專利名稱：一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物in planta遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，更具體涉及一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物in planta遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因方法，適用于油菜、芝麻、大豆、擬南芥等大部分作物的轉(zhuǎn)基因。
背景技術(shù)：
隨著DNA重組和植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，分子育種已成為植物育種的一個(gè)重要 研究領(lǐng)域。植物分子育種即基因工程育種，經(jīng)過(guò)多年的科學(xué)實(shí)踐已發(fā)展建立了一整套有別 于傳統(tǒng)植物遺傳育種的、切實(shí)可行的外源基因(DNA)轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定的技術(shù)。由于它可以 打破物種間遺傳物質(zhì)橫向轉(zhuǎn)移的壁壘，創(chuàng)造出新的作物品種，因此為作物品種改良開(kāi)辟了 一條更為直接有效的途徑。基因工程育種方法可分為3類直接基因?qū)敕?通過(guò)物理或 化學(xué)方法引起)和載體介導(dǎo)法(即將目的基因插入到農(nóng)桿菌質(zhì)粒或病毒DNA分子上，隨著載 體DNA的轉(zhuǎn)移而將目的基因?qū)胫参锘蚪M)以及第三類種質(zhì)系統(tǒng)法(花粉管通道法、生殖 細(xì)胞浸染法、胚囊和子房注射法等)。以上方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株多數(shù)通過(guò)組織培養(yǎng)途徑獲 得，且轉(zhuǎn)基因后代所形成的細(xì)胞無(wú)性系變異較大，遺傳穩(wěn)定性差，植株再生頻率低。為了解決再生培養(yǎng)體系等問(wèn)題，1993年，Bechtold等發(fā)明了截然不同于離 體方法的in planta轉(zhuǎn)化法，研究發(fā)現(xiàn)將活體擬南芥植株浸泡在農(nóng)桿菌菌液的同時(shí)將菌液 和植株進(jìn)行抽真空處理，可明顯提高基因的轉(zhuǎn)移頻率，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.4%。(Bechtold N., Ellis J. and Pelletier G. In planta Aarobacterium~mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad Sci Paris, Life Sci., 1993，316:1194-1199)。In planta法是以生物自身的種質(zhì)細(xì)胞為媒體，特別是植物 生殖系統(tǒng)的細(xì)胞(花粉，卵細(xì)胞，子房，幼胚等)，將外源DNA導(dǎo)入完整植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)遺傳 轉(zhuǎn)化的基因?qū)爰夹g(shù)，稱之為種質(zhì)轉(zhuǎn)化(germ line transformation)，也稱為整株活體轉(zhuǎn) 化(in planta transformation)或植物原位轉(zhuǎn)化(閆新甫主編.轉(zhuǎn)基因植物.北京科學(xué) 出片反|土，2003)。 In planta Tj^iW^ft vacuum infiltration, floral-dip, spraying, 點(diǎn)滴微管法等。近年來(lái)，floral-dip轉(zhuǎn)化法(花序浸漬法)是擬南芥功能基因研究中廣泛釆 用的一種 In planta 轉(zhuǎn)基因方法。Feldmann 禾口 Marks (FeIdmann K. A. and Marks Μ. D., 1987， Agrobacterium-medi^ted transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana : a non-tissue culture approach. Mol. Gen. Genet. , 208:1—9)最先在擬南 芥中應(yīng)用原位滲透法獲得了轉(zhuǎn)基因成功。Chmg等(Chmg S. S.，Park S. K. md Nam H. G.， 1990， Transformation of Arabidopsis by Agrobacterium inoculation on wounds, Plant J.，5(4):551-558)利用摘下的幼嫩花序和受傷的擬南芥植株進(jìn)行農(nóng)桿菌接種感染 獲得轉(zhuǎn)基因植株，但遺傳轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，而且遺傳轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定。Clough和Bent (Clough S.J. and Bent A. Floral—dip: a simplified method for Agrobacteruim~mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. , 1998, 16:735—743)用擬南芥 作為受體用表面活性劑silwet-77取代抽真空處理，通過(guò)floral-dip轉(zhuǎn)移基因獲得成功。 Floral-dip轉(zhuǎn)移外源基因的最大優(yōu)點(diǎn)在于能直接獲得轉(zhuǎn)化的種子，避免了煩瑣的組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，并且基因轉(zhuǎn)化頻率高，一般在0. 