本發明屬于蔬菜種植技術領域，具體涉及一種顯著降低葉用萵苣鎘含量的方法。
背景技術：
據我國地質調查局發布的《中國耕地地球化學調查報告(2015)》顯示，我國有232萬hm2重金屬中重度污染或超標耕地，占總耕地的16.1％。2014年4月17日環境保護部和國土資源部聯合公布了全國土壤污染調查公報，指出我國土壤環境狀況令人堪憂，cd等重金屬污染問題相對比較突出，從污染分布情況看，南方土壤污染較重，北方土壤污染相對較輕，西南、中南地區土壤重金屬超標范圍較大。
cd含量分布呈現出從東北到西南、從西北到東南方向逐漸升高的態勢，cd點位超標率為7.0％，在污染土壤中占比最大，其中，輕微污染、輕度污染、中度污染、重度污染的比例分別為5.2％，0.8％，0.5％，0.5％。污染土壤的cd含量為2.5～23.0mg/kg，重污染區表層土壤的cd含量高出底層土壤幾十倍甚至更高。
根據農業部環境監測系統檢測數據顯示，與國家標準相比，蔬菜中cd含量超標率高達23.5％。通過對成都地區的9種蔬菜152個樣品的可食部分中重金屬元素分析，發現cd是成都地區蔬菜中的主要污染元素之一，在檢測樣品中，cd的超標率為29.4％,最高超標5.6倍。
由此可見，目前我國cd污染現狀不容樂觀，己威脅到食品安全和人體健康，須引起高度重視。
不同植物對不同重金屬的吸收有一定規律，一般而言，蔬菜可食部分吸收重金屬的比率大于糧食作物，同種蔬菜對重金屬cd的富集大于其他重金屬元素。但蔬菜對cd的吸收因蔬菜種類、品種以及器官不同而不同。
植物對礦質營養的吸收具有基因型差異，同樣蔬菜對cd的吸收、累積也具有基因型差異，這種差異是引起不同蔬菜cd含量差異的重要原因之一。
李博文等研究發現：茄子、絲瓜、番茄、辣椒等為cd低積累型蔬菜；白蘿卜、菜花、萵苣、大蔥等為中度積累型；芹菜、茴香、香菜、蓬蒿為重度積累型；白菜、油菜屬極重度積累型。馬往校等研究幾種蔬菜中cd的污染狀況，結果表明，不同的蔬菜中cd的積累規律為芹菜＞韭菜＞萵筍＞小白菜＞花菜＞西葫蘆、黃瓜、青椒，芹菜和萵筍對cd具有較強的吸收能力，超標最嚴重。
同種蔬菜的不同品種對重金屬的吸收也存在較大差異。以胡蘿卜為例，nairobi對cd的吸收量為1.215mg/kg，而amsterdam的吸收量則為2.521mg/kg，其它5種蔬菜的不同品種對鎘離子也存在差異性吸收。王松良等研究發現13種不同基因型的小白菜莖葉中cd含量差別很大。相同cd濃度下，不同小白菜品種間cd含量相差最高達4.3倍，且外界cd濃度越高，品種間差異越大。
目前，對于重金屬脅迫下的植物生長的研究，主要是通過研究植物內調節其生長的物質來進行。目前已知的植物生長調節因子是人們在提高植物抗逆性時考慮的主要因素。不過，現有已知植物生長調節因子在調節植物抗逆性時，專一性較差，難以形成對于多種脅迫情況統一的處理辦法，甚至不同脅迫情況的處理辦法還會大相徑庭。對于重金屬脅迫而言，由于該脅迫區別于高溫、高鹽等一般脅迫，在處理重金屬脅迫時，不僅要提高蔬菜的抗氧化活性和植物生長性能，更為重要的是需要降低重金屬在蔬菜中的積累，才能達到蔬菜種植的目的。
目前，對于解決生菜的重金屬脅迫(特別是鎘脅迫)的研究還相對較少，原因在于目前對于重金屬對于生菜的影響的機理尚未研究透徹，相應的處理辦法仍在摸索當中。
《外源一氧化氮對鎘脅迫下花生與生菜生長的緩解效應及其機理研究》通過對生菜施用外源一氧化碳顯著降低了生產在鎘脅迫下的鎘含量。
