本發明屬于轉基因家蠶技術領域，尤其涉及一種不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法。

背景技術：

家蠶自野蠶經人工選擇和馴化而來，與野蠶祖先相比，家蠶的產絲性能提高近10倍。1930年代開始利用一代雜種優勢，蠶絲產量比飼養純種又提高了近20％。自此，家蠶生產能力達到了一個難以逾越的高峰，使得其后近80年間未見革命性突破。轉基因育種技術由于具有育種周期短、目的性強、可突破不同物種間基因難以重組的難題等優點，具有傳統育種所無法比擬的優越性。目前，轉基因家蠶的獲得主要是通過piggybac轉座子介導實現外源基因的插入與表達，該轉座子在家蠶基因組上的插入具有一定的隨機性，整合可能位于一條染色體上，也可能位于多條染色體上，即形成整合位點的純合子、雜合子和多重雜合子。而基因型的純合是對生物材料進行遺傳分析的基礎，也是保證后代性狀不發生分離的基礎，所以從諸多攜帶同一外源基因的轉基因家蠶個體或后代中篩選出外源基因在兩條同源染色體上均有整合(即純合子)的個體，是對該轉基因家蠶品種進行后期的遺傳分析與品種選育開發的基礎。

獲得轉基因生物純合體(或純合系)的方法多種多樣，這主要根據前期轉基因方法的不同而確定，主要有通過測交結合設計特異pcr引物進行擴增篩選獲得、旁側pcr方法篩選獲得等。而挑選家蠶某個性狀基因型的純合與否，傳統方法主要是采用半分法：將一個蛾產下的卵分成兩部分，一部分暫時冷藏保留，另一部分進行飼養后每一個蛾與無檢測性狀的純合蠶品種雜交；然后飼養雜交f1代所有個體，檢測相關性狀是否分離，由此結果推斷親本的純合性；如果f1代檢測的性狀不分離，則其親本為純合子，冷藏的另一半蠶種可作為該性狀的純合系進行保留。使用上述方法進行轉基因家蠶純合品系的篩選與培育存在以下一些問題：(1)其他物種的轉基因純合系篩選方法不能完全適用于轉基因家蠶純合子篩選；(2)技術要求高，費時、費力又需要消耗大量資金。(3)半分法篩選概率不確定，需要飼養大量的蠶區、并制備大量的蠶種，太耗人力物力；而且在養蠶過程中丟失小蠶難以避免，因人為操作問題，可能淘汰掉一些無檢測性狀出現的蠶體，造成假陽性結果。

在前期研究中，申請人建立了一種一種單拷貝轉基因家蠶品系的純合方法(申請號2016109384966申請日2016年10月25日)：該法利用測交并結合整合位點5′上游和3′下游側翼序列特異性引物與外源基因特異性引物的組合，進行旁側pcr，通過與野生型基因組的結果比較，能夠方便的區分整合位點純合子及雜合子，進而成功挑選出純合子進行留種繼代。但使用該法的前提是要測試出外源基因插入到染色上的旁側序列，且適用于單拷貝插入的情況，無法應用到多個位點多拷貝插入的情況。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種技術要求低、時間短、成本低的不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法，為轉基因家蠶遺傳研究和培育綜合經濟性狀優良的轉基因家蠶品種奠定堅實的基礎。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法，采用標記基因篩選、雄蛾測交、雌蛾混精雜交相結合的方法進行轉基因家蠶純合品系的篩選。

上述不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法，將來自姬蠶或普通斑的轉基因品種內自交后，對應的雌蛾再與虎斑的雄蛾雜交，后代將出現姬蠶或普通斑和虎斑，再將該f1代的虎斑進行轉基因標記基因檢測，如果全部為轉基因個體，說明該雜交方式中的雌蛾為整合位點純合子；如果出現非轉基因個體，則說明該雜交方式中的雌蛾為整合位點雜合子；而雜交方式中轉基因♂的整合位點純合性，通過測交驗證。