5%-1% (轉(zhuǎn)基因成功種子與收獲種子之比)，且 轉(zhuǎn)基因后代遺傳穩(wěn)定(劉凡，王國(guó)英，曹鳴慶.2003，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位轉(zhuǎn)基因方法 研究進(jìn)展，分子植物育種，1(1): 108-116).據(jù)報(bào)道In planta轉(zhuǎn)基因方法已成功應(yīng)用于 苜蓿，白菜和蘿卜中，在油菜中已有初步應(yīng)用(Trieu A.T.，Burleigh S. H. , Kardailsky I. V. , Maldonado-Mendoza I. Ε. , Versaw W. K. , Blaylock L. Α. , Shin H. , Chiou Τ., Kataki H. , Dewbre G. R. , Weigel D. , and Harrison Μ. J. , 2000, Transformation of Medicago Truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium, Plant J. , 22(6):531-541； Somers D. A. , Samac D. A. , and Olhoft P. Μ. , 2003, Recent advances in Legume transformation, Plant Physiol., 131:892-899； Curtis I.S., and Nam H. G. , 2001, Transgenic radish{Raphanussativus L. Iongipinnatus Bailey) by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency, Transgenic Research, 10:363-371 ； Cao Μ. Q. , Liu F. , Yao L. , Bouchez D. , Tourneur C. , Li Y. , and Robaglia C. , 2000, Transformation of Pakchoi {Brassica rapa L. ssp. chinensis) by Agrobacterium infiltration, Mol. Breed. , 6:67-72;徐光碩，饒勇強(qiáng)，陳雁，張椿 雨，孟金陵，2004，用in planta方法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，作物學(xué)報(bào)，30 (1) 1_5)，但轉(zhuǎn)化頻 率仍然不高。芝麻作為世界上重要的油料作物之一，其組織培養(yǎng)研究較其他主要作物落后， 組織培養(yǎng)再生比較困難(RAMR et al. Sesame: New approaches for crop improvement[C] //: JANICK J, SIMON J. E. (eds). Advances in New Crops: Timber Press, Portland, 1990:225-228. BEATRICE et al. In vitro regeneration of sesame( Sesamum indicum L. ) from seedling cotyledon and hypocotyl explants[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2006, 85: 235-239)，從而制約了芝麻再生技術(shù)體系的建立，極大地阻礙 了芝麻細(xì)胞工程和遺傳轉(zhuǎn)化的深入研究，滯緩了芝麻生物技術(shù)育種的步伐。雖然研究者們 在芝麻離體培養(yǎng)方面進(jìn)行了較多的嘗試，但相關(guān)研究報(bào)道不多.2010年7月，Manju Yadav 等才首次成功報(bào)道了利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的芝麻遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化頻率也僅為1.01% (Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10. 1007/s 11240-010-9791-8)。芝麻組 織培養(yǎng)研究的整體水平較低，且已有的研究結(jié)果重復(fù)性較差，尚未形成一套通用的或具有 突破性的高頻率再生培養(yǎng)體系(孫建，張秀榮.芝麻組織培養(yǎng)研究進(jìn)展與展望.山地農(nóng) 業(yè)生物學(xué)報(bào).2009，28(1): 72-78)。利用In planta植物遺傳轉(zhuǎn)化法，能直接獲得轉(zhuǎn)化的 種子，避免了煩瑣的組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，同時(shí)為一些不易建立遺傳再生體系的作物類型 提供了基因轉(zhuǎn)移的新途徑，而且在擬南芥上的研究結(jié)果還表現(xiàn)出對(duì)基因型的不敏感性，一 些應(yīng)用其它方法轉(zhuǎn)化率低的生態(tài)型，也能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化頻率。(Mysore K S, Kumar C Τ, Stanton B G. Arabidopsis ecotypes and mutants that are recalcitrant to Agrobacterium root transformation are susceptible to germ line transformation. The plant Journal, 2000, 21(1):9_16)。但是此法在模式植物上的應(yīng)用較多，其他作物 上較為少見(jiàn)，有的甚至尚未成功，且有效性不高。