本發明屬于含硒化合物領域，尤其涉及一種硒代蛋氨酸的應用。

背景技術：

硒是一種生物體必需的微量元素，適當補硒對預防某些重大疾病具有良好的效果。硒的存在形式有無機硒和有機硒兩種，常見的無機硒有亞硒酸鈉和硒酸鈉，有機硒主要是硒蛋白和硒多糖。然而無機硒在蓄積性毒性和致突變作用方面遠遠超過有機硒，有機硒副作用相對較小，其不僅能夠更好地發揮硒的作用，而且在激發免疫反應上比無機硒顯著。因此從天然產物中分離或人工合成新的硒化合物，研究其抗病效能及相關生物學活性具有非常重要的意義。

在眾多硒蛋白類物質中，硒代蛋氨酸具有極強的抗氧化性，是機體攝入硒的主要化合物之一，因此在機體內的生物活性高、利用率高，毒性低。而現有的治療神經退行性疾病的藥物有很多種，但是尚未有硒類化合物對神經干細胞增殖的研究。

因此，現有技術存在缺陷，需要改進。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于提供一種硒代蛋氨酸的應用，為治療神經退行性疾病、修復受損神經系統提供了又一新的藥物來源，同時拓展了硒代蛋氨酸的市場應用前景。

本發明是這樣實現的，一種硒代蛋氨酸的應用，所述應用為將所述硒代蛋氨酸用于制備促進神經再生的藥物/保健品。

進一步地，將所述硒代蛋氨酸用于制備促進神經干細胞增殖的藥物/保健品。

進一步地，將所述硒代蛋氨酸用于制備促進神經干細胞向神經元分化的藥物/保健品。

進一步地，將所述硒代蛋氨酸用于制備治療神經退行性疾病或治療神經系統受損的藥物/保健品。

本發明還提供了一種硒代蛋氨酸的應用，所述應用為將所述硒代蛋氨酸用于制備激活β-Catenin的活性而促進Wnt通路的激活的藥物/保健品。

本發明還提供了一種硒代蛋氨酸的應用，所述應用為將所述硒代蛋氨酸用于制備抑制神經干細胞中GSK3β的活性的藥物/保健品。

本發明還提供了一種硒代蛋氨酸的應用，所述應用為將所述硒代蛋氨酸用于制備激活神經干細胞中PI3K-Akt信號調控通路的藥物/保健品。

本發明還提供了一種硒代蛋氨酸的應用，所述應用為將所述硒代蛋氨酸用于制備降低神經干細胞中GSK3β的活性，促進Wnt通路的激活的藥物/保健品。

本發明與現有技術相比，有益效果在于：硒代蛋氨酸是一種抗氧化類的物質，本研究證實其對神經再生具有顯著促進作用。本發明實施例提供的硒代蛋氨酸的應用，將所述硒代蛋氨酸用于制備促進神經再生的藥物/保健品，對促進動物神經再生具有顯著療效。具體對神經退行性疾病或神經系統受損具有一定的預防和治療作用，這對于神經系統的修復，改善記憶和認知具有非常重要的意義。

附圖說明

圖1是本發明實施例1提供的通過CCK-8檢測的硒代蛋氨酸對神經干細胞的活力的影響的結果示意圖；

圖2是本發明實施例1提供的采用免疫熒光檢測的硒代蛋氨酸對神經干細胞增殖的影響的結果示意圖；

圖3是本發明實施例1提供的采用形態學觀察檢測的硒代蛋氨酸對神經干細胞增殖的影響的結果示意圖，其中圖3a為光學顯微鏡下觀察神經球的形態及大小示意圖，圖3b為統計學t-test分析比對加藥組和對照組中神經球的大小示意圖；

圖4是本發明實施例1提供的采用免疫印跡法檢測的硒代蛋氨酸對與神經干細胞再生相關的Wnt信號通路中蛋白水平的結果示意圖，其中圖4a為免疫印跡結果示意圖，圖4b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖；

圖5是本發明實施例1提供的采用免疫印跡法檢測的硒代蛋氨酸對與神經干細胞再生相關的GSK3β蛋白水平的結果示意圖，其中圖5a為免疫印跡結果示意圖，圖5b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖；

