專利名稱：農桿菌介導的棉花轉化的改進方法
技術領域：
本發明涉及植物轉化領域，具體地說涉及一種農桿菌(Agrobacterium)介導的棉花轉化的改進方法。
棉花是一種重要的農作物，種植棉花主要為了獲得棉絨，這為紡織工業提供許多高質量的纖維。棉籽也是一件有價值的商品，因為它提供了油，粗粉和種子外殼的來源。
世界范圍種植的棉花的大約90％是陸地棉(Gossypium hirsutumL.)，而海島棉(Gossypium barbadense)占大約8％。
通過常規育種技術獲得了各種品質特性的改進，如對蟲害，逆境或者病害的抗性，纖維質量，降低的棉子酚含量，利用分子和遺傳技術可以進一步改進這些和其它品質。
有可用于棉花轉化的幾種方法，包括棉花外植體，如離體的子葉、離體的下胚軸和離體的下胚軸過渡區的農桿菌介導的轉化，以及通過對棉花分生組織的微粒轟擊的直接基因轉化。
Firoozabady等(1987，第10期，植物分子生物學(Plant MolecularBiology)105-116)描述了通過根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和轉基因植物的再生轉化棉花子葉組織的方法。
Umbeck等(1987，第5期，生物/技術(Bio/Technology)263-266)報告了利用下胚軸作為外植體經由農桿菌在棉花轉化上的結果。
PCT出版物(“WO”)89/05344，美國專利(“US”)5,244,802和US 5,583,036提供了通過組織和懸浮培養，用為下胚軸，子葉和不成熟胚的外植體開始再生棉花的方法。也教導了通過選擇性生長轉化棉花和改良棉花的方法。
WO 89/12102和US 5,164,310涉及一種用于轉化和迅速再生植物組織的新方法。該方法使用莖頂端作為目標組織，進而擴大了轉化的種的范圍和減少體細胞克隆變異的風險。
WO 98/15622提供了用于可育的棉花(Gossypium)植物的體外再生的方法，其中去除和培養來自小苗的過渡區組織的細胞。也描述了用于產生能夠向后裔傳輸外源基因的轉基因棉花植物的方法，其中源于小苗的過渡區組織的細胞是轉化的目標。
WO 97/12512提供了一種從外植體組織再生棉花植物的方法，它能從不在含外源植物激素的愈傷組織誘導起始培養基上培養的棉花組織外植體，如下胚軸產生胚胎發生愈傷組織。該方法可用于農桿菌介導的棉花植物的轉化。
US 5,004,863和US 5,159,135以及歐洲專利出版物“EP”0 270 355都公開了通過把未成熟的棉花組織如下胚軸片段在體外經農桿菌介導的遺傳轉化，完成棉花植物和品系的遺傳轉化的方法。
WO 97/43430涉及多用途的從頂端和/或節間分生組織的外植體迅速再生棉花植物的方法，它可與已熟知的轉化方法如農桿菌介導的轉化結合在一起，快速產生具有農藝重要性的遺傳工程棉花品種。
WO 92/15675和EP 0 531 506描述了用于粒子介導的棉花轉化的方法，無需組織培養或愈傷組織增殖，包括從發芽種子切去胚軸和用攜帶外源基因的顆粒轟入胚軸中即可直接對優良棉花品系進行遺傳工程改良。
Finer和Mc Mullen(1990，植物細胞報告(Plant Cell Reports)，8586-589)描述了經由胚胎發生懸浮培養物的粒子轟擊轉化棉花的方法。
McCabe和Martinell(1993，生物/技術11596-598)描述了通過從切除的胚軸的棉花分生組織的粒子轟擊對優良棉花品種的轉化方法。
Hansen等(1994，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91.7603-7607)曾描述了一種農桿菌菌株，它包含一個組成型的virG突變體(virGN54D)，導致分離的棉花子葉轉化效率的提高。
Veluthambi等(1989，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)，第171期3696-3703)描述了在侵染時同時添加乙酰丁香酮和胭脂氨酸顯著地增加棉花莖尖轉化的方法。
正如Murray等所指出的(1993，轉基因植物，第2卷，Academic出版公司p153-168)，現有技術的棉花的農桿菌介導的轉化方法有很大的缺點，即從與農桿菌細胞共培養的外植體再生轉基因植物需要的時間太長。