當(dāng)前，技術(shù)難點(diǎn)的攻克和空白薄弱領(lǐng)域的 深入研究是影響高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物研究取得突破的關(guān)鍵問(wèn)題之一，因此有必要建立和發(fā)展多種植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。超聲波作為一種物理手段也可以介導(dǎo)外源DNA分子進(jìn)入帶壁的植物細(xì)胞和 組織。在超聲轉(zhuǎn)化條件下，以空化機(jī)制為主產(chǎn)生的高溫高壓作用于領(lǐng)近氣泡周圍的組 織、氣泡，從而可能導(dǎo)致這些細(xì)胞的細(xì)胞壁和質(zhì)膜的擊穿或可逆的質(zhì)膜透性改變，使 高分子的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。賈士榮等(賈士榮，曹冬孫.轉(zhuǎn)基因植物.植物學(xué)通 報(bào)，1992,9:3-15)發(fā)展了這種轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)22.3%。王國(guó)英等(王國(guó)英，張 宏，丁群星等.幾種玉米基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的研究及轉(zhuǎn)基因植株的獲得.生物工程學(xué) 報(bào)，1996，12 (1) 45-49)通過(guò)超聲波處理，成功地把Bt基因?qū)胗衩孜闯墒炫吆团咝杂?傷組織。章力健等(章力健，陳樂(lè)玫，袁靜等.超聲波直接導(dǎo)入外源基因高效煙草轉(zhuǎn)化 系統(tǒng)的建立.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991，24(2) 83-89)用超聲波處理煙草葉片獲得了 gus表 達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。Joersbo 等(Joersbo M.，Donalason I. and Kreiberg J.，et al. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol. Breed. , 1998，4:111-117)利用超聲波法將cat基因?qū)胩鸩撕蜔煵菰|(zhì)體，并獲 得短暫表達(dá)。Santarem( Ε. R. Santaremj H. N. Trick, J. S. Essig and J. J. Finer, Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression, Plant Cell Rep. , 1998， (17)， pp. 752 - 759)禾口 Tang等(Tang，Additional virulence genes and sonication enhance Agrobacterium tumefaciens~mediated loblolly pine transformation, Plant Cell Rep., 2003, (21)，pp. 555 - 562)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)同時(shí)結(jié)合超聲的方法在植物體內(nèi)進(jìn)行 gus基因轉(zhuǎn)化，有效的促進(jìn)了 gus基因在植物體內(nèi)大量表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)超聲處理從0. 5到2 秒時(shí)間段內(nèi)，外源基因瞬間表達(dá)頻率最高。Syed Sarfraz hassain(Syed Sarfraz hassain, Tayyab Husnain and S. Riazuddin, Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation( SAAT ): an alternative method for cotton transformation, Pak. J. Bot., 2007，39(1):223-230)以棉花成熟胚為外植體將農(nóng)桿菌侵染和超聲物理方法結(jié) 合起來(lái)有效的促進(jìn)了 gus基因在植物體內(nèi)大量表達(dá)。上述方法主要是在植物組織培養(yǎng)和細(xì) 胞上有應(yīng)用，但是超聲輔助法尚未應(yīng)用于in planta為基礎(chǔ)的植物遺傳轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物in planta遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因 方法，該方法易行，操作簡(jiǎn)便，成本低，周期短，可2人1天內(nèi)同時(shí)對(duì)1500-2000株植株進(jìn)行 轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)了菌液的滲透率，顯著提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率并拓展了該方法在不同植物中的適 用范圍。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
