤其是采用直播-自然風力趕粉-機械混收分離模式，成本接近于普通水稻種植。

二、恢復系、不育系混插(拋)混收型

當10天＞恢復系、不育系播差期＞3天時，必須通過錯期播種才能達到雙親花期理想相遇，但可以混插或混拋。恢復系、不育系錯期育秧，選擇合適的時機插秧或拋秧。人工插秧，較容易實現混插；機械插秧，需要對機械進行一定的改良，使機械能栽插20～30天的秧苗。另一方面，根據需要在插秧時放置合適比例(恢復系:不育系為1:1～24)的恢復系秧苗，使其在制種群體中比例適宜、分布均勻。混插(拋)可使恢復系在不育系群體中的分布均勻，有利于授粉提高結實率。栽培方面，注意氮磷鉀肥的配合使用，不要過多施用氮肥。根據恢復系、不育系特征特性和當地生態條件，有針對性防治病蟲草害。恢復系、不育系抽穗揚花后，分1～3次噴施“920”。每天10:00-13:00趕粉2～4次，每次趕粉能觀察到較為明顯的“粉霧”。

三、恢復系、不育系分插混收型

當恢復系、不育系播差期＞10天時，必須通過錯期播種、分開栽插才能達到雙親花期理想相遇。恢復系、不育系分開栽插，接近常規雜交水稻制種技術。但考慮到本技術可實現混收分離，恢復系可均勻分布于制種田中。如常規制種技術中，恢復系在不育系廂面的兩側；利用本發明制種，可將恢復系移栽至母本廂面中間均勻分布。栽培方面，注意氮磷鉀肥的配合使用，不要過多施用氮肥。根據恢復系、不育系特征特性和當地生態條件，有針對性防治病蟲草害。恢復系、不育系抽穗揚花后，分1～3次噴施“920”，每天10:00-13:00趕粉2～4次，每次趕粉能觀察到較為明顯的“粉霧”。

由于本發明的恢復系種子穎殼畸形、裂穎，種子發育不良，發芽率、成苗率均不及普通種子。這一方面有利于防雜，即使有少量恢復系種子混雜在雜交種子中，發芽成苗率低；但另一方面，在制種時容易導致恢復系苗數不夠。因此，要盡量使用新收獲恢復系種子，同時加大用量2～3倍。為了防止爛種，播種時使用多菌靈等內吸性殺菌劑浸種。少浸多露，直播時田間不淹水，保持透氣性良好，提高恢復系發芽率、成苗率。由于不育系的千粒重、發芽率在不同組合、不同年份間存在差異，因此，以制種田恢復系、不育系的穗數比例來研究是恰當的。研究表明，一般混播/混插/混拋的制種田穗數比例為優良恢復系:不育系＝1:4～1:30。本領域技術人員可根據恢復系、不育系的千粒重、發芽率及小面積試驗結果選用最佳比例。

實施例3雜交種子的分離

待制種田不育系上所結雜交種子成熟后即可收獲。種子收獲后利用種子精選設備去除穎殼開裂、畸形的恢復系種子，如一次篩選后還有少量殘余，可通過增加分選次數提高雜交種子純度。

水稻種子精選設備主要根據其籽粒的形狀和比重的原理，分為風篩選和比重選兩種精選設備，一般加工過程中先經過風篩選設備去除雜質和空癟粒，再經過比重選設備去除比重不一致的雜質。風篩選設備一般設置三層篩片，因恢復系種子穎殼開裂，籽粒發育不正常，形狀較正常種子小，所以在經過篩片時正常種子可以在篩片上面振動精選下來，畸形恢復系種子就被篩片漏掉，然后作為雜質篩選出來。如果不能完全清選干凈，再經過比重選設備。比重選設備主要根據種子的比重原理，通過振動將比重不一致的雜質選出。因恢復系種子穎殼開裂，籽粒發育不正常，比重明顯小于正常種子，所以再經過比重選設備就可以完全將這部分畸形恢復系種子選出。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。