專利名稱：重組人硒蛋白p基因表達(dá)純化方法及專用引物與培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域人體蛋白基因的表達(dá)純化方法與專用引物及培養(yǎng)基，特別是重組人硒蛋白P基因的表達(dá)純化方法與專用引物及專用培養(yǎng)基。
原核細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞的硒蛋白均含有硒半胱氨酸，如原核細(xì)胞的甲酸脫氫酶、動(dòng)物細(xì)胞的谷胱甘肽過氧化物酶、甲狀腺原氨酸脫碘酶、硒蛋白P等。各種硒蛋白的活性中心均決定于硒半胱氨酸，硒半胱氨酸在其基因閱讀框架中均編碼為TGA，而TGA在一般蛋白的翻譯時(shí)作為終止密碼。已發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物細(xì)胞硒蛋白中，絕大多數(shù)蛋白的多肽鏈含一個(gè)硒半胱氨酸。人硒蛋白P(HSEP)是在人血漿中發(fā)現(xiàn)的富硒蛋白，具有多種抗氧化功能，而人硒蛋白P卻含有十個(gè)硒半胱氨酸，即其基因閱讀框架中有十個(gè)終止密碼TGA，這給用基因工程方法表達(dá)人硒蛋白P基因帶來了非常大的困難。本發(fā)明的發(fā)明人通過基因重組的方法，構(gòu)建了一種重組人硒蛋白P，其在3′端非編碼區(qū)內(nèi)包括干環(huán)部分，使在轉(zhuǎn)錄基因不變的情況下，閱讀時(shí)不受終止密碼的控制。該重組基因的序列發(fā)表于Hill KEPNAS,1993 vol.90,pp537-541；Yasui Y,Yang JGGene,1996 vol,pp269-270。
本發(fā)明的目的是提供一種上述重組人硒蛋白P基因表達(dá)純化的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，包括以下步驟(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反轉(zhuǎn)錄PCR法擴(kuò)增硒蛋白P的基因；(2)、將上述擴(kuò)增的硒蛋白P基因與克隆載體連接，構(gòu)建人硒蛋白P克隆質(zhì)粒；(3)、將上述人硒蛋白P克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體，再將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌；(4)、表達(dá)全長人硒蛋白Pa、將上述帶有人硒蛋白P基因的表達(dá)載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個(gè)菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內(nèi)，在30℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測菌液A650OD值為0.5時(shí)停止培養(yǎng)；c、將上述菌液放入裝有富硒培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)5小時(shí)，測菌液A650OD值，當(dāng)OD值為1.0時(shí)，向菌液內(nèi)加IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)；d、收獲細(xì)菌；(5)、純化人硒蛋白Pa、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、裂解細(xì)菌，離心取上清液；c、初步純化人硒蛋白P；d、用金屬鎳螯合劑親和層析進(jìn)行純化。
本發(fā)明的另一目的是提供一種重組人硒蛋白P基因表達(dá)純化中的專用引物及專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明專用引物的基因序列為引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′本發(fā)明的專用培養(yǎng)基，由下列配方組成富硒酵母提取物10克蛋白凍16-20克亞硒酸鈉 1-20微克氯化鈉10克加無離子水至1000毫升本發(fā)明由于采用了上述方法，特別是由于采用了本發(fā)明的專用引物及專用培養(yǎng)基，使重組人硒蛋白P基因能夠得到表達(dá)和純化，為對(duì)人硒蛋白P的進(jìn)一步科學(xué)研究及批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步說明。


圖1為純化的人硒蛋白P的電泳圖實(shí)施例一、人硒蛋白P基因cDNA的獲得1、取2克人胎兒肝細(xì)胞，采用美國Trizol RNA抽提試劑盒推薦方法提取總RNA，將總RNA走變性膠，確認(rèn)總RNA的質(zhì)量可靠；2、設(shè)計(jì)引物如下引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′3、以上述總RNA為模版，PCR反轉(zhuǎn)錄合成人硒蛋白P的cDNA,PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)(Scarf S.J.,In PCR ProtocolA Guide to Method andApplication,and ed.New York,Academic Press,USA 1990)進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃變性50秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘4、PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳初步確證后，酚/氯仿抽提回收；二、構(gòu)建人硒蛋白P克隆質(zhì)粒
1、按照Klenow多聚酶推薦方法，將PCR產(chǎn)物用Klenow多聚酶補(bǔ)平。