本發(fā)明技術(shù)要點(diǎn)一常規(guī)的in planta轉(zhuǎn)化法在模式植物擬南芥上應(yīng)用較多，轉(zhuǎn)化的 對(duì)象主要是胚珠，而在其他植物應(yīng)用上少見(jiàn)且轉(zhuǎn)化頻率較低，這是因?yàn)檗r(nóng)桿菌侵染受限于 大多數(shù)植物的花器官大小，不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，轉(zhuǎn)化難以發(fā)生。通過(guò)超聲輔助法使農(nóng)桿菌侵 染時(shí)能夠克服更多的花器官物理屏障，能進(jìn)入到不同植物的花器官細(xì)胞內(nèi)，使大多數(shù)花器 官大植物能有效使用此方法，從而使轉(zhuǎn)化更容易發(fā)生。技術(shù)要點(diǎn)二 通過(guò)超聲使轉(zhuǎn)化不僅僅 發(fā)生在胚珠，柱頭等雌配子細(xì)胞內(nèi)，外源基因還可通過(guò)農(nóng)桿菌侵染進(jìn)入到花粉，花藥，花絲等雄配子細(xì)胞當(dāng)中。這是由于農(nóng)桿菌是通過(guò)傷口侵入的，利用超聲波的“空化作用”處理 植物的受體系統(tǒng)，使植物受體細(xì)胞或組織上造成傷口，這樣農(nóng)桿菌中T-DNA攜帶外源基因 能夠更容易進(jìn)入，并高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，接受外源DNA整合后，轉(zhuǎn)化選擇對(duì)抗生素敏 感的再生系統(tǒng)，提高轉(zhuǎn)化效率。技術(shù)要點(diǎn)三本發(fā)明能直接獲得轉(zhuǎn)化的Tl代種子，避免了煩 瑣的組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，而對(duì)于那些難以建立甚至尚未建立再生體系的植物，意義更加 重大。技術(shù)要點(diǎn)四不受植物株型大小以及基因型的限制，如芝麻、大豆、油菜(甘藍(lán)型，白菜 型，芥菜型)，擬南芥等不同作物均可采用本專利所述的方法實(shí)施高效轉(zhuǎn)化。技術(shù)要點(diǎn)五本 發(fā)明專利操作簡(jiǎn)單，成本低，周期短，可同時(shí)對(duì)大批量植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化。技術(shù)要點(diǎn)六本發(fā)明專 利不依賴于抗生素篩選，可用不同的篩選標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物篩選鑒定。—種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因方法，其步驟是
1、農(nóng)桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化前處理將農(nóng)桿菌菌株EHA105-gUS-2301接種于LB培養(yǎng)基， 28 V，搖床培養(yǎng)1 2d后，再轉(zhuǎn)接新鮮的LB培養(yǎng)液中，搖菌24 h左右(使OD6tltl在1. 8 2. 0)。6000rpm離心收集菌體10 15min，室溫為20_25°C。2倍體積轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基溶解。2、超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的in planta遺傳轉(zhuǎn)化
選擇待處理的甘藍(lán)型油菜浙油18等植株，去除所有已開(kāi)放的花朵。將所有植株的主花 序用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基溶解的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行2 30 sec不同時(shí)間倒置超聲侵染處理，同時(shí)掛 牌 標(biāo)明處理時(shí)間。侵染完后倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住，陰處平放22-26h后，除去 保鮮膜，蒸餾水沖洗植株后，于土壤缽中置正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，待成熟期收獲Tl代種子。所述的待處理植株為甘藍(lán)型油菜浙油18 (Brassica napus L.)，擬南芥 {Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia)},白菜型油菜 0639，3965 (Brassica rapa L.);芥菜型油菜 2522，I^iBrassica juncea L.)，野芥野油儀 Sinapis arvensis L.)， 蘇芝-1 (Sesamum indicum L.)；
所述的待處理植株為剛開(kāi)放1-2朵花花蕾期的植株；
所述的超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物in planta高效遺傳轉(zhuǎn)化的對(duì)象為未開(kāi)花的花蕾； 所述的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌U^ro力acieriwsi腫e/acie/ ·^) EHA105，所含質(zhì)粒pCAMBIA 2301攜帶含內(nèi)含子的gus報(bào)告基因，抗性標(biāo)記為卡那霉素(Km)和利福平(Rif)抗性，gus基 因通過(guò)CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。所述的超聲儀器為雙頻數(shù)控超聲清洗儀(KQ-500VDE型)
所述的超聲輔助處理時(shí)裝有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的儀器為大容積的塑料大燒杯； 所述的超聲波處理的參數(shù)為電源220V 50Hz超聲頻率為28/45 KHz，超聲電功率為 500W ；
所述的超聲處理時(shí)間為2 sec, 5 sec, 15 sec,30sec 4個(gè)處理，分別以未經(jīng)超聲直接侵 染處理的植株為各自對(duì)照2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck ；
3、卡那霉素抗性篩選將收集到的部分Tl代種子進(jìn)行卡那霉素抗性植株篩選，所述的 卡那霉素抗性篩選最適濃度為350 mg/L，此時(shí)油菜等幼苗下胚軸呈現(xiàn)淡紫色，葉片嚴(yán)重黃 化。而在此濃度以上油菜等幼苗全部死亡。詳細(xì)篩選步驟見(jiàn)實(shí)施例1. 6. 1