而且，另一個問題起因于這一事實所有描述的農桿菌介導的棉花轉化的方法需要從含轉化細胞的外植體產生胚胎發生愈傷組織，作為轉基因棉花植物再生的中間步驟。因為外植體的所有轉化細胞不一定能誘導胚胎發生愈傷組織的起始，用這些方法使得許多有潛力的轉基因細胞發生再生損失，結果導致低的轉化效率。可能轉化的棉花外植體的起始數量的增加以彌補這一損失，在獲得再生的轉基因棉花植物過程中導致要投入的勞動量的巨大增加。
WO 89/05344曾一般性地建議胚胎發生愈傷組織可用作農桿菌介導的棉花愈傷組織轉化的適當的起始材料。然而，在過去十年期間，尚沒有報導用胚胎發生愈傷組織與農桿菌共培養成功地生產轉基因棉花植物。
在某種程度上，該問題被分生組織的微粒轟擊技術所緩和，這種微粒轟擊技術導致更大量的轉基因棉花品系。然而，產生種系轉化的能夠把轉基因傳遞給它們后代的棉花植物的頻率太低。
因此，就所要求的時間和轉化效率兩方面而言，本領域在提供用于獲得能夠把外源摻入的DNA轉移到其后代植物的轉基因棉花植物的有效方法上尚有缺陷。
本發明的另一個目的是提供用于產生轉基因棉花植物的方法，其不需要由包含所轉化的細胞的棉花外植體產生胚胎發生愈傷組織的步驟，進而減少源于所轉化的植物細胞的轉化的棉花品系的潛在損失，該轉化的植物細胞不能夠產生胚胎發生愈傷組織，并且以這種方式提高轉化頻率。
在第一個方面，本發明涉及一種用于產生轉基因棉花植物的方法，該方法包括在棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞共培養之前或共培養期間，在植物酚類化合物存在下培養該農桿菌細胞，所說的農桿菌細胞含有可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段。
在另一方面，本發明涉及用于產生轉基因棉花植物的方法，該方法包括i)在植物酚類化合物的存在下，共培養農桿菌細胞和棉花胚胎發生愈傷組織，優選地是來源于棉花籽苗的下胚軸，該農桿菌細胞含有可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段，所說的植物酚類化合物選自下組物質乙酰丁香酮，α-羥基乙酰丁香酮，芥子酸，丁香酸，阿魏酸，鄰苯二酚，對-羥基苯甲酸，β-二羥基苯甲酸，3，4-二羥苯甲酸，鄰苯三酚，沒食子酸和香草醛，濃度范圍優選地從大約50μM到大約400μM，共培養的時間是足以產生包含一種轉化的棉花細胞的胚胎發生愈傷組織的一段時間，優選地是大約3至4天；ii)從所說的轉化細胞再生出轉基因棉花植物；以及任選地iii)使所說的轉基因棉花植物與另一種棉花植物雜交。
在另一方面，本發明涉及植物酚類化合物，優選乙酰丁香酮，在農桿菌介導的棉花胚胎發生愈傷組織轉化上的用途。發明詳述發明人已開發了一種改進和加速的產生轉基因棉花植物的農桿菌介導的轉化方法，包括在農桿菌介導的棉花胚胎發生愈傷組織的轉化期間，優選地在棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞的共培養階段，利用植物酚類化合物，如乙酰丁香酮。該方法從共培養到轉基因棉花植物發育充分移栽至土壤，優選地在溫室條件下，平均減少至少大約2-3個月的時間。
由于本發明的改進方法包括利用胚胎發生愈傷組織作為進行轉化的起始組織，由包括所轉化細胞的棉花外植體產生胚胎發生愈傷組織的步驟被去掉。因而，可以減少來自不能產生胚胎發生愈傷組織的轉化植物細胞的轉化棉花品系的潛在損失，同時轉化頻率得到提高。
此外，胚胎發生愈傷組織一旦被誘導起始，就可以直接被保存(只要體細胞克隆變異不干擾再生植物的表型)，這樣有利于管理用于轉化實驗的起始材料的供給。
確實，發明人驚奇地發現農桿菌介導的棉花胚胎發生愈傷組織的轉化，使植物酚類化合物，例如但不限于乙酰丁香酮的添加成為必要，優選地在共培養階段添加。在現有技術中在任何地方都沒有建議在所有可能的變量中，包含這種植物酚類化合物將導致成功的農桿菌介導的棉花胚胎發生愈傷組織的轉化。
在一實施方案中，本發明涉及在棉花胚胎發生愈傷組織的農桿菌介導的轉化期間使用植物酚類化合物。
適合于本發明的“植物酚類化合物”或者“植物酚類”是那些取代的酚類分子，它們能夠誘導一種積極的趨化反應，特別是那些能夠在包含農桿菌種的Ti-質粒中誘導增加的vir基因表達的酚類物質，特別是包含根癌農桿菌的Ti-質粒。Ashby等描述過用于測量對植物酚類化合物趨化反應的方法(1988，細菌學雜志，1704181-4187)，同時測量誘導vir基因表達的方法也是熟知的(Stachel等，1985年第318期，自然624-629；Bolton等，1986年第232期，科學983-985)。