圖6是本發明實施例1提供的采用免疫印跡法檢測的硒代蛋氨酸對與神經干細胞再生相關的PI3K-Akt信號通路中蛋白水平的結果示意圖，其中圖6a為免疫印跡結果示意圖，圖6b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖；

圖7是本發明實施例2提供的通過免疫印跡檢測的硒代蛋氨酸對神經干細胞向神經元分化的影響的結果示意圖，其中圖7a為免疫印跡結果示意圖，圖7b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖；

圖8是本發明實施例2提供的通過免疫熒光檢測硒代蛋氨酸對神經干細胞向神經元分化的影響的體外研究結果示意圖；

圖9是本發明實施例3提供的通過免疫熒光檢測的硒代蛋氨酸對小鼠腦內海馬體中神經再生的影響結果示意圖；

圖10是是本發明實施例3提供的通過免疫熒光檢測的硒代蛋氨酸對小鼠腦內海馬體中神經元增殖的影響的檢測結果示意圖；

圖11是本發明實施例3提供的硒代蛋氨酸對小鼠腦內神經再生通路中Wnt信號通路相關激酶的水平的影響的結果示意圖，其中圖11a為免疫印跡結果示意圖，圖11b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖；

圖12是本發明實施例3提供的硒代蛋氨酸對小鼠腦內神經再生通路中GSK3β激酶的水平的影響的結果示意圖，其中圖12a為免疫印跡結果示意圖，圖12b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖；

圖13是本發明實施例3提供的硒代蛋氨酸對小鼠腦內神經再生通路中PI3K-Akt信號通路相關激酶的水平的影響的結果示意圖，其中圖13a為免疫印跡結果示意圖，圖13b為統計學t-test灰度分析比對加藥組和對照組中蛋白水平的差異示意圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

神經再生是指神經干細胞增殖、分化、遷移、整合到神經回路中生成功能性神經元的過程。成年哺乳動物的中樞神經系統中均存在神經干細胞，并且能夠整合入神經回路與其它神經元形成突觸聯系進而發揮功能。

本發明實施例提供了一種硒代蛋氨酸的應用，所述應用為將所述硒代蛋氨酸用于制備促進神經再生的藥物/保健品。

進一步地，藥物/保健品用于治療神經退行性疾病或治療神經系統受損。

硒代蛋氨酸是一種抗氧化類的物質，本研究證實其對神經再生具有顯著促進作用。本發明實施例提供的硒代蛋氨酸的應用，將所述硒代蛋氨酸用于制備促進神經再生的藥物/保健品，對促進動物神經再生具有顯著療效。具體對神經退行性疾病或神經系統受損具有一定的預防和治療作用，這對于神經系統的修復，改善記憶和認知具有非常重要的意義。

進一步地，所述藥物/保健品用于促進神經干細胞增殖。

具體地，所述藥物/保健品中硒代蛋氨酸的濃度為1～45μM。硒代蛋氨酸對神經干細胞的活力影響存在與時間相關的劑量效應，作用12h時，隨著硒代蛋氨酸濃度升高，細胞活力逐漸增強，但總體作用效果不明顯；當作用時間達到24h時，1～45μM的Se-Met對于NSCs的增殖具有非常好的促進效果，而高濃度(50μM以上)的Se-Met導致細胞活力明顯下降(p<0.05)，說明高濃度的Se-Met對NSCs的存活具有顯著的損傷作用；當Se-Met作用時間達到48h之后，1～45μM的Se-Met都能夠顯著提高神經干細胞的活力(p<0.05)，對NSCs的增殖具有顯著的促進作用，而50μM以上的Se-Met則導致NSCs的細胞活力明顯下降，具有一定的細胞毒性。