4、PCR檢測(cè)抗性植株中的gus基因?qū)⒑Y選到的抗性植株進(jìn)行PCR快速檢測(cè)，所述的 PCR檢測(cè)抗性植株中的gus基因所用到的引物是
GusF2 (5， to 3，)CGGCAAAGTGTGGGTCAATGusR2 (5， to 3，)AAGGGTAATGCGAGGTACGGT。本發(fā)明得到Gus基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500bp，并且超聲15sec處理時(shí)，gus基因轉(zhuǎn) 化頻率達(dá)到20%
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以優(yōu)點(diǎn)和效果
1.本發(fā)明已經(jīng)成功應(yīng)用于不易建立遺傳再生體系作物芝麻，提供了基因轉(zhuǎn)移的新途 徑，得到了轉(zhuǎn)基因芝麻種子。2.本發(fā)明利用超聲技術(shù)對(duì)植株進(jìn)行in planta轉(zhuǎn)化大大提高了外源基因轉(zhuǎn)化效率。3.本發(fā)明借助超聲打破植物屏障，外源基因可成功進(jìn)入各種細(xì)胞中，如胚珠，花 瓣，花梗，胚囊等，對(duì)不同植物的不同組織提高了轉(zhuǎn)化效率。4.本發(fā)明已經(jīng)成功獲得了油菜、擬南芥、芝麻等轉(zhuǎn)基因種子，并且每粒種子都是一 個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。5.本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低，周期短，可2人1天內(nèi)同時(shí)對(duì)1500-2000株植株進(jìn)行 轉(zhuǎn)化，且不受基因型限制。6.本發(fā)明已經(jīng)成功的用抗除草劑bar基因，gus基因(基因)，卡那霉素基因進(jìn)行轉(zhuǎn) 基因植株的篩選，每粒轉(zhuǎn)基因種子都是獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。其中，本發(fā)明得到的gus基因轉(zhuǎn)化頻 率可達(dá)20%，卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化頻率達(dá)到78. 38%。


圖1為一種卡那霉素抗性植株示意圖
圖2為一種油菜(子葉，下胚軸)gus基因化學(xué)組織染色示意圖 圖3，4為一種白菜型油菜0639、3965gus基因化學(xué)組織染色示意圖 圖5為一種野芥gus基因化學(xué)組織染色示意圖 圖6為一種擬南芥gus基因化學(xué)組織染色示意圖 圖7為一種芝麻gus基因化學(xué)組織染色示意圖。
具體實(shí)施例方式下文將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于 下面的實(shí)施例。實(shí)施例1
一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因方法，其步驟是
1材料與方法
1.1供試植物材料
選擇初花期的甘藍(lán)型油菜浙油(Aral5lSica napus L. ) 18 1. 2農(nóng)桿菌質(zhì)粒及外源基因
菌株為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteri^tumefaciens )EHA105 (項(xiàng)友斌等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘇 云金桿菌抗蟲(chóng)基因crylA (b)和crylA (c)在水稻中的遺傳轉(zhuǎn)化及蛋白表達(dá).生物工程學(xué) 報(bào)，1999，15(4) 494-500)，所含質(zhì)粒 pCAMBIA 2301 (Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediatedgenetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10. 1007/s 11240-010-9791-8)(該質(zhì)粒攜帶含內(nèi)含子的 gus 報(bào)告基 因，抗性標(biāo)記為卡那霉素(Km)和利福平(Rif)抗性，gus基因通過(guò)CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)表 達(dá))
1. 3農(nóng)桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化前處理 將農(nóng)桿菌菌株EHA105-gus-2301接種于LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物10 g/ L，NaCl 5 g/L，NaOH 調(diào)節(jié)至 pH=7)，含 Km (50 mg/L)和 Rif (30 mg/L), 28°C, 200 rpm，搖床 培養(yǎng)1 2d后，再轉(zhuǎn)接新鮮的LB培養(yǎng)液中，搖菌24 h左右(使OD6tltl在1. 8 2. 0)。6000rpm 離心收集菌體10 15min，室溫為20_25°C。2倍體積轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基溶解。所述的農(nóng)桿菌菌種 為EHA105-gus-2301 (^ro力acieri腫 腫e/acie^s);轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6-BAP (0. 01ng/L) +蔗糖 5% (m/v) + Silwet-77 0. 05% (ν/ν)，(ρΗ=5· 8 左右) 1. 4超聲處理