優選的植物酚類化合物是在植物細胞的創傷滲出物中所發現的那些。最有名的已知植物酚類化合物之一是乙酰丁香酮，它在各種植物的一些受傷和完整的細胞中存在，盡管它有不同的濃度。然而，乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙酮)不是唯一的能誘導vir基因表達的植物酚類。其它的例子是α-羥基乙酰丁香酮，芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)，丁香酸(4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲酸)，阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)，鄰苯二酚(1，2-二羥基苯)，對-羥基苯甲酸(4-羥基-苯甲酸)，β-二羥基苯甲酸(2，4-二羥基-苯甲酸)，3，4-二羥苯甲酸(3，4-二羥基-苯甲酸)，鄰苯三酚(2，3，4-三羥基-苯甲酸)，沒食子酸(3，4，5-三羥基-苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羥基-苯甲醛)，并且這些酚類化合物是已知的或者預期能夠代替具有類似結果的乙酰丁香酮。如本文所使用的，所論及的分子也被稱作植物酚類化合物。
植物酚類化合物可以單獨使用，或與其它植物酚類結合起來使用。某些化合物，如滲透保護劑(如L-脯氨酸或甜菜堿)，植物激素(特別是NAA)，冠癭堿，或糖類，當與植物酚類化合物一起添加時預期會協同起作用。
在一優選的實施方案中，本發明涉及一種用于轉化棉花植物，即通過導入目標DNA片段到棉花植物細胞的基因組中產生轉基因棉花植物的方法，該方法包括a)在植物酚類化合物存在下共培養棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞，共培養時間是足以產生包含一種轉化的棉花細胞的胚胎發生愈傷組織的一段時間，所說的農桿菌細胞包含可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段，和b)從所說的轉化細胞再生轉基因棉花植物。
本發明所提供的方法使用棉花胚胎發生愈傷組織作為與農桿菌細胞共培養的起始材料。如本文所使用的“棉花胚胎發生愈傷組織”或“源于棉花外植體的胚胎發生愈傷組織”指致密的或實心的愈傷組織，源于棉花外植體、在固體培養基上培養，該愈傷組織通過體細胞胚胎發生可再生出一個完整的棉花植株。胚胎發生棉花愈傷組織的這一定義不包括液體培養基中培養的胚胎發生懸浮細胞。
從棉花外植體誘導胚胎發生愈傷組織的方法在本領域中已被公開，例如，在專利WO 97/12512中。
對技術人員來說清楚的是，得到胚胎發生愈傷組織的棉花外植體的來源對于本發明的方法僅僅具有有限的重要性。胚胎發生愈傷組織可以從任何合適的棉花外植體，如但不限于下胚軸，子葉，未成熟或者成熟胚等等獲得。
優選地，本文所描述的轉化方法中所使用的棉花胚胎發生愈傷組織可通過在不含激素的愈傷組織誘導培養基上培養棉花下胚軸外植體獲得，正如WO97/12512所描述的那樣。
本文所使用的“共培養”是指在添加抑菌或者殺菌化合物抑制或者除去農桿菌之前，在胚胎發生棉花愈傷組織和農桿菌細胞之間接觸的過程。因此，農桿菌介導的轉化方法的“共培養階段”指農桿菌與植物組織最初接觸直到抑菌或者殺菌化合物添加到培養基中以便去除或抑制包含目標DNA片段的農桿菌菌株的時間點之間的時間段。
本文所使用的“目標DNA片段”用來描述任何想導入到棉花植物細胞的基因組中的DNA片段，不管它是否編碼一種蛋白質或多肽，是否為RNA。確實，一種DNA片段可以主要地為標記而被導入。對目標DNA片段的唯一的先決條件是它應該是“可操作地與至少一個T-DNA邊界連接”。
如本文所使用的，“T-DNA邊界”包括含有大約25個核苷酸長的序列的DNA片段，它能夠被農桿菌菌株的毒性基因產品所識別，優選根癌農桿菌(A.tumefaciens)或者發根農桿菌(A.rhizogenes)菌株，并且足夠把可操作地連接的DNA轉移到真核細胞，優選植物細胞，特別是足夠把可操作地連接的DNA轉移并整合到真核細胞的基因組中，優選植物細胞中。很明顯，這一定義包括源于野生型質粒的所有天然存在的T-DNA邊界，以及任何其功能衍生物，包括化學合成的T-DNA邊界。