具體地，所述藥物/保健品用于激活神經干細胞中β-Catenin的活性而促進Wnt通路的激活。Wnt通路在神經再生的過程中發揮非常重要的作用，在NSCs增殖的過程中，加入Se-Met的NSCs的β-catenin的含量有上升，但是沒有顯著性差異，而抑制其活性的磷酸化β-catenin水平顯著下降(p<0.05)，磷酸化β-catenin比β-catenin的水平顯著下降。由此可知，在NSCs中加入Se-Met之后，β-catenin的活性抑制作用被緩解，其活性獲得激活。具體表現在，β-catenin下游的細胞周期蛋白D(Cyclin-D)能夠促進細胞的有絲分裂，在細胞增殖的過程中起到重要作用。在NSCs中加入Se-Met之后，Cyclin-D的表達量顯著上升，從而加快NSCs的有絲分裂過程，促進其快速增殖。

具體地，所述藥物/保健品用于抑制神經干細胞中糖原合成激酶3β(GSK3β)的活性。GSK3β在調節細胞的增殖、分化、存活以及凋亡的過程中均起到一定的作用，在NSCs中加入Se-Met后，GSK3β的蛋白水平顯著下降。而磷酸化的GSK3β(P-GSK3β)能夠抑制GSK3β的活性，在NSCs中加入Se-Met后，p-GSK3β的水平顯著升高，磷酸化GSK3β比GSK3β的比值顯著上升。由此可知，在NSCs中加入Se-Met能夠顯著抑制GSK3β的活性。

具體地，所述藥物/保健品用于激活神經干細胞中PI3K-Akt信號調控通路。PI3K-Akt信號通路在細胞的增殖、抑制細胞凋亡、維持干細胞多能性等方面具有重要作用，同時也能夠調控海馬齒狀回顆粒下層區以及其他腦區的神經再生的發生過程。Akt即蛋白激酶B，參與調控很多生物反應過程，包括神經再生、細胞的增殖、生長及凋亡。此外，Akt具有激活蛋白的磷酸化的功能，Akt可以促進GSK3β的磷酸化，從而降低GSK3β的活性。在NSCs中加入Se-Met后，NSCs中Akt的蛋白變化水平沒有發生顯著性變化，而磷酸化Akt(Thr-308)的水平顯著上升，磷酸化Akt比總Akt的比值顯著上升。由此可知，在NSCs中加入Se-Met，能夠顯著激活Akt的活性。

PI3K即磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，主要起激活Akt的作用。在NSCs中加入Se-Met后，磷酸化PI3K的蛋白水平顯著升高，而總PI3K的蛋白含量沒有顯著變化，磷酸化PI3K(Tyr-458)與總PI3K的比值呈顯著上升趨勢。由此可知，加入Se-Met之后PI3K的活性顯著上升，繼而促進Akt的表達。

綜合以上，Se-Met能夠激活神經干細胞中PI3K/Akt/Wnt通路的相關蛋白，繼而促進NSCs的增殖。

進一步地，所述藥物/保健品用于促進神經干細胞向神經元分化。在NSCs中加入Se-Met后，Se-Met中的神經元數量增多，且密度也相對更加密集從單個神經元的形態比較，加入Se-Met之后，神經元的樹突數量明顯增加，并且軸突的長度和寬度都顯著增加。此外，加入Se-Met之后，神經元(NeuN)中的蛋白水平呈顯著上升的趨勢，而星形膠質細胞(GFAP)的蛋白水平呈顯著下降的趨勢。這些結果表明：Se-Met能夠促進體外神經干細胞向神經元分化。

具體地，所述藥物/保健品用于激活轉基因小鼠腦內PI3K-Akt信號調控通路。在Se-Met治療之后在小鼠的海馬中，PI3K的總蛋白含量有上升趨勢，但沒有顯著性差異，磷酸化PI3K的蛋白水平呈顯著上升趨勢，磷酸化PI3K與PI3K的比值呈顯著上升趨勢。這說明加入Se-Met之后，PI3K的活性被顯著提升。加入Se-Met之后Akt的蛋白水平呈顯著上升趨勢，而磷酸化Akt的蛋白水平呈上升趨勢，但沒有顯著性差異，磷酸化Akt與Akt的比值呈上升趨勢，加入Se-Met對Akt的活性有提升作用。以此可知，在NSCs中加入Se-Met后，PI3K-Akt信號通路被激活，促進了NSCs的增殖過程。