選取初花期的甘藍(lán)型油菜浙油18進(jìn)行2sec，5sec, 15sec, 30sec不同的超聲處理(以未 經(jīng)超聲直接侵染處理的植株為對(duì)照CK)，進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染實(shí)驗(yàn)，每處理隨機(jī)選擇20株，各4 個(gè)重復(fù)，同時(shí)掛牌標(biāo)明處理時(shí)間。侵染完后倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住22-26 h， 將植株用蒸餾水沖洗，陰處平放。除去保鮮膜，蒸餾水沖洗植株后，放置于土壤缽中正常生 長(zhǎng)條件下培養(yǎng)直至角果成熟。1. 5種子收獲收集處理部位成熟角果，脫粒，得到甘藍(lán)型油菜Tl代種子。1.6轉(zhuǎn)基因植株的篩選 1. 6. 1卡那霉素抗性篩選
取部分收獲的Tl代種子經(jīng)75% (ν/ν)酒精表面消毒30 s,0. 1% (v/v) HgCl2消毒10 min，鋪在MS基本培養(yǎng)基上，將正常生長(zhǎng)的綠苗轉(zhuǎn)到抗性篩選培養(yǎng)基中(含卡那霉素濃度為 350 mg/L)，兩周后，統(tǒng)計(jì)并記錄綠色苗子生長(zhǎng)及變化情況.再將正常生長(zhǎng)的綠色苗轉(zhuǎn)移到 土缽中培養(yǎng)，為開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用.
統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明在卡那霉素濃度為350 mg/L時(shí)，少數(shù)植株死亡，部分葉片嚴(yán)重黃化，真 葉呈現(xiàn)深紫色(見(jiàn)圖1)。農(nóng)桿菌侵染結(jié)合超聲處理所得到的綠色抗性植株比例均高于未經(jīng) 超聲而直接侵染所得到的綠色抗性植株比例，并且4個(gè)處理中，超聲15 sec得到的抗性轉(zhuǎn) 化頻率可高達(dá)78. 38% (見(jiàn)表1)，初步表明超聲處理結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化可大大提高轉(zhuǎn)基因植株 獲得的機(jī)率，有效的促進(jìn)外源基因在植株中高效的表達(dá)，從而獲得大量的綠色正常生長(zhǎng)的 轉(zhuǎn)基因植株。1. 6. 2 gus基因的組織化學(xué)法篩選
分別選取上述初步經(jīng)過(guò)卡那霉素篩選到的綠色抗性植株子葉、下胚軸、根部不同部位 進(jìn)行組織化學(xué)染色法檢測(cè)，棄去染色液，分別統(tǒng)計(jì)被染成藍(lán)色或未被染成藍(lán)色部位(見(jiàn)圖 2 )，鏡檢觀察并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)表2 )。結(jié)果表明農(nóng)桿菌侵染并結(jié)合超聲處理植株被染成藍(lán)色的比例均高于未經(jīng)超聲而 直接侵染植株，處理15 sec時(shí)，gus基因染色比例最高可達(dá)77. 06%,與以上抗性植株篩選得 到的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明此發(fā)明涉及的超聲處理結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法可大大提高轉(zhuǎn) 基因植株獲得的機(jī)率，有效促進(jìn)外源基因在植株中高效的表達(dá)。實(shí)施中發(fā)現(xiàn)油菜根部最容 易被染上藍(lán)色，下胚軸次之，子葉染上藍(lán)色比例最小，并且各部位染色深淺程度各不一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因油菜中外源基因在植株中表達(dá)強(qiáng)度表現(xiàn)不一致，T-DNA可以多位點(diǎn)插入，因此其 后代的遺傳規(guī)律可能會(huì)比較復(fù)雜。1.6.3 gus基因的PCR鑒定篩選
將上述步驟得到的轉(zhuǎn)基因油菜充分研磨，用CTAB法提取植物總DNA，用gus基因引物 (GusF2 和 GusR2)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。通過(guò)PCR擴(kuò)增雖然在一定程度上大大的降低了假陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的比例，但結(jié)果 表明超聲15sec時(shí)，gus基因轉(zhuǎn)化頻率最高，并且可達(dá)到20%，超聲處理30sec時(shí)可達(dá)到 12. 12%，仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他文獻(xiàn)上提到的農(nóng)桿菌侵染比例(見(jiàn)表3)。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明此發(fā) 明涉及到的超聲處理結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化確實(shí)可大大提高轉(zhuǎn)基因植株獲得的機(jī)率，有效的促進(jìn) 外源基因在植株中高效的表達(dá)。表1甘藍(lán)型油菜浙油18卡那霉素抗性篩選數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表
慫理綠苗數(shù)i-.ir . J. -· f -If,抗性轉(zhuǎn)-化頻車 =綠苗Z總It ι %: 浙油18(未.處理)j 815CK 2sec2411720.513010229-41CK 5sec12901333Ssec，^y10232.35CK 15secH90JO.D /15sec8711178.38CK30sec519951.5230sec6310261.76