優選地，目標DNA位于兩條T-DNA邊界之間，優選位于在T-DNA載體和輔助Ti-質粒之間通過DNA同源片段的單交換能夠形成雜種Ti-質粒的T-DNA上。
根據本發明，利用植物酚類化合物增加棉花胚胎發生愈傷組織的農桿菌介導的DNA轉化的轉化效率，同時可以預期這一影響不依賴于農桿菌寄主的染色體背景，Ti-質粒的類型，輔助-質粒或者使用的T-DNA載體。
特別優選的細菌染色體背景由根癌農桿菌C58C1(Van Larebeke等，1974年第252期，自然169-170)，A136(Watson等，1975年第123期，細菌學雜志255-264)或者LBA4011提供(Klapwijk等，1980年第141期，細菌學雜志128-136)。
在一優選的實施方案中，用來轉化與植物酚類化合物預培養的植物組織的農桿菌菌株包含LL-succinamopine類型的Ti-質粒，優選地是去臂的，如pEHA101。
本發明的方法也可以與特殊的農桿菌菌株結合起來使用，進一步增加轉化效率，如其中vir基因表達和/或其誘導由于突變體或嵌合的virA或virG基因的存在而改變的農桿菌菌株(例如Hansen等，1994，supra；Chen和Winans，1991，細菌學雜志，1731139-1144；Scheeren-Groot等，1994，細菌學雜志，1766418-6246)。
在另一個實施方案中，包括一個額外的virG基因拷貝的農桿菌菌株，特別是所謂的來源于pTiBo542的超級virG基因，優選地與多拷貝質粒連接，可以用來進一步增加轉化效率。
植物酚類化合物在共培養培養基中的濃度也被認為對轉化效率有影響。然而，在一定的濃度范圍之內，影響限度是最小的。植物酚類化合物在共培養培養基中的最佳濃度范圍可以變化，取決于棉花胚胎發生愈傷組織所來源的種或者品種，但是可以預期大約100μM對許多目的是一種合適的濃度。最理想的濃度也可以取決于所利用的特定的植物酚類化合物的性質，特別取決于它的細胞分裂促進強度。
例如，發現乙酰丁香酮最理想的濃度是大約100μM，但是低至大約25μM的濃度可以用來對轉化效率獲得一種好的效果。同樣地，可以預期至多大約400μM的更高濃度將產生類似的效果。
類似的濃度適用于其它植物酚類化合物，同時依據本發明最理想的濃度通過實驗可以很容易地建立。
產生包括轉化細胞的棉花胚胎發生愈傷組織的典型共培養時間是大約3天至大約4天，但是可以預期一天的共培養時間可以足以產生至少某些被轉化的細胞。此外，可以預期共培養時間不應該超過大約7天。
技術人員清楚的是，除在棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞的共培養期間包含植物酚類化合物之外，通過與植物酚類化合物一起培養足以誘導農桿菌細胞的毒性基因的一段時間也可以預誘導所使用的農桿菌細胞。
此外，可以預期農桿菌細胞與植物酚類化合物預誘導足以誘導農桿菌細胞的毒性基因的一段時間可以不需要在共培養階段加入植物酚類化合物。
因此，在另一個優選的實施方案中，本發明涉及用于轉化棉花植物的方法，即通過把目標DNA片段導入棉花植物細胞的基因組產生轉基因棉花植物，其中該方法包括a)用植物酚類化合物培養包含可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段的農桿菌細胞培養物一段足以誘導所說的農桿菌細胞的毒性基因的時間；b)共培養棉花外植體來源的胚胎發生愈傷組織和經上述植物酚類化合物培養的所說農桿菌細胞，以產生包含轉化的棉花細胞的胚胎發生愈傷組織；和c)從所說的轉化的細胞再生轉基因棉花植物。
與植物酚類化合物培養預誘導農桿菌細胞的毒性基因的方法，以及測定農桿菌菌株的毒性基因是否被誘導的方法，在本領域中也是現成的，例如，如同被Stachel等，1985或者Bolton等，1986所描述的。
優化的用植物酚類化合物，特別是乙酰丁香酮誘導農桿菌的方法，例如，已由Vernade等描述(1988年第170期，細菌學雜志，5822-5829)，該文獻并入本文供參考。
在共培養之前，農桿菌細胞與植物酚類化合物一起培養足以誘導毒性基因的時間范圍從幾小時到大約2天，但是，典型地在共培養之前大約1天的培養即足夠。同樣地，植物酚類化合物的濃度范圍從大約50μM到大約400μM，但是，典型地大約100μM對植物酚類化合物是一種優選的濃度。