《水楊酸對鎘脅迫下萵苣幼苗生長和氧化脅迫的緩解效應》研究了對于莖用萵苣施用水楊酸對于鎘脅迫的緩解效應。不過該報道在對于鎘積累方面的探究中，提到水楊酸對于cd從根系向上部的運輸具有促進作用。在其研究基礎上，施用外源水楊酸有可能對降低鎘含量是無益的。
因此，如何降低在鎘脅迫下生菜中的鎘含量，對于生菜種植技術領域而言，是亟待研究的技術問題。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術中的技術難題提供一種顯著降低葉用萵苣鎘含量的方法，其包括如下步驟：
當葉用萵苣幼苗成熟后，用濃度為1～20μmol/l的aba(脫落酸)水溶液進行葉面噴施，噴施量以葉面滴水為度，每隔2天噴施1次，共噴施3次。
優選的，所述脫落酸水溶液的濃度為5～10μmol/l。
更優選的，所述脫落酸水溶液的濃度為5μmol/l。
優選的，在利用脫落酸水溶液進行葉面噴施時，噴施時間為清晨。
優選的，第1次噴施脫落酸水溶液的時間為葉用萵苣幼苗成熟后的第3天。
所用葉用萵苣為玻璃生菜。
本發明的有益效果：
1、本發明緩解了cd對生菜葉綠素的破壞，促進了生菜的光合作用；
2、本發明降低了cd脅迫下生菜mda含量、電導率、sod和pod活性；
3、本發明降低了生菜蒸騰速率，顯著降低生菜地上部的cd含量。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述發明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
實施例1
選擇大小一致，籽粒飽滿的生菜種子(購買自廣東科農蔬菜種業有限公司，品種為四川地區常見的玻璃生菜)，在10％(m/m)過氧化氫溶液中消毒10min，隨后用超純水洗凈，均勻放置于墊有濾紙的培養皿中，保持充足水分，于20℃人工培養箱中進行催芽。種子露白0.5cm后，播于裝有干凈河沙的搪瓷托盤里進行沙基培養。根據生長狀況，每天適時適量向沙基中噴淋1/2hoagland營養液，培養箱設置為23℃/18℃(晝/夜)，光照14h。待幼苗4片真葉完全展開時，選擇長勢一致的壯苗移栽至裝有干凈河沙(起固定作用)的10cm×10cm(底×高)塑料花盆中(花盆底部墊有紗布，防止河沙漏出)，每盆2株，并將花盆置于高8cm的塑料盤中，盤中裝滿含有cd的hoagland全營養液，cd濃度為10mg/l(以cdcl2·2.5h2o2加入)，每2d更換一次營養液。待移栽的生菜幼苗完全成活(2d)后，用不同濃度的aba(脫落酸，下同)溶液于9:00噴布生菜葉片，以葉片滴水為度，每隔2d一次，共噴3次。以不添加cd全營養液栽培，噴施清水的生菜為對照(ck)，含10mg/lcd全營養液栽培，噴施清水的生菜為對照1(ck1)。設置4個濃度梯度(1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l)，每個處理重復3次。
在噴施aba30d后，生菜成熟期采樣。整株測定生長及形態指標后，按地上部(可食部)、根部分別保存鮮樣和干樣。鮮樣用液氮采樣后，于超低溫冰箱中-80℃保存以備生理指標和品質指標的測定；干樣用烘箱105℃殺青15min后以75℃烘干至恒重，粉碎后用于cd含量的測定。
生長指標及生物量：
株高、根長采用毫米刻度尺測量，莖粗用游標卡尺測量。
生物量：用自來水將植物樣品整株洗凈后，再用去離子水反復沖洗，拭干。將生菜分為地上部和根部，用電子天平稱取鮮重。隨后將地上部與根系分裝，用烘箱105℃殺青15min，75℃烘干至恒重，稱取干重。