轉基因家蠶為kap3.2-r轉基因家蠶或932×kap4.3黃繭轉基因家蠶

上述不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法，按以下步驟操作進行：

<1>飼養轉同一個表達載體的轉基因家蠶到化蛾，選取雌蛾與雄蛾交配2小時后拆對；將該雄蛾與非轉基因家蠶品種的雌蛾雜交，該雌蛾產的卵編號為1；而剛剛自交交配完的轉基因雌蛾再與虎斑品種的雄蛾雜交，交配后該雌蛾產的卵編號為3；

<2>第二天收集所產的卵，進行即時浸酸催青，讓其發育；

<3>催青后期，蠶種轉青后，按轉基因載體設計的熒光標記，進行相應篩選標記的檢測；

<4>轉基因品系雄蛾測交所產的卵，通過檢測熒光標記基因的表達情況，標記并淘汰整個蛾圈內有不表達個體出現的蛾圈；有不表達個體出現的蛾圈對應雄蛾交配后所產的卵也一并標注出來進行淘汰；

<5>檢測完編號為1的蛾圈后，對保留下來編號為3的蛾圈進行熒光標記檢測，保留整個蛾圈內所有個體均有表達的蛾圈，淘汰有不表達個體出現的蛾圈；

<6>飼養經過上述熒光標記檢測后篩選留下的蛾圈和對應的虎斑測交蛾圈；單蛾區飼養方式飼養，四齡起蠶第二餐，調查蠶體斑紋；對應虎斑測交后代全為虎斑，與其同一父本的混精雜交后代如果出現虎斑和姬蠶(或普通斑)，則對該混精雜交后所產蛾圈內的虎斑進行熒光標記檢測，如果所檢測的個體均有熒光，表明該父母本均為轉基因整合位點純合子；保留該純合子后代中的姬蠶(或普通斑)，并留種繼代，即為轉基因純合品系。

上述不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法，還包括步驟<7>分析后代是否分離，驗證選出的純合品系，具體按以下操作進行：催青選出的純合系蠶卵至轉青，調查標記基因表達情況，一個蛾圈內所有個體均有表達；繼續飼養該蛾圈的所有個體至化蛾，自交14蛾留種，剩下的蛾與常規非轉基因蠶品種進行雜交并制種，讓這些種孵化至轉青，調查標記基因表達情況，所有自交和雜交的蠶卵均為陽性。

步驟<1>中轉基因家蠶飼養200頭以上。

步驟<1>中對虎斑雄蛾進行測交驗證其純合性。

步驟<1>中每一組交配方式均制備25個蛾圈以上的卵。

針對目前使用特異pcr引物進行檢測篩選技術要求高、工作量大而集中、試劑耗材等費用高、假陽性檢測結果導致篩選不正確等不足，發明人建立了一種不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法，采用標記基因篩選、雄蛾測交、雌蛾混精雜交相結合的方法進行轉基因家蠶純合品系的篩選。該法無須任何的分子生物學實驗，操作技術要求低，可快捷、高效的篩選出雙親均為轉基因純合子的后代進行留種繼代，保證外源基因在宿主基因組上的純合性，縮短了獲得基因型純合的轉基因家蠶所需的時間與成本，而且單拷貝和多拷貝整合的轉基因家蠶品種均適用，可廣泛應用于轉基因家蠶遺傳分析及品種培育研究，為該轉基因家蠶品種的研究與開發奠定堅實基礎。

附圖說明

圖1是本發明不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法的工藝流程圖。

圖2是本發明混精雜交試驗制備的蠶卵照片。

圖3是本發明轉青期熒光標記基因(紅色熒光)表達情況的照片，圖中：1轉基因陽性個體，2轉基因陰性個體。

圖4是本發明不同斑紋混精雜交蛾區蠶的照片，圖中：全體白色的為姬蠶，環節前緣有黑色帶的為虎斑，有眼狀紋和半月紋的為普通斑；a圖為轉基因姬蠶♀×轉基因姬蠶♂×虎斑♂后代；b圖為轉基因普通斑♀×轉基因普通斑♂×虎斑♂后代。