在共培養之后，優選將棉花胚胎發生愈傷組織進行選擇以從未轉化的細胞中分開轉化的細胞，或至少富積所轉化的細胞。
為了這一目的，在本發明的方法中所使用的外源DNA也優選地包含標記基因，其表達允許從非轉化的細胞中分開所轉化的細胞。這樣一種標記基因一般編碼一種蛋白質，它從表型上把未轉化的細胞與轉化的細胞區分開。在一個可選擇的標記基因的情況下，通過那個標記基因的表達，一般地提供給細胞對抗生素或對細胞通常有毒的其他化合物的抗性。在植物中，可選擇的標記基因這樣也編碼種蛋白質，賦予對除草劑的抗性，如包含谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如phosphinothricin)作為活性成分的除草劑。這樣的基因的例子是編碼phosphinothricin乙酰轉移酶的基因，如sfr或者sfrv基因(EP 0 242 236；EP 0 242 246；DeBlock等，1987，EMBO雜志，62513-2518)。然而，也有可能的是，不能選擇可區別的表現型，如同通常稱為可篩選的標記基因的標記基因的情況一樣，包括但是不限于，本領域熟知的綠色熒光蛋白(GFP)或者β-葡糖醛酸酶(GUS)或者是β-內酰胺酶。
此外，利用如基于PCR的DNA擴增方法的方法，任何DNA序列，包含目標DNA的序列的一部分，可以用作為標簽檢驗目標DNA片段的存在。
對所轉化的胚胎發生愈傷組織細胞的選擇優選地在固體培養基上完成，但是也可由在液體培養基中的選擇補充或者代替。
不言而喻在進行選擇期間，且如果需要的話，在再生階段，農桿菌的生長必須被抑制，優選地，農桿菌細胞不得不除去。正如在本領域中熟知的，這一點可以通過向培養基加入對農桿菌有毒的抗生素，例如但不限于頭孢噻肟達到。
轉化的胚胎發生愈傷組織再生為轉基因棉花植物品系可按本領域技術人員技能之內的方法，例如但不限于WO 98/15622中描述的再生方法進行。
在一優選的實施方案中，在再生階段，小的胚被選擇進行發芽和發育為成熟植物，優選地把胚胎發生愈傷組織種植在旋轉搖床的液體培養基上，和抑制可通過一個篩子，如茶-篩的胚胎發生愈傷組織或體細胞胚的那部分液體懸浮液的萌芽。
如本文所使用的轉基因“棉花植物品系”是由一組轉基因棉花植物組成的，源于一種在再生過程期間獲得的轉化的胚胎發生愈傷組織塊。一般來說，一種植物品系中的植物是遺傳上同一的，并且起源于一個轉化事件，這樣包括整合在相同的基因組位置的相同轉基因。然而，當利用農桿菌介導的DNA轉化時，一種植物品系的單個植物可以起源于獨立的轉化事件，因此可以是互相不同的。當轉化頻率由植物品系的數量/100個初始的胚胎發生愈傷組織塊來表示時，可能是實際轉化頻率(轉化事件/100個初始的愈傷組織塊)甚至更高。
本發明的方法特別適宜于所有棉花植物的轉化，胚胎發生愈傷組織來源于這些棉花植物(陸地棉和海島棉)，特別是Coker 312，Coker310，Coker 5Acala SJ-5，GSC25110，FiberMax 819，Siokra 1-3，T25，GSA75，Acala SJ2，Acala SJ4，Acala SJ5，Acala SJ-C1，Acala B1644，AcalaB1654-26，Acala B1654-43，Acala B3991。Acala GC356，Acala GC510，Acala GAM1，Acala C1，Acala Royale，Acala Maxxa，Acala Prema，Acala B638，Acala B1810，Acala B2724，Acala B4894，Acala B5002，non Acala“picker”，Siokra，“stripper”品種FC2017，Coker 315，STONEVILLE 506，STONEVILLE 825，DP50，DP61，DP90，DP77，DES119，McN235，HBX87，HBX191，HBX107，FC 3027，CHEMBREDA1，CHEMBRED A2，CHEMBRED A3，CHEMBRED A4，CHEMBRED B1，CHEMBRED B2，CHEMBRED B3，CHEMBRED C1，CHEMBRED C2，CHEMBRED C3，CHEMBRED C4，PAYMASTER145，HS26，HS46，SICALA，PIMA S6和ORO BLANCO PIMA以及具有來源于其基因型的植物。