2、將補(bǔ)平的PCR產(chǎn)物與EcoRV酶切的pBluscript KS載體(任何的克隆載體均可以，如PUC19,pGEM等)平端連接，連接反應(yīng)體系如下pBluscript KS(EcoRV酶切) 1ul5x連接緩沖液2ulT4 DNA連接酶1ulEcoRV(1u/1ul) 0.5ulPCR產(chǎn)物 4ulH2O 1.5ul以上混合物16℃連接12小時(shí)；3、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素LB板，挑取陽性克隆，用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒DNA用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pBLU-HSEP；三、表達(dá)質(zhì)粒pMAL-HSEP的構(gòu)建1、將上述pBLU-HSEP克隆載體中人硒蛋白P(HSEP)的基因片段用SalⅠ和PstⅠ雙酶切下，經(jīng)1％瓊脂糖電泳，回收約1.4 Kb的人硒蛋白P的基因片段；2、將上述該片段與相同酶切的pMAL表達(dá)載體(表達(dá)載體是多樣的，如pBluescript KS、pPUC、pGEM等)連接，連接反應(yīng)體系如下pMAL(SalⅠ,PstⅠ酶切)1ul5x連接緩沖液 2ulT4 DNA連接酶 1ulHSEP 5ulH2O 1ul以上混合物16℃連接12小時(shí)3、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素LB板，挑取陽性克隆；4、用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒DNA用SalⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pMAL-HSEP；四、HSEP在大腸桿菌中的表達(dá)1、將篩選出的在E.coli JM109中的重組質(zhì)粒pMAL-HSEP克隆接種10mlLB試管，16℃ 300r/min搖床培養(yǎng)，測菌液A650 OD值為0.5時(shí)停止培養(yǎng)；2、制備富硒培養(yǎng)基(TYSeY培養(yǎng)基)，其配方為富硒酵母提取物 10克蛋白凍 16克亞硒酸鈉 5微克氯化鈉 10克加無離子水至1000毫升其中富硒酵母提取物可購自美國difco公司，也可自制，自制方法為接種釀酒酵母菌于豐富培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，20ug/L亞硒酸鈉)，30℃搖床培養(yǎng)3天，收集酵母菌，離心5000r/min 20分鐘，去上清液，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)溶沉淀，超聲破碎菌體，離心10000r/min20分鐘，干燥沉淀。
3、將上述10ml菌液放入裝有1000ml TYSeY培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)300r/min，測菌液A650 OD值，當(dāng)OD值為1.0時(shí)，向菌液內(nèi)加IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)；4、收集細(xì)菌，以3000轉(zhuǎn)/分，4℃，離心20分鐘，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸鹽緩沖液混溶沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃凍存；五、HSEP的分離純化1、將細(xì)菌沉淀用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心5000轉(zhuǎn)/分，4℃，5分鐘，去上清液，再用磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；2、用超聲破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使細(xì)菌裂解，4℃條件下12000轉(zhuǎn)/分離心，30分鐘，取上清液；3、按麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析試劑盒(美國BioLab公司)推薦方法純化融合蛋白將離心后上清液裝親和層析柱，然后用磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗層析柱，最后用10mM麥芽糖磷酸鹽緩沖液洗脫單一蛋白峰，將洗脫下的融合蛋白進(jìn)行酶切，反應(yīng)如下融合蛋白(1mg/m1) 20ul酶因子Xa(200 ug/m1) 1ul室溫下反應(yīng)3小時(shí)；4、用金屬鎳螯合劑親和層析按Ni-NTA蛋白純化試劑盒(美國QIAGEN公司)推薦方法進(jìn)行純化將酶切后的蛋白混合物用磷酸鹽緩沖液(pH8.0)透析，上述透析平衡的HSEP溶液人Ni-NTA，混勻，放置30分鐘，用磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗二次后用100mM咪唑(imidazol)磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗脫；將純化的人硒蛋白P走12％的聚丙烯酰胺膠，如
圖1所示，所得HSEP溶液SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)一條帶(A為目的產(chǎn)物的帶，B對(duì)照帶)，其分子量為40Kd，與天然人硒蛋白P相符。
在上述實(shí)施例中，表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建還可以用一對(duì)上游和下游的5′端各帶有和表達(dá)載體相對(duì)應(yīng)的二個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，以人硒蛋白P克隆質(zhì)粒DNA為模板，做PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物用常規(guī)方法進(jìn)行純化；用二個(gè)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行酶切，用常規(guī)方法純化酶切后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體；用T4連接酶將純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體連接(與上述實(shí)施例三、表達(dá)質(zhì)粒pMAL-HSEP的構(gòu)建中的1、2、3、4所述的步驟相同)。
富硒培養(yǎng)基(TYSeY培養(yǎng)基)，其配方還可為富硒酵母提取物8克蛋白凍18克亞硒酸鈉 20微克氯化鈉10克加無離子水至 1000毫升或富硒酵母提取物 12克蛋白凍 20克亞硒酸鈉 1微克氯化鈉 10克加無離子水至1000毫升
