一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，包含以下步驟：在水稻閉穎授粉決定基因DEP2外顯子區(qū)選取靶標(biāo)片段并構(gòu)建植物CRISPR/Cas9打靶重組載體，導(dǎo)入水稻細胞并再生成苗，通過剪切造成水稻細胞DEP2基因出現(xiàn)功能缺失突變，在通過對再生株系基因組目標(biāo)片段的測序，獲取攜帶兩個等位DEP2基因同時發(fā)生功能缺失突變的株系，經(jīng)過表型鑒定，確認再生植株開花授粉由開穎轉(zhuǎn)為閉穎。實驗表明，本方法可快速獲得閉穎授粉水稻材料。
【專利說明】一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水稻生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種快速創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的
選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因漂移(或基因逃逸，Gene flow)，是指一種生物的目標(biāo)基因向附近野生近緣種自發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致附近野生近緣種發(fā)生內(nèi)在變化，具有目標(biāo)基因的一些優(yōu)勢特征，形成新物種，以致整個生態(tài)環(huán)境發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化。根據(jù)轉(zhuǎn)基因漂移對象的不同，可以分為轉(zhuǎn)基因作物的外源基因向其非轉(zhuǎn)基因作物、野生近緣種和同一物種的雜草類型逃逸。基因漂移的途徑主要包括花粉漂移、種子傳播(或擴散)和無性繁殖器官的移動等。基因漂移一般需要一定的媒介，如風(fēng)、昆蟲、動物和水等，其中風(fēng)媒和蟲媒傳粉是最為有效的方式，而花粉也可以產(chǎn)生長距離的漂移
[0003]閉花受精(cleistogamy)是在花朵未開放時成熟花粉粒在花粉囊內(nèi)萌發(fā),花粉管穿出花粉囊，伸向柱頭，進入子房，把精子送入胚囊，完成受精。被子植物(60個科約300種植物)中廣泛存在著閉花受精現(xiàn)象。栽培作物中，大豆、豌豆屬于嚴(yán)格的閉花受精作物，水稻、大麥、棉花、高梁中也存在閉花受精類型。閉花受精能使植物避免外來花粉干擾而保持純種，也可以防止自身花粉向外漂移。因此，閉花受精可作為控制基因漂流的途徑之一。
[0004]水稻是典型的開花授精(開穎授粉)的作物。但目前有一些研究分離了部分表現(xiàn)為閉穎性狀的水稻突變體 ，如:單個隱性基因d7決定CL突變體的表型(不正常的護穎，使外穎和內(nèi)穎結(jié)合在一起)；單個隱性基因Id (t) [lodiculeless spikelet (t)]突變產(chǎn)生衆(zhòng)片缺失突變體，穎殼不張開；水稻直立穗基因DEP2突變能產(chǎn)生嚴(yán)格的閉穎授粉性狀。
[0005]雖然閉穎材料品種在水稻轉(zhuǎn)基因育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但是天然的遺傳突變資源有限，應(yīng)用存在一定的技術(shù)難度。通過傳統(tǒng)的回交導(dǎo)入技術(shù)，育種周期漫長，成本較大，且可能導(dǎo)入與突變位點連鎖的其他供體基因組片段，對品種選育帶來不可預(yù)知的風(fēng)險。因此，人們希望獲得一種能夠快速定向創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述問題，本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0007]步驟1，在水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二或第三外顯子區(qū)選取靶標(biāo)片段；
[0008]其中，所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有NGG結(jié)構(gòu)，其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種；
[0009]步驟2，按照靶標(biāo)序列的核苷酸排列順序，構(gòu)建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，所述重組載體包含向?qū)NA表達框和Cas9核酸酶表達框，所述向?qū)NA表達框包含所述靶標(biāo)片段；[0010]步驟3，將所述重組載體導(dǎo)入水稻細胞，使所述向?qū)NA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標(biāo)片段，誘發(fā)所述水稻細胞自身的DNA修復(fù)功能，在靶標(biāo)位點隨機插入或缺失堿基，實現(xiàn)細胞內(nèi)DEP2基因的功能缺失突變；
[0011]步驟4，用導(dǎo)入所述重組載體的水稻細胞再生植株；
[0012]步驟5，對所述再生植株中DEP2基因包含靶標(biāo)片段的DNA區(qū)段進行測序；