獲得的轉化棉花植物可以用于常規育種計劃以產生更多具有相同特征的轉化的棉花植物，或者把目標DNA片段引入到其它相同的或者相關的棉花品種中，同時，還包括這樣的育種活動的方法也包括在本發明的范圍之內。
下列實施例詳盡地描述本發明的方法。除非在實施例中以其它方式說明，所有重組的DNA技術根據標準的操作程序實行，如Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA LaboratoryMannul)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約，和在美國Ausubel等(1994)分子生物學的當前操作程序，當前的操作程序(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA)的第一和二卷中所描述的。用于植物分子工作的標準材料和方法在植物分子生物學Labfax(Plant Molecular Biology Labfax)(1993)中被R.D.DCroy描述，由BIOS Scientific Publications Ltd.(英國)和英國BlackwellScientific Publications聯合出版。
如果合適，1升AB培養基含50毫升AB緩沖液，50毫升AB鹽，5克/升葡萄糖和12克/升瓊脂。培養基100Murashige & Skoog鹽+30克/升葡萄糖10毫克/升硫胺素100毫克/升肌醇1毫克/升煙酸1毫克/升吡哆醇0.5克/升MES緩沖液pH＝5.8當需要固體培養基100時，加1.6克/升gelrite和0.75克/升MgCl2.6H2O。培養基104Murashige & Skoog鹽+30克/升葡萄糖10毫克/升硫胺素100毫克/升肌醇1毫克/升煙酸1毫克/升吡哆醇1克/升硝酸鉀0.5克/升MES緩沖液pH＝5.8當需要固體培養基104時，加2.0克/升gelrite和0.94克/升MgCl2.6H2O。培養基700Stewards Macro元素KNO30.506克/升NH4NO30.240克/升
MgSO4.7H2O0.493克/升KH2PO40.027克/升CaCl2.2H2O0.176克/升Stewards Micro元素KI 0.25毫克/升MnSO4.H2O 3.84毫克/升H3BO31.85毫克/升ZnSO4.7H2O2.59毫克/升Na2MoO4.2H2O 0.22毫克/升CuSO4.5H2O0.0075毫克/升CoCl2.6H2O0.0071毫克/升FeEDTA 0.7毫升/升原液，在100毫升水中含有0.54克FeCl3.6H2O和0.74克Na2EDTA維生素 硫胺素 1.5毫克/升吡哆醇 1.0毫克/升煙酸 0.5毫克/升蔗糖 20克/升pH＝6.8用1克/升的gelrite加0.47克/升的MgCl2.6H2O和2.25克/升的瓊脂凝固培養基。培養基701與培養基700的組成相同，但是用30克/升葡萄糖用20克/升瓊脂凝固培養基培養基702與培養基700的組成相同，但是用5克/升蔗糖用1.5克/升gelrite 0.71克/升MgCl2.6H2O和5克/升瓊脂凝固培養基。1.2質粒和細菌菌株根癌農桿菌菌株A3311
A3311是根癌農桿菌菌株C58C1RifR，包含輔助Ti-質粒pEHA101(Hood等1986，細菌學雜志，1681291-1301)和T-DNA載體pTHW136。質粒pTHW 136在WO 98/31822中描述。根癌農桿菌菌株A3784A3784是根癌農桿菌菌株C58C1RifR，包含輔助Ti-質粒pEHA101(Hood等，1986)和T-DNA載體pTCO192。pTCO192類似于pGSV71(WO 98/37212)，并且與后者的不同僅僅在于存在與位于T-DNA邊界外部的pEHA101的nptl基因同源的區域。根癌農桿菌菌株A3724A3724為根癌農桿菌菌株C58C1RifR，包含輔助Ti-質粒pEHA101(Hood等，1986)和T-DNA載體pTSVH9901。