具體實施方式

不同斑紋品種混精雜交篩選轉基因家蠶純合子的方法

一、基本原理

家蠶是多精子受精的卵。1954年，朱洗等人發現家蠶多品種混精雜交，即一只雌蠶蛾與不同品種的多只雄蠶蛾雜交，能夠產下分別帶有兩個雄蛾性狀的后代，而且該后代的抗性及產量有所提高。虎斑是家蠶常見斑紋之一，在家蠶經典遺傳學研究中虎斑性狀受位于第3染色體上的顯性基因ze控制。虎斑對姬蠶或普通斑為顯性，即姬蠶或普通斑與純合虎斑品系(zeze)虎斑雜交，f1代全為虎斑。但目前生產上推廣應用的品種主要是姬蠶或普通斑。利用以上兩點，將來自姬蠶或普通斑的轉基因品種內自交后，對應的雌蛾再與虎斑的雄蛾雜交(交配方式為：轉基因♀×轉基因♂×虎斑♂)，后代將出現姬蠶或普通斑和虎斑，再將該f1代的虎斑進行轉基因標記基因檢測，如果全部為轉基因個體，說明該雜交方式中的雌蛾為整合位點純合子；如果出現非轉基因個體，則說明該雜交方式中的雌蛾為整合位點雜合子；而雜交方式(轉基因♀×轉基因♂×虎斑♂)中轉基因♂的整合位點純合性，通過測交驗證。兩種方法相結合即可篩選出雙親均為純合子的后代留種。

二、操作步驟

<1>飼養200頭以上轉同一個表達載體的轉基因家蠶到化蛾，選取雌蛾與雄蛾交配2小時后拆對；將該雄蛾與非轉基因家蠶品種的雌蛾雜交(即測交)，該雌蛾產的卵編號為1；而剛剛自交交配完的轉基因雌蛾再與虎斑品種的雄蛾雜交，交配后該雌蛾產的卵編號為3；如有必要，可對虎斑雄蛾進行測交驗證其純合性，即將上述拆對后的虎斑雄蛾與姬蠶品種的雌蛾雜交，所產的卵編號為2；每一次交配的時間均為2小時，交配結束后留下雌蛾放入對應的蛾圈里產卵過夜；為保證后續的篩選，每一組交配方式均制備25個蛾圈以上的卵，對應編號分別編寫為1-1、2-1、3-1；1-2、2-2、3-2……1-25、2-25、3-25；

<2>第二天收集所產的卵，進行即時浸酸催青，讓其發育；而產完卵的雌蛾也一一收集起來，進行相關病原檢測，保證其后代的健康性；

<3>催青后期，蠶種轉青后，按轉基因載體設計的熒光標記，進行相應篩選標記的檢測，篩選標記基因表達的為轉基因個體，而檢測不到表達的為非轉基因個體；

<4>轉基因品系雄蛾測交所產的卵(即編號為1的蛾圈)，通過檢測熒光標記基因的表達情況，標記并淘汰整個蛾圈內有不表達個體出現的蛾圈；有不表達個體出現的蛾圈對應雄蛾交配后所產的卵也一并標注出來進行淘汰；例如，1-5的蛾圈檢測到有不表達熒光標記的個體，則為同一個父本所得到的卵3-5也一并標注出來進行淘汰；

<5>檢測完編號為1的蛾圈后，對保留下來編號為3的蛾圈進行熒光標記檢測，保留整個蛾圈內所有個體均有表達的蛾圈，淘汰有不表達個體出現的蛾圈；

<6>飼養經過上述熒光標記檢測后篩選留下的蛾圈和對應的虎斑測交蛾圈；單蛾區飼養方式飼養，四齡起蠶第二餐，調查蠶體斑紋；對應虎斑測交后代全為虎斑，與其同一父本的混精雜交后代如果出現虎斑和姬蠶(或普通斑)，則對該混精雜交后所產蛾圈內的虎斑(或全部個體最好)進行熒光標記檢測，如果所檢測的個體均有熒光，表明該父母本均為轉基因整合位點純合子；保留該純合子后代中的姬蠶(或普通斑)，并留種繼代，即為轉基因純合品系。