光合色素及光合參數：
光合色素含量采用丙酮乙醇混合液浸提法[84]測定。
選取生菜的第2-3片功能葉，用li-6400xt(li-cor，美國)便攜式光合儀測定pn、gs、tr、ci和ls，測定時設定內源光強為1000μmol·m-2·s-1，co2濃度為400μl·l-1，溫度為25℃。
細胞膜透性、滲透調節物質及根系活力：
mda含量采用硫代巴比妥酸法測定；脯氨酸含量采用磺基水楊酸法；根系活力采用氯化三苯基四氮唑(ttc)法測定。
細胞膜透性采用電導法測定：稱取0.2g生菜樣品放入20ml去離子水中，常溫振蕩30min，測定溶液電導率(a)；然后將生菜樣品與去離子水一起于100℃下煮沸20min，使用去離子水調整至加熱前體積，測定溶液電導率(b)。細胞膜透性(％)＝電導率(a)/電導率(b)×100％
抗氧化酶活性：
sod活性采用氮藍四唑(nbt)法；pod活性采用愈創木酚法；cat活性采用紫外吸收法。
品質指標：
可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍g-250染色法；可溶性糖含量采
用蒽酮比色法；
硝態氮含量采用水楊酸比色法。
cd含量：
將生菜干樣用hno3-hclo4消化，用icp-8000電感耦合等離子體發射光譜儀(perkinelmer，美國)測定。
數據處理：
所有數據采用excel2010軟件進行整理；spss20.0進行方差分析及相關性分析，duncan新復極差法進行多重比較。根冠比＝根系干重/地上部干重，ls＝1－ci/ca，轉運系數＝地上部cd含量/根系cd含量。
外源aba對cd脅迫下生菜生長的影響：
噴施aba濃度為1μmol/l、5μmol/l和10μmol/l的處理，生菜株高較ck1低，但與ck1差異不顯著。與ck1相比，噴施1～10μmol/laba后生菜莖粗和根長的值均增大，并隨aba濃度升高而升高。在aba濃度為10μmol/l時，生菜莖粗和根長分別比ck1增加了7.32％(p＜0.05)和15.66％(p＜0.05)。就莖粗而言，噴施1μmol/l和5μmol/laba的處理之間差異不顯著，分別比ck1大3.05％(p＞0.05)和4.12％(p＞0.05)。噴施1μmol/laba后，生菜根長雖比ck1稍長，但兩者之間差異不顯著。當aba濃度為5μmol/l和20μmol/l時，生菜根長顯著長于ck1，分別比ck1長6.78％和12.31％。
表1aba對cd脅迫下生菜生長的影響
外源aba對cd脅迫下生菜生物量的影響
cd脅迫下，生菜地上部鮮重和干重顯著降低，噴施1～10μmol/laba后雖有增加，但仍與ck差異顯著。cd污染下，生菜地上部鮮重和干重隨aba濃度(0～10μmol/l)的升高而增加，當aba濃度為10μmol/l時，達到峰值，分別比ck1高11.22％(p＜0.05)和9.97％(p＜0.05)。噴施aba濃度為5μmol/l時，生菜地上部鮮重和干重與噴施aba濃度為10μmol/l的處理間差異不顯著。噴施aba濃度為20μmol/l時，生菜地上部鮮重和干重雖有下降，但與ck1差異不顯著，分別比ck1低2.04％和1.30％。就根系干重而言，噴施1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l和20μmol/laba的各處理間差異不顯著，分別比ck1高7.10％(p＞0.05)、14.20％(p＜0.05)、13.02％(p＜0.05)和5.33％(p＞0.05)。cd脅迫下，生菜根冠比在aba濃度為5μmol/l和20μmol/l時最大，但仍比ck小16.35％。