T-DNA載體pTSVH9901來源于T-DNA克隆載體pGSV5(在WO98/31822中描述)，在它的邊界序列之間包含嵌合植物可表達bar基因，在CaMV35S啟動子的控制下，緊接著胭脂堿合成酶基因來的3′末端形成信號。在它的邊界序列之間，T-DNA載體pTSVH9901也包含嵌合植物可表達Cry9C基因，其中編碼可讀框的Cry9C插入在CaMV35S啟動子和3′末端區之間，其中cab22L引導區插入在不翻譯的mRNA編碼區域中。T-DNA載體還包含一個與pEHA101的nptl基因同源的區域，位于T-DNA邊界的外部。根癌農桿菌菌株A3727A3311為根癌農桿菌菌株C58C1RifR，包含輔助Ti-質粒pEHA101(Hood等，1986)和T-DNA載體pTSHV0203。
T-DNA載體pTSHV0203基于T-DNA克隆載體pGSVS (WO 98/31822)，在它的邊界序列之間包含嵌合植物可表達bar基因，在CaMV35S啟動子的控制下，緊接著胭脂堿合成酶基因來的3′末端形成信號。在它的邊界序列之間，T-DNA載體pTSHV0203也包含嵌合植物可表達Cry1Ab基因，其中編碼可讀框的CRY1Ab插入在CaMV35S啟動子和章魚堿合成酶基因的3’末端區之間。T-DNA還包含一個與pEHA101的nptl基因同源的區域，位于T-DNA邊界的外部。實施例2在共培養期間包含植物酚類化合物(如乙酰丁香酮)使得可以進行農桿菌介導的胚胎發生棉花愈傷組織的轉化。
以下列方法獲得胚胎發生棉花愈傷組織品種Coker 312的棉籽利用12％的次氯酸鈉溶液消毒，單獨地在含有2克/升水的gelrite和0.94克/升的MgCl2.6H2O溶液的試管中發芽。試管在27-28℃于暗處培養，10至14天之后，收集籽苗，籽苗的下胚軸被切割成大約1cm的節段，于培養基104(不含植物激素)上在28℃下經16小時的光照和8小時的黑暗處培養。每三周將節段轉移到新鮮培養基，直到形成胚胎發生愈傷組織(通常在大約9周之后)。從外植體上分離這一愈傷組織，進一步在培養基104上培養。
農桿菌菌株A 3311細胞在AB培養基或者在MAG培養基上生長，收集并再懸浮于pH為5.2的M104液體培養基中(加或不加100μM乙酰丁香酮(AS))，或MAG培養基中，密度為大約1×109CFU/毫升。收集小的胚胎發生棉花愈傷組織塊，在pH 5.2的液體培養基104中洗滌，并且浸沒在農桿菌懸浮液中大約20分鐘。感染的胚胎發生愈傷組織然后被轉移到pH 5.2的固體培養基104上，補充100μM乙酰丁香酮和0.5克/升的酪蛋白氨基酸或者根本不補充，在暗處大約24℃共培養4天。
在共培養階段之后，愈傷組織塊轉移到添加50毫克/升卡那霉素和500毫克/升Claforan的選擇性培養基104中。
在共培養之后的不同時間間隔，收集胚胎發生愈傷組織樣品和用Jefferson等(1987；植物分子生物學報告(Plant Mol.Biol.Rep.)5387-405)描述的生色底物進行β-葡糖醛酸酶測定。這些檢驗的結果總結于表1中，以愈傷組織表達GUS-陽性斑點的百分比表示。
作為對照，包括一些利用與A3311共培養的煙草葉盤，利用模擬接種的煙草葉盤或模擬接種的胚胎發生棉花愈傷組織的實驗。
從這些結果清楚地看出，對于瞬時表達和在轉化的愈傷組織的延長培養之后，在農桿菌介導的胚胎發生愈傷組織的轉化期間需要包含乙酰丁香酮。表1.不同參數對農桿菌介導的棉花胚胎發生愈傷組織(棉花EC)轉化的影響結果一覽表
實施例3利用胚胎發生愈傷組織的農桿菌介導的棉花轉化棉花胚胎發生愈傷組織(EC)的產生在實施例2中描述過。收集胚胎發生愈傷組織塊和在pH為5.2的液體培養基104中洗滌。
農桿菌菌株A3784，A3724和A3727在pH 7.0的AB培養基上生長3至4天，收集并以大約1至5×109個細胞/毫升的密度再懸浮于含有100μM乙酰丁香酮、pH為5.2的液體培養基104中。
胚胎發生愈傷組織塊浸沒在農桿菌懸浮液中最多大約20分鐘，轉移至pH 5.2、補充有100μM乙酰丁香酮的固體培養基104上，在暗處于24℃共培養4天。
在這一共培養之后，愈傷組織塊轉移到pH為5.8、沒有乙酰丁香酮或者植物激素的選擇性培養基104上，補充500毫克/升Claforan(抑制農桿菌細胞的發育)與5毫克/升的phosphinotricin(PPT)(特異性地選擇轉基因愈傷組織的生長)。
活躍地生長、看起來健康的胚胎發生愈傷組織塊，每3周轉移到新鮮選擇性培養基104上。
部分愈傷組織(大約200毫克)再懸浮于20毫升的液體培養基100中，補充5毫克/升的PPT，在一旋轉搖床上的100毫升燒瓶中震蕩(每分鐘100-120轉)培養。