[0013]步驟6，選擇兩個等位DEP2基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生植株，進行表型鑒定，觀察所述再生植株的開花習(xí)性，挑取完全閉穎授粉的植株，作為所創(chuàng)制的閉穎授粉水稻材料。
[0014]優(yōu)選地，所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有5’ _(N)x-NGG-3’結(jié)構(gòu)，其中，
(N) X表不數(shù)目為X的一條堿基序列{N” N2......Nj，N1, N2......Nx中的每一個表不A、G、C、T
中的任意一個，NGG中的N也代表A、G、C、T中的任意一個。X—般為19或20。
[0015]優(yōu)選地，所述重組載體包含向?qū)NA表達框，其能夠在水稻細胞內(nèi)表達并且核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，并且所述重組載體包含Cas9核酸酶表達框，其能夠在水稻細胞內(nèi)表達并且核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。也可以說，另一方面本發(fā)明還提供了這種重組載體。
[0016]優(yōu)選地，所述向?qū)NA表達框包括:水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；結(jié)構(gòu)特征為(N)x的靶標(biāo)序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第266至349位所示；和Poly-T終止子,其核苷酸序列如Seq ID N0.1第350至357位所示，
[0017]所述Cas9核酸酶表達框包括:玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示；植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
[0018]優(yōu)選地，所述向?qū)NA表達框包括CRISPR RNA (crRNA)序列，其具有所述靶標(biāo)片段的5’ -(N)x-NGG-3，中的(N)x或與之互補的序列。
[0019]在所選的DEP2基因外顯子上，具有所述(N)X-NGG_3’結(jié)構(gòu)的片段可選為靶標(biāo)的共有35個。
[0020]步驟6中所提到功能缺失突變指的是正常DEP2編碼序列在靶標(biāo)位點出現(xiàn)終止子或閱讀框移位。
[0021]所述Cas9核酸酶表達框位于包含所述向?qū)NA表達框的同一載體中。
[0022]在步驟3中將所獲重組載體導(dǎo)入水稻細胞，從而使細胞同時含有步驟所述靶標(biāo)片段的向?qū)NA，Cas9核酸酶。在向?qū)NA和Cas9核酸酶的共同作用下，DEP2基因的雙鏈靶標(biāo)片段被剪切，再通過水稻細胞自身的DNA修復(fù)功能，最終實現(xiàn)細胞內(nèi)DEP2基因靶標(biāo)片段的隨機插入和/或隨機缺失。
[0023]所述方法中，將重組載體導(dǎo)入水稻細胞的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。由于在將所獲重組載體導(dǎo)入水稻細胞的過程中，是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，重組載體被導(dǎo)入到水稻的遺傳DNA中，所以在進行剪切時使得水稻的遺傳DNA的片段受到剪切。
[0024]在本發(fā)明中，所述再生植物的方法為細胞或組織經(jīng)過組織培養(yǎng)，獲得植株。[0025]在步驟5中，可以通過基因組PCR方法克隆再生植株中DEP2基因包含靶標(biāo)片段的DNA區(qū)段，并對擴增產(chǎn)物測序。所述基因組PCR方法為，針對包含靶標(biāo)片段的基因組區(qū)域，設(shè)計位點特異性引物，以再生植株的基因組DNA為模板，擴增所述包含靶標(biāo)片段的基因組區(qū)域。所述擴增產(chǎn)物測序是指，對PCR產(chǎn)物中的目的條帶測序。
[0026]所述兩個等位DEP2基因都出現(xiàn)功能缺失突變是指測序結(jié)果在DEP2基因靶標(biāo)位點出現(xiàn)兩種功能缺失突變序列，且沒有出現(xiàn)野生型序列；
[0027]其中所述功能缺失突變序列指的是正常DEP2編碼序列在靶標(biāo)位點出現(xiàn)終止子或閱讀框移位。
[0028]向?qū)NA表達框的核苷酸序列(Seq ID N0.1)如下所示:
[0029]ggatcatgaaccaacggcctggctgtatttggtggttgtgtagggagatggggagaagaaaagcccgattctcttcgctgtgatgggctggatgcatgcgggggagcgggaggcccaagtacgtgcacggtgagcggcccacagggcgagtgtgagcgcgagaggcgggaggaacagtttagtaccacattgcccagctaactcgaacgcgaccaacttataaacccgcgcgctgtcgcttgtgtgGCTCTCCCCGCGCCGCTCGgttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttt
[0030]Cas9核酸酶表達框的核苷酸序列(Seq ID N0.2)如下所示:
[0031]ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacc tatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaatgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcagcccgggggatccccaatacttgtatggccgcggccgctctagatggattacaaggaccacgacggggattacaaggaccacgacattgattacaaggatgatgatgacaagatggctccgaagaagaagaggaaggttggcatccacggggtgccagctgctgacaagaagtactcgatcggcctcgatattgggactaactctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccctcaaagaagttcaaggtcctgggcaacaccgatcggcattccatcaagaagaatctcattggcgctctcctgttcgacagcggcgag acggctgaggctacgcggctcaagcgcaccgcccgcaggcggtacacgcgcaggaagaatcgcatctgctacctgcaggagattttctccaacgagatggcgaaggttgacgattctttcttccacaggctggaggagtcattcctcgtggaggaggataagaagcacgagcggcatccaatcttcggcaacattgtcgacgaggttgcctaccacgagaagtaccctacgatctaccatctgcggaagaagctcgtggactccacagataaggcggacctccgcctgatctacctcgctctggcccacatgattaagttcaggggccatttcctgatcgagggggatctcaacccggacaatagcgatgttgacaagctgttcatccagctcgtgcagacgtacaaccagctcttcgaggagaaccccattaatgcgtcaggcgtcgacgcgaaggctatcctgtccgctaggctctcgaagtctcggcgcctcgagaacctgatcgcccagctgccgggcgagaagaagaacggcctgttcgggaatctcattgcgctcagcctggggctcacgcccaacttcaagtcgaatttcgatctcgctgaggacgccaagctgcagctctccaaggacacatacgacgatgacctggataacctcctggcccagatcggcgatcagtacgcggacctgttcctcgctgccaagaatctgtcggacgccatcctcctgtctgatattctcagggtgaacaccgagattacgaaggctccgctctcagcctccatgatcaagcgctacgacgagcaccatcaggatctgaccctcctgaaggcgctggtcaggcagcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgatcagtcgaagaacggctacgctgggtacattgacggcggggcctctcaggaggagttctacaagttcatcaagccgattctggagaagatggacggcacggaggagctgctggtgaagctcaatcgcgaggacctcctgaggaagcagcggacattcgataacggcagcatcccacaccagattcatctcggggagctgcacgctatcctgaggaggcaggaggacttctaccctttcctcaaggataaccgcgagaagatcgagaagattctgactttcaggatcccgtactacgtcggcccactcgctaggggcaactcccgcttcgcttggatgacccgcaagtcagaggagacgatcacgccgtggaacttcgaggaggtggtcgacaagggcgctagcgctcagtcgttcatcgagaggatgacgaatttcgacaagaacctgccaaatgagaaggtgctccctaagcactcgctcctgtacgagtacttcacagtctacaacgagctgactaaggtgaagtatgtgaccgagggcatgaggaagccggctttcctgtctggggagcagaagaaggccatcgtggacctcctgttcaagaccaaccggaaggtcacggttaagcagctcaaggaggactacttcaagaagattgagtgcttcgattcggtcgagatctctggcgttgaggaccgcttcaacgcctccctggggacctaccacgatctcctgaagatcattaaggataaggacttcctggacaacgaggagaatgaggatatcctcgaggacattgtgctgacactcactctgttcgaggaccgggagatgatcgaggagcgcctgaagacttacgcccatctcttcgatgacaaggtcatgaagcagctcaagaggaggaggtacaccggctgggggaggctgagcaggaagctcatcaacggcattcgggacaagcagtccgggaagacgatcctcgacttcctgaagagcgatggcttcgcgaaccgcaatttcatgcagctgattcacgatgacagcctcacattcaaggaggatatccagaaggctcaggtgagcggccagggggactcgctgcacgagcatatcgcgaacctcgctggctcgccagctatcaagaaggggattctgcagaccgtgaaggttgtggacgagctggtgaaggtcatgggcaggcacaagcctgagaacatcgtcattgagatggcccgggagaatcagaccacgcagaagggccagaagaactcacgcgagaggatgaagaggatcgaggagggcattaaggagctggggtcccagatcctcaaggagcacccggtggagaacacgcagctgcagaatgagaagctctacctgtactacctccagaatggccgcgatatgtatgtggaccaggagctggatattaacaggctcagcgattacgacgtcgatcatatcgttccacagtcattcctgaaggatgactccattgacaacaaggtcctcaccaggtcggacaagaaccggggcaagtctgataatgttccttcagaggaggtcgttaagaagatgaagaactactggcgccagctcctgaatgccaagctgatcacgcagcggaagttcg
【權(quán)利要求】
1.一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟I，在水稻閉穎授粉決定基因DEP2外顯子區(qū)選取靶標(biāo)片段； 其中，所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有NGG結(jié)構(gòu)，其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種； 步驟2，按照靶標(biāo)序列的核苷酸排列順序，構(gòu)建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，所述重組載體包含向?qū)NA表達框和Cas9核酸酶表達框,所述向?qū)NA表達框包含所述靶標(biāo)片段； 步驟3，將所述重組載體導(dǎo)入水稻細胞，使所述向?qū)NA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標(biāo)片段，誘發(fā)所述水稻細胞自身的DNA修復(fù)功能，在靶標(biāo)位點隨機插入或缺失堿基，實現(xiàn)細胞內(nèi)DEP2基因的功能缺失突變； 步驟4，用導(dǎo)入所述重組載體的水稻細胞再生植株； 步驟5，對所述再生植株中DEP2基因包含靶標(biāo)片段的DNA區(qū)段進行測序； 步驟6，選擇兩個等位DEP2基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生植株，進行表型鑒定，觀察所述再生植株的開花習(xí)性，挑取完全閉穎授粉的植株，作為所創(chuàng)制的閉穎授粉水稻材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有5’ _(N)x-NGG-3’結(jié)構(gòu)，其中，(N)x表示數(shù)目為X的一條堿基序列(N1, N2......Nx}, N1, N2......Nx中的每一個表不A、G、C、T中的任意一個。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述向?qū)NA表達框能夠在水稻細胞內(nèi)表達并且核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述Cas9核酸酶表達框能夠在水稻細胞內(nèi)表達并且核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述向?qū)NA表達框包括:水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；結(jié)構(gòu)特征為(N)x的靶標(biāo)序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第266至349位所示；和Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第350至357位所示， 所述Cas9核酸酶表達框包括:玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示；植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于， 所述向?qū)NA表達框包括CRISPR RNA序列，其具有所述靶標(biāo)片段的5’ _(N)X-NGG_3’中的(N)x或與之互補的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述靶標(biāo)片段位于水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二和/或第三外顯子上。
【文檔編號】C12N15/82GK103981211SQ201410209551
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】倪大虎, 楊劍波, 魏鵬程, 馬卉, 李 浩, 李莉, 倪金龍, 陸徐忠, 宋豐順, 楊亞春 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所