表2aba對cd脅迫下生菜生物量的影響
外源aba對cd脅迫下生菜光合色素含量的影響
噴施aba能有效緩解cd對生菜葉片葉綠素a和葉綠素b的傷害。當aba濃度為1μmol/l、10μmol/l和20μmol/l時，生菜葉片葉綠素a含量與ck1相比無顯著差異。噴施aba濃度為5μmol/l時，葉綠素a含量比ck1高13.94％(p＜0.05)，比ck低5.10％(p＞0.05)。從葉綠素b含量來看，cd脅迫下，與ck1相比，噴施aba濃度為1～10μmol/l時，均提高了生菜葉綠素b含量。噴施1μmol/l、10μmol/l、20μmol/laba的生菜葉綠素b與ck1相比差異不顯著，均顯著低于ck。噴施5μmol/laba后，葉綠素b含量較ck稍低，但與ck之間無顯著差異。cd脅迫下，aba處理的生菜葉片葉綠素總含量變化趨勢與葉綠素b變化趨勢一致，均在aba濃度為5μmol/l時達到峰值。就類胡蘿卜素而言，各處理間無顯著差異。
表3aba對cd脅迫下生菜光合色素含量的影響
外源aba對cd脅迫下生菜光合作用的影響
從表4可以看出，噴施aba顯著提高了cd脅迫下生菜pn，當aba濃度為1μmol/l時最高，與ck差異不顯著，與ck1相比提高了27.60％(p＜0.05)。噴施aba濃度為5μmol/l、10μmol/l和20μmol/l的各處理間生菜pn差異不顯著。噴施aba后，生菜gs變化趨勢與pn相似，隨aba濃度升高而先升高后降低。當aba濃度為1μmol/l時，生菜gs最高，與ck1相比提高了3.39％(p＜0.05)。cd脅迫下，生菜gs最小值出現在aba濃度為20μmol/l時，比ck1降低了8.19％(p＜0.05)。就ci而言，噴施aba的各處理間差異不顯著，當aba濃度為1μmol/l時，與ck1相比提高了6.05％(p＜0.05)。噴施aba后，生菜tr均顯著大于ck。cd脅迫下，生菜ls最小值為噴施aba濃度為10μmol/l的處理，與ck相比降低了30.62％(p＜0.05)，但與ck1差異不顯著。
表4aba對cd脅迫下生菜光合作用的影響
外源aba對cd脅迫下生菜滲透調節物質及根系活力的影響
cd脅迫下，噴施aba生菜mda含量和電導率均低于ck1。當aba濃度為5μmol/l時，生菜mda含量和電導率最低，分別為ck1的66.44％(p＜0.05)和80.81％(p＜0.05)。生菜電導率隨aba濃度的升高，先降低后升高，除噴施aba濃度為20μmol/l的處理生菜電導率與ck1無顯著差異外，其他處理均顯著低于ck1。cd脅迫導致生菜脯氨酸含量顯著升高，與ck相比，ck1升高45.34％(p＜0.05)。噴施aba后，生菜脯氨酸含量均有升高，以濃度為10μmol/l的處理最高，比ck1高30.03％(p＜0.05)。aba處理后，cd脅迫下的生菜根系活力顯著升高，在aba濃度為10μmol/l時最高，與ck1相比，提高了58.56％(p＜0.05)。
表5aba對cd脅迫下生菜滲透調節物質及根系活力的影響
外源aba對cd脅迫下生菜抗氧化酶活性的影響