具體地，所述藥物/保健品用于降低轉基因小鼠腦內GSK3β的活性，促進Wnt通路的激活。具體表現在，在加入Se-Met后，小鼠的海馬中Akt下游的GSK3β的蛋白表達水平沒有顯著性變化，而磷酸化的GSK3β(ser9)的蛋白水平呈顯著上升趨勢，磷酸化GSK3β與總GSK3β的比值呈顯著上升趨勢，這表明加入Se-Met之后GSK3β的活性被顯著抑制。同時在Wnt通路中起重要作用的β-Catenin和Cyclin-D在加入Se-Met之后活性都得到提升，其中總β-catenin的蛋白水平在加入Se-Met之后沒有顯著性變化，而磷酸化的β-catenin的蛋白水平顯著性下降，磷酸化β-catenin與β-catenin的比值顯著性下降；加入Se-Met之后Cyclin-D的蛋白水平顯著升高。這些均表明在加入了Se-Met之后GSK3β的抑制作用被降低，Wnt通路進一步被激活，從而促進了海馬體內NSCs的增殖。

以下結合具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明，以下實施例中所用的藥物名稱及實驗材料如下：

硒代蛋氨酸(Seleno-DL-methionine)購買自sigma，單一化合物，純度≥99％，白色粉末狀，-18℃保存。細胞來源：從新生轉基因小鼠的腦海馬區分離原代神經細胞培養之后，通過流式細胞儀分選獲取。

實施例中所用的主要試劑及廠家如表1所示，主要儀器如表2所示。

表1

表2

實施例1

將硒代蛋氨酸(Se-Met)以10μM的濃度加入到神經干細胞(neural stem cell，NSCs)的細胞培養基中以觀察其對神經干細胞的增殖作用。采用CCK-8法檢測不同濃度Se-Met對神經干細胞活力的影響；神經干細胞經Se-Met預處理后，通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和DAPI免疫熒光檢測神經干細胞的增殖；通過形態學觀察分析檢測神經干細胞聚集成神經球的速率來判定Se-Met對神經干細胞增殖的影響；通過免疫印跡法(Westen Blot)檢測與神經干細胞增殖相關的蛋白變化，來驗證Se-Met對神經干細胞的增殖作用。

(1)CCK-8檢測神經干細胞的活力，結果為：參見圖1，硒代蛋氨酸對神經干細胞的活力影響存在與時間相關的劑量效應，作用12h時，隨著硒代蛋氨酸濃度升高，細胞活力逐漸增強，但總體作用效果不明顯；當作用時間達到24h時，10μM的Se-Met對于NSCs的增殖具有非常好的促進效果，而高濃度(50μM以上)的Se-Met導致細胞活力明顯下降(p<0.05)，說明高濃度的Se-Met對NSCs增殖具有顯著的抑制作用；當Se-Met作用時間達到48h之后我們可以看出，1μM，5μM，10μM的Se-Met都能夠顯著提高細胞的活力(p<0.05)，對NSCs的增殖具有顯著的促進作用，其中10μM組表現出促增殖作用最強，而高濃度的Se-Met則導致NSCs的細胞活力明顯下降。這些結果表明，Se-Met在低濃度(大于等于1μM、低于50μM)的情況下能夠促進神經干細胞的增殖，而高濃度(50μM以上)的Se-Met則具有一定的細胞毒性。所以，Se-Met對神經干細胞增殖的作用濃度為1～45μM，其中最佳作用濃度為10μM，作用時間為48h。

(2)免疫熒光檢測神經干細胞的增殖，結果為：參見圖2，采用BrdU特異性標記新生神經干細胞和DAPI來特異性標記細胞，經過免疫熒光檢測分析之后發現，使用10μM的Se-Met處理48h后新生神經干細胞的數量相對增加。

(3)使用形態學觀測檢測神經干細胞增殖的速率，結果為：參見圖3，使用10μM的Se-Met處理神經干細胞48小時，NSCs增殖的快慢決定了神經球的大小，使用顯微鏡觀察分析，通過Image J軟件分析測定，結果顯示加入Se-Met之后NSCs成球的大小以及數量都顯著增加(圖3b，p<0.001，n＝3)。