三、分析驗證方法

分析后代是否分離，驗證選出的純合品系：催青選出的純合系蠶卵至轉青，調查標記基因表達情況，一個蛾圈內所有個體均有表達；繼續飼養該蛾圈的所有個體至化蛾，自交14蛾留種，剩下的蛾與常規非轉基因蠶品種進行雜交并制種，讓這些種孵化至轉青，調查標記基因表達情況，所有自交和雜交的蠶卵均為陽性。

四、kap3.2-r轉基因家蠶的應用

1、轉基因陽性個體篩選方式

羊毛kap3.2及red基因是通過piggybac轉座子轉入家蠶基因組。標記基因為在蠶眼中特異表達的紅色熒光蛋白基因(dsred)，dsred基因與目的基因位于同一個轉座載體內，但啟動子不同。通過檢測紅色熒光蛋白的表達與否來判斷是否為轉基因陽性個體。紅色熒光蛋白發出的信號可在裝有相應波長濾光片的熒光顯微鏡下檢測。如果為轉基因陽性蠶個體，其胚胎發育后期、小蠶期、大蠶期、蛹期和蛾期的眼睛內均能檢測到紅色熒光信號，這是目前轉基因家蠶制備中普遍使用的篩選方式。

2、kap3.2-r轉基因家蠶的初步遺傳分析及蠶體斑紋

kap3.2-r的在家蠶基因組中的插入位點及拷貝數尚未完成分子檢測，通過自交和雜交后遺傳分析發現，該轉基因家蠶后代分離比與孟德爾單基因遺傳分離比不相符合，暗示外源基因在該轉基因家蠶基因組中不是單拷貝整合，而且為雜合子。

kap3.2-r家蠶的轉基因注射親本為現行品種932，幼蟲蠶體為白色，無任何斑紋，即姬蠶。

3、kap3.2-r轉基因家蠶純合品系的獲得過程

<1>飼養200頭以上kap3.2-r轉基因家蠶到化蛾，選取雌蛾與雄蛾交配2小時后拆對(kap3.2-r♀×kap3.2-r♂)。將該kap3.2-r♂蛾再與非轉基因家蠶品種932♀雜交(即測交932♀×kap3.2-r♂)，交配2小時后拆對，932♀投入蛾圈內產卵過夜，所產的卵編號為1。而剛剛自交交配完的kap3.2-r♀再與虎斑品種的雄蛾雜交(kap3.2-r♀×虎斑)，交配2小時后拆對，kap3.2-r♀投入蛾圈內產卵過夜，所產的卵編號為3。對虎斑雄蛾進行測交驗證其純合性，即將上述拆對后的虎斑雄蛾與姬蠶品種的雌蛾雜交(932♀×虎斑♂)，交配2小時后拆對，932♀投入蛾圈內產卵過夜，所產的卵編號為2。為保證后續的篩選，每一組交配方式均制備30個蛾圈以上的卵，對應編號分別編寫為1-1、2-1、3-1；1-2、2-2、3-2……1-30、2-30、3-30。本次試驗共制備了30蛾，1、2、3種編號均產卵較好(200粒以上)的蛾圈有28圈。注意每一次拆對再重新交配時，蠶品種要確保準確無誤，編號要一一對應。

<2>第二天收集所產的卵，進行即時浸酸催青，讓其發育。而產完卵的雌蛾也一一收集起來，進行相關病原檢測，保證其后代的健康性。

<3>催青后期，蠶種轉青后，進行熒光的檢測，結果見表1。

<4>轉基因品系雄蛾測交所產的卵(即編號為1的蛾圈)，通過檢測熒光標記基因的表達情況，標記并淘汰整個蛾圈內有不表達個體出現的蛾圈。與所標記蛾圈同一個父本的編號為3的蛾圈也標記出來，并淘汰。例如，1-6的蛾圈檢測到有不表達熒光標記的個體，則為同一個父本所得到的卵3-6也一并標注出來進行淘汰。

<5>檢測完編號為1的蛾圈后，對保留下來編號為3的蛾圈進行熒光標記檢測，保留整個蛾圈內所有個體均有熒光的蛾圈，淘汰有陰性個體出現的蛾圈。本試驗最終保留下5個蛾圈(見表1)。