表2甘藍(lán)型油菜浙油ISgus基因的組織化學(xué)法篩選數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表
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權(quán)利要求
一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物in planta遺傳轉(zhuǎn)化方法，其步驟是A、農(nóng)桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化前處理 將農(nóng)桿菌菌株接種于LB培養(yǎng)基，28℃，搖床培養(yǎng)1～2d后，再轉(zhuǎn)接新鮮的LB培養(yǎng)液中，搖菌22 26 h，使OD600在1.8～2.0，6000rpm 離心收集菌體10～15 min，室溫為20 25℃，2倍體積轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基溶解；B、超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的in planta遺傳轉(zhuǎn)化選擇待處理的植株，去除所有已開(kāi)放的花朵，將所有植株的主花序用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基溶解的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行2～30 sec不同時(shí)間倒置超聲侵染處理，同時(shí)掛牌標(biāo)明處理時(shí)間，侵染完后倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住，陰處平放22 26h后，除去保鮮膜，蒸餾水沖洗植株后，于土壤缽中置正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，待成熟期收獲T1代種子；所述的待處理植株為剛開(kāi)放1 2朵花花蕾期的植株；所述的超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物in planta高效遺傳轉(zhuǎn)化的對(duì)象為未開(kāi)花的花蕾；所述的超聲波處理的參數(shù)為電源220V 50Hz超聲頻率為28/45 KHz，超聲電功率為500W；所述的超聲處理時(shí)間為2 sec，5 sec，15 sec，30sec 4個(gè)處理，分別以未經(jīng)超聲直接侵染處理的植株為各自對(duì)照2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck；C、卡那霉素抗性篩選將收集到的部分T1代種子進(jìn)行卡那霉素抗性植株篩選，所述的卡那霉素抗性篩選濃度為350 mg/L；D、PCR檢測(cè)抗性植株中的gus基因?qū)⒑Y選到的抗性植株進(jìn)行PCR快速檢測(cè)，所述的PCR檢測(cè)抗性植株中的gus基因所用到的引物是GusF2CGGCAAAGTGTGGGTCAAT 5’to 3’GusR2AAGGGTAATGCGAGGTACGGT 5’to 3’ Gus基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物inplanta遺傳轉(zhuǎn)化方 法，其特征在于所述的農(nóng)桿菌菌種為EHA105-gUS-2301 ；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +6-BAP+ 5% 蔗糖+Silwet-77，ρΗ=5· 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物inplanta遺傳轉(zhuǎn)化方法， 其特征在于所述的待處理植株為甘藍(lán)型油菜浙油18，擬南芥，白菜型油菜0639，3965，芥 菜型油菜2522，2565，野芥野油41。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物inplanta遺傳轉(zhuǎn)化方法，步驟是A、農(nóng)桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化前處理；B、超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化選擇植株，去除開(kāi)放的花朵，將植株的花序用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基溶解的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行不同時(shí)間倒置超聲侵染處理，標(biāo)明處理時(shí)間，侵染完后倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住，陰處平放，除去保鮮膜，蒸餾水沖洗植株后，于土壤缽中置培養(yǎng)，待成熟期收獲種子；C、卡那霉素抗性篩選將收集到的部分T1代種子進(jìn)行卡那霉素抗性植株篩選；D、PCR檢測(cè)抗性植株中的基因?qū)⒑Y選到的抗性植株進(jìn)行PCR快速檢測(cè)。方法易行，操作簡(jiǎn)便，成本低，可2人1天內(nèi)同時(shí)對(duì)1500-2000株植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)了菌液的滲透率，顯著提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101979602SQ20101029851
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月8日
發(fā)明者伍曉明, 呂曉丹, 張?zhí)飕? 李 浩, 許鯤, 閆貴欣, 陳碧云, 高桂珍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所