(4)Wnt通路在神經再生的過程中發揮非常重要的作用，因此首先通過Western Blot檢測了Wnt通路中的中心蛋白——β連環蛋白(β-catenin)以及其磷酸化水平，結果如圖4a所示，在NSCs增殖的過程中加入Se-Met組中的NSCs的β-catenin的含量有上升，但是沒有顯著性差異，而抑制其活性的磷酸化β-catenin水平顯著下降(p<0.05)，磷酸化β-catenin比β-catenin的水平顯著下降(圖4b)。結果表明：在NSCs中加入Se-Met之后，對β-catenin活性的抑制作用被緩解。

β-catenin下游的細胞周期蛋白D(Cyclin-D)能夠促進細胞的有絲分裂，在細胞增殖的過程中起到重要作用。我們檢測了Cyclin-D的蛋白水平(圖4a)，結果表明：NSCs中加入Se-Met之后，Cyclin-D的表達量顯著上升(圖4b)，從而加快NSCs的有絲分裂過程，促進其快速增殖。

以上結果表明：在轉基因模型的NSCs中，Se-Met能夠通過激活β-Catenin的活性繼而促進Wnt通路的激活，促進NSCs的增殖過程。

糖原合成激酶3β(GSK3β)在調節細胞的增殖、分化、存活以及凋亡的過程中均起到一定的作用，我們研究其在NSCs增殖的過程中的作用，結果顯示：參見圖5a，加入Se-Met以后，GSK3β的蛋白水平相對于對照組(未添加Se-Met組)顯著下降，磷酸化的GSK3β(p-GSK3β)能夠抑制GSK3β的活性，因此我們同時檢測了p-GSK3β的水平。結果顯示：p-GSK3β的水平顯著升高，磷酸化GSK3β比GSK3β的比值顯著上升(圖5b)，說明在NSCs中加入Se-Met能夠顯著抑制GSK3β的活性。

PI3K-Akt信號通路在細胞的增殖、抑制細胞凋亡、維持干細胞多能性等方面具有重要作用，同時也能夠調控海馬齒狀回顆粒下層區以及其他腦區的神經再生的發生過程。Akt即蛋白激酶B，參與調控很多生物反應過程，包括神經再生，細胞的增殖，生長，凋亡，同時Akt具有激活蛋白的磷酸化的功能，Akt可以促進GSK3β的磷酸化，從而降低GSK3β的活性。檢測NSCs中Akt的蛋白變化水平(圖6a)，結果顯示：總Akt的蛋白水平沒有發生顯著性變化，而磷酸化Akt(Thr-308)的活性顯著上升，磷酸化Akt比總Akt的比值顯著上升(圖6b)，表明在NSCs中加入Se-Met能夠顯著激活Akt的活性。PI3K即磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，主要起激活Akt的作用。在NSCs中我們發現磷酸化PI3K的蛋白水平顯著升高，而總PI3K的蛋白含量沒有顯著變化，磷酸化PI3K(Tyr-458)與總PI3K的比值呈顯著上升趨勢(圖6b)。這表明加入Se-Met之后PI3K的活性顯著上升，繼而促進Akt的表達。以上結果表明：Se-Met能夠激活PI3K/Akt/Wnt通路的相關蛋白，繼而促進NSCs的增殖。

實施例2

在一些神經退行性疾病發病過程中神經元的缺失與凋亡是影響認知的重要原因，而且海馬體齒狀回顆粒下層的神經再生被抑制，繼而導致新生的神經干細胞向神經元分化出現障礙，也被認為是造成認知損傷的主要原因，因此本實施例探究Se-Met能否促進NSCs向神經元分化，進而修復受損的神經系統。