與未受cd脅迫的ck相比，cd脅迫導致生菜pod活性顯著升高，噴施aba雖能降低生菜pod活性，但仍顯著高于ck。cd脅迫下，當aba濃度為5μmol/l時，生菜pod活性最低，與ck1相比降低了27.83％(p＜0.05)，但與ck相比升高了28.01％。cd脅迫下，生菜sod活性變化趨勢與pod活性趨勢一致，隨aba濃度升高而先降低后升高，當aba濃度為10μmol/l時最低，比ck1低48.97％(p＜0.05)。噴施aba濃度為5μmol/l的處理比aba濃度為10μmol/l的處理sod活性稍高，但兩者間無顯著差異。cd脅迫下，當aba濃度為0～10μmol/l時，隨著aba濃度升高，cat活性也顯著升高，當aba濃度為10μmol/l時最高，與ck1相比提高了43.17％(p＜0.05)，之后，隨aba濃度升高，cat活性降低。
表6aba對cd脅迫下生菜抗氧化酶活性的影響
外源aba對cd脅迫下生菜品質的影響
由表7可知，cd脅迫降低了生菜可溶性糖含量，增強了硝酸鹽和可溶性蛋白的積累。cd脅迫下，噴施aba顯著提高了生菜可溶性糖含量，且在aba濃度為10μmol/l時最高，與ck1相比，提高了45.80％(p＜0.05)。噴施aba濃度為1μmol/l和5μmol/l時，兩處理間可溶性糖含量無顯著差異。就生菜硝酸鹽含量而言，cd脅迫下，噴施aba顯著降低了生菜硝酸鹽含量，當aba濃度為1μmol/l時，生菜硝酸鹽含量最低，比ck1低45.73％(p＜0.05)，之后，隨著aba濃度的升高，生菜硝酸鹽含量持續升高，噴施aba濃度為20μmol/l的處理比噴施aba濃度為10μmol/l的處理硝酸鹽含量高24.51％(p＜0.05)。噴施aba后，生菜可溶性蛋白含量顯著增加，但噴施1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l和20μmol/l的各處理間，生菜可溶性蛋白含量無顯著差異。
表7aba對cd脅迫下生菜品質的影響
外源aba對cd脅迫下生菜cd含量及cd轉運系數的影響
cd脅迫下，噴施aba對生菜cd積累的影響與噴施iaa的變化趨勢相近。就地上部cd含量而言，噴施aba后顯著降低，且隨著aba濃度的升高，生菜地上部cd含量先急劇降低后緩慢升高，在aba濃度分別為1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l時，均顯著低于ck1，分別比ck1低5.68％、23.60％、16.29％和13.19％。就根系cd含量而言，當aba濃度為0～5μmol/l時，生菜根系cd含量隨著aba濃度升高而升高；當aba濃度為5～20μmol/l時，生菜根系cd含量隨著aba濃度升高而降低。根系cd含量在aba濃度為5μmol/l時最高，顯著高于其他各處理。cd脅迫下，噴施aba濃度為20μmol/l時，根系cd含量最低，比ck1低12.66％(p＜0.05)。噴施aba后，生菜cd轉運系數與地上部cd含量變化趨勢一致。當aba濃度為5μmol/l時最低，為0.273，比ck1低41.04％。
表8aba對cd脅迫下生菜cd含量及cd轉運系數的影響
aba處理生菜生長、生理指標及cd含量之間的相關性分析
噴施aba后，生菜地上部cd含量與硝酸鹽含量、mda含量、脯氨酸含量和sod活性呈正相關，但相關性不顯著。地上部cd含量與地上部鮮重極顯著負相關，與根系活力可溶性糖含量顯著負相關(表9)。生菜地上部鮮重與根系活力和可溶性唐顯著正相關，與pod活性顯著負相關。生菜硝酸鹽含量與pod活性顯著正相關，與sod活性極顯著正相關。