<6>飼養經過上述熒光標記檢測后篩選留下的蛾圈和對應的虎斑測交蛾圈。單蛾區飼養方式飼養，四齡起蠶第二餐，調查蠶體斑紋。對應虎斑測交后代全為虎斑，與其同一父本的混精雜交后代如果出現虎斑和姬蠶，則對該混精雜交后所產蛾圈內的虎斑進行熒光標記檢測，如果所檢測的個體均有熒光，表明該父母本均為轉基因整合位點純合子(見表2)。保留該純合子后代中的姬蠶，并留種繼代，即為轉基因純合品系。

本試驗飼養的編號為2的虎斑測交蠶卵全為虎斑，表明所使用的虎斑為純合種。所飼養的混精雜交的5個蛾區里均有姬蠶和虎斑出現，說明混精雜交成功，但兩種斑紋的比率在各個蛾圈中的表現不一(見表2)；經過熒光檢測，所有蛾區內的虎斑均為轉基因陽性個體，與卵期檢測結果一致，最后只保留了一個蛾區3-4作為純合品系，留種繼代。

表1kap3.2-r測交及混精雜交f1代卵期轉基因熒光檢測結果

表2kap3.2-r混精雜交f1代蠶期調查結果

4、kap3.2-r轉基因家蠶純合品系的驗證

催青3-4蠶卵至轉青，調查標記基因表達情況，一個蛾圈內所有個體均有表達；繼續飼養該蛾圈的所有個體至化蛾，自交14蛾留種，剩下的蛾與常規非轉基因蠶品種進行雜交并制種，讓這些蠶種孵化至轉青，調查標記基因表達情況，所有自交和雜交的蠶卵均為陽性。

五、932×kap4.3黃繭轉基因家蠶的應用

1、轉基因陽性個體篩選方式

932×kap4.3黃繭轉基因家蠶是由非轉基因品種932與轉基因品種kap4.3雜交后，選擇淡黃色繭自交留下來的品系。標記基因及篩選方式與kap3.2-r轉基因家蠶相同。

2、轉基因家蠶品系932×kap4.3黃繭的基本情況

kap4.3品種為轉羊毛角蛋白4.3基因到家蠶中形成的轉基因品種，通過分子檢測，在基因組中的整合方式為單拷貝整合到7號染色體。932×kap4.3黃繭品系自交兩代后仍然有非轉基因個體分離出來，是雜合子。

932×kap4.3黃繭品系的蠶體斑紋為普通斑，胸節有眼狀紋、腹節有半月紋。

3、932×kap4.3黃繭轉基因家蠶的純化過程

<1>飼養200頭以上932×kap4.3黃繭轉基因家蠶到化蛾，選取雌蛾與雄蛾交配2小時后拆對。將該轉基因雄蛾再與非轉基因家蠶品種932♀雜交，交配2小時后拆對，932♀投入蛾圈內產卵過夜，所產的卵編號為1。而剛剛自交交配完的轉基因雌蛾再與虎斑品種的雄蛾雜交，交配2小時后拆對，雌蛾投入蛾圈內產卵過夜，所產的卵編號為3。為保證后續的篩選，每一組交配方式均制備30個蛾圈以上的卵，對應編號分別編寫為1-1、3-1；1-2、3-2……1-30、2-30、3-30。因932×kap4.3黃繭的蠶蛹健康性不佳，本次試驗共制備了35蛾，各編號均產卵較好(200粒以上)的蛾圈有30圈。

<2>第二天收集所產的卵，進行即時浸酸催青，讓其發育。而產完卵的雌蛾也一一收集起來，進行相關病原檢測，保證其后代的健康性。

<3>催青后期，蠶種轉青后，進行熒光的檢測，結果見表3。

<4>轉基因品系雄蛾測交所產的卵(即編號為1的蛾圈)，通過檢測熒光標記基因的表達情況，標記并淘汰整個蛾圈內有不表達個體出現的蛾圈。與所標記蛾圈同一個父本的編號為3的蛾圈也標記出來，并淘汰。