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反轉(zhuǎn)錄PCR法擴(kuò)增硒蛋白P的基因；(2)、將上述擴(kuò)增的硒蛋白P基因與克隆載體連接，構(gòu)建人硒蛋白P克隆質(zhì)粒；(3)、將上述人硒蛋白P克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體，再將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌；(4)、表達(dá)全長人硒蛋白Pa、將上述帶有人硒蛋白P基因的表達(dá)載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個(gè)菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內(nèi)，在30℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測菌液A650OD值為0.5時(shí)停止培養(yǎng)；c、將上述菌液放入裝有富硒培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)5小時(shí)，測菌液A650OD值，當(dāng)OD值為1.0時(shí)，向菌液內(nèi)加IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)；d、收獲細(xì)菌；(5)、純化人硒蛋白Pa、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、裂解細(xì)菌，離心取上清液；c、初步純化人硒蛋白P；d、用金屬鎳螯合劑親和層析進(jìn)行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄PCR法擴(kuò)增硒蛋白P的基因所用的引物為引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，其特征在于所述將人硒蛋白P克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體的方法為表達(dá)載體為任一表達(dá)載體；用一對(duì)上游和下游的5′端各帶有和表達(dá)載體相對(duì)應(yīng)的二個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，以人硒蛋白P克隆質(zhì)粒DNA為模板，做PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物用常規(guī)方法進(jìn)行純化；用二個(gè)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行酶切，用常規(guī)方法純化酶切后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體；用T4連接酶將純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，其特征在于所述將人硒蛋白P克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體的方法為表達(dá)載體為任一表達(dá)載體；選用克隆載體和表達(dá)載體上相同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用一個(gè)限制性內(nèi)切酶對(duì)克隆載體和表達(dá)載體酶切，切出克隆載體內(nèi)的硒蛋白P基因序列，切去表達(dá)載體內(nèi)的多克隆位點(diǎn)序列；用常規(guī)方法純化硒蛋白P基因序列和切去表達(dá)載體內(nèi)多克隆位點(diǎn)序列的表達(dá)載體；用T4連接酶將純化的人硒蛋白P基因序列和表達(dá)載體連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，其特征在于在所述表達(dá)全長人硒蛋白P的過程中，LB培養(yǎng)基中加入的抗生素為氨芐青霉素；收獲細(xì)菌的方法為將培養(yǎng)物以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去上清液，收集沉淀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因的方法，其特征在于在所述純化人硒蛋白P的步驟中，用磷酸鹽緩沖液洗洗細(xì)菌沉淀后，離心的速度為5000轉(zhuǎn)/分，持續(xù)5分鐘；細(xì)菌裂解的方法為超聲破碎法或溶菌酶裂解法，細(xì)菌裂解后的離心為12000轉(zhuǎn)/分，持續(xù)30分鐘，取上清液；初步純化的方法為離子交換層析或分子篩法。
7.一種表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因中的專用引物，其基因序列為引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′
8.一種表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因中的專用培養(yǎng)基，由下列配方組成富硒酵母提取物8-12克蛋白凍16-20克亞硒酸鈉 1-20微克氯化鈉10克加無離子水至1000毫升
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種表達(dá)純化重組人硒蛋白P基因中的專用培養(yǎng)基，其特征在于它是由下列配方組成的富硒酵母提取物 10克蛋白凍 16克亞硒酸鈉 5微克氯化鈉 10克加無離子水至1000毫升
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人硒蛋白P基因的表達(dá)純化方法與專用引物及專用培養(yǎng)基,該方法將人肝細(xì)胞cDNA,用PCR方法(引物1為5′GTGGTTGTGACAACCCCAGC3引物2為5′AATGGAAAGCATGTCTTTGT)獲得人硒蛋白P基因,并將該基因重組后克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中,在有1-20ng/ml亞硒酸鈉及富硒酵母提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物用金屬螯合鎳親和層析純化,本發(fā)明的方法為大量生產(chǎn)人硒蛋白P奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1314469SQ0010313
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者楊建國 申請(qǐng)人:北京市營養(yǎng)源研究所