在液體培養基中培養2周之后，把懸浮液通過一個茶篩，分離大的愈傷組織塊。胚胎發生懸浮液的通過部分沉降大約20分鐘，之后，去掉用過的培養基，用新鮮培養基100代替。取2毫升的含小胚的這種懸浮液涂布于補充5毫克/升的PPT的固體培養基104上，于28℃下培養。
在大約2周之后，把4至10毫米大的發育胚轉移至培養基701上，進一步在暗處于28℃培養，更小的胚轉移到其上覆蓋有滅菌濾紙(含有或沒有5mg毫克/升的PPT)的培養基104上以增加尺寸，大到足以轉移到培養基701上。
在大約2周之后，將胚轉移至培養基702上(加或者不加選擇性壓力)萌芽，在28℃，16小時光照/8小時黑暗下培養。
將發育好的小植株(可能需要在培養基702上轉移2至3次)轉移到包含M700的小容器中，當這些小植株發育兩至三片真葉時，將它們轉移到更大的盛有培養基700的容器中。
當植物在大約10厘米高度時，將它們轉移到溫室條件下的土壤中生長。
分子分析(如果合適的話，Phosphinotricin乙酰化檢驗，Southern雜交以及ELISA檢測cry基因表達)在愈傷組織水平上完成。
這些實驗的結果總結在表2中。
為了比較，根據在本領域中熟知的方法同步完成了農桿菌介導的棉花子葉的轉化實驗。表2.用棉花子葉或胚胎發生愈傷組織作為起始材料進行的農桿菌介導的轉化試驗的結果比較NA不合適；ND未測定*實驗開始與“植物狀態”測定之間的時間(以周表示)
權利要求
1.一種用于產生轉基因棉花植物的方法，該方法包括在棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞共培養之前或共培養期間，在植物酚類化合物存在下培養該農桿菌細胞的步驟，所說的農桿菌細胞含有可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段。
2.一種用于產生轉基因棉花植物的方法，所說的方法包括a)在植物酚類化合物存在下共培養棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞，共培養時間是足以產生包含一種轉化的棉花細胞的胚胎發生愈傷組織的一段時間，所說的農桿菌細胞包含可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段，和b)從所說的轉化細胞再生轉基因棉花植物。
3.權利要求書2的方法，其中所說的植物酚類化合物存在的濃度范圍從大約50μM到大約400μM。
4.權利要求書2的方法，其中所說的農桿菌細胞在所述酚類化合物存在下共培養大約3至4天。
5.權利要求書2的方法，其中所說的胚胎發生愈傷組織來源于棉花籽苗的下胚軸。
6.權利要求書2的方法，其中所說的植物酚類化合物選自下組物質乙酰丁香酮，α-羥基乙酰丁香酮，芥子酸，丁香酸，阿魏酸，鄰苯二酚，對-羥基苯甲酸，β-二羥基苯甲酸，3，4-二羥苯甲酸，鄰苯三酚，沒食子酸和香草醛。
7.權利要求書6的方法，其中所說的植物酚類化合物是乙酰丁香酮。
8.權利要求書2的方法，其中所說的農桿菌細胞是根癌農桿菌菌株C58C1(pEHA101)，其還包含目標DNA片段。
9.權利要求書2的方法，該方法還包括將所說的轉基因棉花植物與另一棉花植物雜交的步驟。
10.一種通過農桿菌介導的轉化產生轉基因棉花植物的方法，該方法包括共培養農桿菌細胞和棉花胚胎發生愈傷組織，該農桿菌細胞含有可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段，其特征在于所述共培養在植物酚類化合物的存在下進行。
11.植物酚類化合物在棉花胚胎發生愈傷組織的農桿菌介導的轉化上的用途。
12.根據權利要求10的用途，其中所說的植物酚類化合物是乙酰丁香酮。
13.一種通過農桿菌介導的轉化產生轉基因棉花植物的方法，其特征在于在植物酚類化合物存在下共培養農桿菌細胞與棉花胚胎發生愈傷組織，所說的農桿菌細胞含有可操作地連接到至少一個T-DNA邊界上的目標DNA片段。
全文摘要
本發明涉及生產轉基因棉花植物的改進方法,包括在植物酚類化合物存在下共培養棉花胚胎發生愈傷組織與農桿菌細胞,該農桿菌細胞含有可操作地連接到至少一個T－DNA邊界上的目標DNA片段。
文檔編號C12N15/82GK1351668SQ00807727
公開日2002年5月29日 申請日期2000年5月18日 優先權日1999年5月19日
發明者A·雷納爾特斯, A·德桑維勒 申請人:阿溫提斯作物科學公司