<5>檢測完編號為1的蛾圈后，對保留下來編號為3的蛾圈進行熒光標記檢測，保留整個蛾圈內所有個體均有熒光的蛾圈，淘汰有陰性個體出現的蛾圈。本試驗最終保留下6個蛾圈(見表3)。

<6>飼養經過上述熒光標記檢測后篩選留下的蛾圈和對應的虎斑測交蛾圈。單蛾區飼養方式飼養，四齡起蠶第二餐，調查蠶體斑紋。混精雜交f1代如果出現虎斑和普通斑，對該混精雜交后所產蛾圈內的虎斑進行熒光標記檢測，如果所檢測的個體均有熒光，表明該父母本均為轉基因整合位點純合子。保留該純合子后代中的普通斑，并留種繼代，即為轉基因純合品系。

由于前一試驗中已經驗證所保留的虎斑為純合品種，故本次試驗中就不再做虎斑測交驗證，減少了飼養量。所飼養的混精雜交的6個蛾區里，3-1沒有普通斑出現，混精雜交失敗。3-6和3-26兩個蛾區出現的虎斑頭數也遠大于普通斑，混精雜交也不夠成功。同時飼養，932×kap4.3黃繭品系的死籠率較虎斑高，健康性不佳，造成932×kap4.3黃繭品系的蠶蛾精子活性不及虎斑，導致混精雜交成功率低(見表4)。所以混精雜交過程中，保證兩種雄性精子的活力一致可大大提高混精雜交成功率。經過熒光檢測，所有蛾區內的虎斑均為轉基因陽性個體，與卵期檢測結果一致，最后只保留了一個蛾區3-11作為純合品系，留種繼代。

表3932×kap4.3黃繭測交及混精雜交f1代卵期轉基因熒光檢測結果

表4932×kap4.3黃繭混精雜交f1代蠶期調查結果

4、932×kap4.3黃繭轉基因家蠶純合品系的驗證

催青3-11蠶卵至轉青，調查標記基因表達情況，一個蛾圈內所有個體均有表達；繼續飼養該蛾圈的所有個體至化蛾，自交14蛾留種，剩下的蛾與常規非轉基因蠶品種進行雜交并制種，讓這些蠶種孵化至轉青，調查標記基因表達情況，所有自交和雜交的蠶卵均為陽性。

實際使用表明，本發明進行轉基因家蠶純合品系的篩選和培育，快速、高效、技術難度系數低，大大縮短了育種周期，為轉基因家蠶品種的培育提供重要的技術支撐。與現有技術相比，本發明與具有如下突出優點：

<1>成本低。本發明挑選純合品系的全過程操作無需任何分子生物學試驗，制種及飼養蠶的工作量也不大，大大的節約了成本。只要保證混精雜交的親本健康性一致，成功率較高。另外一次試驗中，發明人混精雜交制備20蛾，就挑選出2個純合的蛾圈。經過轉基因熒光檢測，可排除大多數的雜合蛾圈，如上述實例中混精雜交獲得28蛾，熒光檢測后淘汰23蛾，淘汰率約為82％，最后只需要飼養5蛾，留種1蛾。

<2>簡單、易操作。使用本發明挑選純合品系的全過程操作只有養蠶、制種和轉基因熒光檢測，技術要求低，不像分子生物學試驗那樣，對操作人員要求一定的專業背景，甚至無任何專業背景的工人稍加培訓都可以按本方法挑選出純合品系。

<3>速度快、效率高。使用本發明挑選純合品系在測試出外源基因整合位置、拷貝數等信息前就可進行，2代內就能獲得純合品系，轉基因家蠶品系外源基因的純合性得到快速保證，大大縮短了轉基因家蠶品種遺傳機制研究和開發利用的周期。

<4>應用面廣。無論外源基因在基因組的插入拷貝數多少，均可采用本方法進行純合子的篩選。

<5>本發明能保證篩選出的純合子基因型的純合性。通過后續的驗證步驟：同一蛾圈內除自交留種的14只雌蛾外，其余個體均與非轉基因個體雜交(測交)，然后結合篩選標記檢測，依據調查的轉基因表達比率，能有效證明前期篩選的純合品系的純合性，確保篩選出的純合子準確無誤。