表9生菜生長、生理指標及cd含量之間的相關性分析
注：“**”和“*”分別表示p<0.05和p<0.01水平。
土壤cd污染會直接損傷植物根系細胞，抑制根系對養分的吸收，導致植物生長緩慢，葉片變黃壞死、植株矮小、產量下降。研究不同濃度cd對油菜幼苗生長的影響，發現隨著cd濃度的增加，油菜幼苗生長受到抑制，生物量減少。也有研究表明隨著cd濃度的增加，芥菜生長緩慢、地上部分生物量及相對含水量減少]。本試驗研究結果發現，cd脅迫下導致生菜株高，莖粗和生物量顯著降低。同時，cd脅迫顯著降低了生菜根長和根系活力。cd脅迫下，生菜硝酸鹽含量和可溶性蛋白含量顯著升高，且硝酸鹽含量與地上部cd含量呈顯著正相關，說明土壤中cd濃度超標易導致蔬菜硝酸鹽的積累。
植物在正常生理狀況下，體內活性氧代謝水平處于相對穩定的狀態。當受到cd脅迫時，細胞膜受到破壞，導致活性氧堆積，電解質大量外滲。研究表明cd還引起植物細胞的氧化應激反應，因為cd能有效觸發活性氧簇的合成與積累，導致細胞損傷和膜脂過氧化，抑制或促進抗氧化系統中抗氧化酶的活性。高家合等認為cd脅迫在一定程度內能提高烤煙葉片sod和pod的活性，但并不能避免細胞膜脂過氧化的發生。本試驗結果表明，cd脅迫導致生菜sod和pod活性升高，但cat活性降低。表明生菜sod和pod對cd的耐受力更強，在高濃度cd脅迫下，這兩種酶活性仍然顯著升高，而cat活性則被顯著抑制。cd脅迫下，生菜電導率、脯氨酸含量和mda含量顯著升高，表明高cd脅迫生菜細胞膜受到破壞導致膜脂過氧化，電解質外滲。
cd是光合作用的一種有效抑制劑。cd能通過降低葉綠素的含量、抑制卡爾文循環的反應步驟和酶的活性來降低pn、gs，改變葉綠體的超微結構，通過干擾原葉綠酸酯的生成來抑制葉綠素的形成、抑制電子傳遞鏈和光合碳代謝相關的酶活性等途徑影響光合作用。本試驗中，cd脅迫導致生菜葉綠素含量顯著降低，pn顯著下降，而ci升高，表明生菜光合速率降低是由非氣孔因素導致的，cd脅迫使得光合相關酶活性降低及光合器官損傷。
本發明噴施aba不僅降低了cd脅迫下生菜tr，而且生菜cd轉運系數和地上部cd含量降低，這種效應可能與aba降低葉片氣孔導度、抑制蒸騰速率有關。但也有研究表明，cd向地上部轉運不只依賴蒸騰速率，aba非敏感型突變體蒸騰速率顯著高于野生型擬南芥，但地上部cd含量并無顯著差異。因此，aba對cd轉運的影響有待進一步研究。
對比實施例1
除了將脫落酸換為ckt，且濃度為1～200μmol/l之外，其余與實施例1一致。
經檢測發現，在上述濃度范圍內，玻璃生菜地上部分的鎘含量，相對于ck1而言，最高僅下降1.2％。
對比實施例2
除了將脫落酸換為ja，且濃度為1～200μmol/l之外，其余與實施例1一致。
經檢測發現，在上述濃度范圍內，玻璃生菜地上部分的鎘含量，相對于ck1而言，最高僅下降1.6％。
對比實施例3
除了將脫落酸換為ebr，且濃度為1～200μmol/l之外，其余與實施例1一致。
經檢測發現，在上述濃度范圍內，玻璃生菜地上部分的鎘含量，相對于ck1而言，最高僅下降2.3％。
對比實施例4
除了將脫落酸換為脯氨酸，且濃度為1～200μmol/l之外，其余與實施例1一致。
經檢測發現，在上述濃度范圍內，玻璃生菜地上部分的鎘含量，相對于ck1而言，最高僅下降1.4％。