在更換神經干細胞的培養基之后，持續加入Se-Met作用14天，貼壁的神經球開始向四周生長出神經纖維絲，其中Se-Met組神經球周圍生長出神經纖維絲的數量明顯多于對照組，通過免疫熒光染色發現在神經球周圍出現微管相關蛋白(MAP2)標記的神經元，并且Se-Met組分化得到的神經元的數量較對照組(未加入Se-Met)多。繼續培養到21天，通過免疫熒光檢測發現，Se-Met組中的MAP2標記的神經元數量較對照組多，并且密度也相對更加密集；我們從單個神經元的形態比較可以發現，加入Se-Met之后，神經元的樹突數量明顯增加，并且軸突的長度和寬度都顯著增加(圖8)。同時通過蛋白定量檢測神經元(NeuN)和星形膠質細胞(GFAP)發現(圖7a)，加入Se-Met組中的NeuN蛋白水平相對對照組呈顯著上升的趨勢，而GFAP的蛋白水平相對對照組呈顯著下降的趨勢(圖7b)。這些結果表明：Se-Met能夠促進體外神經干細胞向神經元分化(圖8)。

實施例3

本實施例通過在動物水平上研究Se-Met對神經干細胞及神經干細胞向神經元分化的影響。

實驗轉基因小鼠購置于購自于美國Jax實驗室，置于SPF級動物飼養中心，光照和黑暗各12小時循環往復，水和食物充足。取24只四月齡小鼠分為2組，每組雌雄各6只。硒代蛋氨酸通過溶解于水的方式，以6ug/mL的濃度持續給藥90天。通過免疫熒光檢測腦切片的Nestin和NeuN水平，通過Westenblot檢測腦組織中相關蛋白激酶的變化水平，進一步探究Se-Met在動物體內對神經干細胞的影響。

(1)腦內神經干細胞數量檢測

我們在體外實驗證實了Se-Met能夠促進神經干細胞的增殖，那么在小鼠中是否有促進海馬體內神經干細胞的增殖作用就成了我們的研究重點。巢蛋白(Nestin)能夠特異性識別神經干細胞，首先通過免疫熒光實驗，發現在小鼠在經過Se-Met治療之后，在小鼠腦內海馬體齒狀回區域出現Nestin標記的神經干細胞的數量顯著多于對照組(圖9)，同時使用神經核蛋白(NeuN)特異性標記神經元和BrdU特異標記新生細胞，結果顯示加入Se-Met治療之后，新生的神經元數量相對對照組增加(圖10)。

此外，在Se-Met治療之后小鼠的海馬體中，PI3K的總蛋白含量有上升趨勢，但沒有顯著性差異，磷酸化PI3K的蛋白水平較對照組呈顯著上升趨勢，磷酸化PI3K與PI3K的比值呈顯著上升趨勢。這說明加入Se-Met之后，PI3K的活性被顯著提升；通過檢測PI3K下游Akt蛋白表達水平，結果如圖13a所示，加入Se-Met之后Akt的蛋白水平較對照組呈顯著上升趨勢，而磷酸化Akt的蛋白水平呈上升趨勢，但沒有顯著性差異，磷酸化Akt與Akt的比值呈上升趨勢(圖13b)，加入Se-Met對Akt的活性有提升作用。以上結果表明，在轉基因模型小鼠中加入Se-Met治療之后，PI3K-Akt信號通路被激活，促進了NSCs的增殖過程。

檢測Akt下游的GSK3β的蛋白表達水平(圖12a)，結果顯示：加入Se-Met組和對照組(未加入Se-Met)中GSK3β的總蛋白水平沒有顯著性變化，而磷酸化的GSK3β(ser9)的蛋白水平呈顯著上升趨勢，磷酸化GSK3β與總GSK3β的比值呈顯著上升趨勢(圖12b)，這表明加入Se-Met之后GSK3β的活性被顯著抑制。同時在Wnt通路中起重要作用的β-Catenin和Cyclin-D在加入Se-Met之后活性都得到提升，其中總β-catenin的蛋白水平在加藥組和對照組中沒有顯著性變化，而磷酸化的β-catenin的蛋白水平較對照組顯著性下降，加藥組磷酸化β-catenin與β-catenin的比值顯著性下降(圖11b)；加入Se-Met之后Cyclin-D的蛋白水平顯著升高(圖11b)，這些數據表明在加入了Se-Met之后GSK3β的抑制作用被降低，Wnt通路進一步被激活，從而促進了海馬體內NSCs的增殖。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。