專利名稱：一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法
技術領域：
本發明涉及一種植物轉基因方法，具體涉及一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，屬生物技術領域。
背景技術：
基因工程是指按照人們的愿望，通過嚴密的實驗設計，利用體外DNA重組和轉基因等技術，在較短的時間內創造出更符合人們需求的目標生物類型。隨著現代分子生物學理論的發展和研究技術的進步，利用基因工程技術開展生物品種的定向改良和目標性狀育種成為可能，其中利用轉基因技術改良作物品種具有獨特的優勢。其中，狹義的轉基因技術主要有兩種，一是基因槍介導方法，二是農桿菌介導方法。基因槍介導的轉基因技術在甘蔗上已經有較多成功的應用實例，但是，該技術具有運行費用高、目的基因插入位點不確定、獲得的轉基因株系幾乎都是多拷貝等缺點。與基因槍介導的轉基因技術相比，農桿菌介導的轉基因技術具有以下幾個優點1、無需昂貴設備，所采用試劑皆為常規試劑，運行費用低；2、目的基因插入位點明確；3、獲得單拷貝轉基因后代頻率高，性狀遺傳穩定性高，同時，由于該途徑獲得的轉基因后代為單拷貝或低拷貝，轉基因安全性較高。轉基因甘蔗的研制及其商品化應用具有獨特的優勢。首先，甘蔗是無性繁殖作物， 在我國蔗區栽培條件下一般不開花，即使在某些特殊氣候地區開花，其花粉也是敗育的，轉基因植株的外源基因不易漂移，生態安全性較好；其次，甘蔗是蔗糖或燃料乙醇的工業原料，加工蔗糖需要經過107 °C的高溫煉煮，外源基因表達的蛋白必然會被分解，而燃料乙醇又非食用品，轉基因食品安全系數較高；再次，甘蔗是天然的工業化工原料，轉基因原料同樣是集中加工的，不容易擴散；最后，轉基因甘蔗植株可在短時間內經組培擴繁獲得大量種苗，商品化進程快。綜上所述，甘蔗不僅是轉基因安全等級最高(IV級)的作物，同時也是轉基因改良最容易成功的作物之一。迄今，水稻等為數不多的幾種單子葉植物的農桿菌介導轉基因方法已經比較成熟，但是，相對雙子葉植物而言，單子葉植物農桿菌介導的轉化率總體比較低，其中農桿菌介導遺傳轉化甘蔗的效率不高，已經成為農桿菌介導的甘蔗轉基因育種的“瓶頸”問題，因為只有獲得一定數量規模的轉基因甘蔗群體，才有可能篩選到優良的單株。因此，農桿菌介導的甘蔗轉基因實驗中，大量的工作都集中在培養基的配制和接種，尤其是培養基的配制。在常規的農桿菌介導甘蔗轉基因過程中，需要添加一些能抑制農桿菌生長的抗生素，這些抗生素不耐高溫高壓，只能通過過濾滅菌后才能加入培養基中。常規情況下是，培養容器和培養基經過高溫高壓滅菌后，冷卻到40 0C-50 °C，再加入經過濾滅菌后的抗生素，然后分裝到培養容器，冷卻凝固后備用。以上工作程序繁鎖、工作量大。如果能找到一種無需高溫高壓、又能抑制農桿菌生長、同時還不影響甘蔗正常生長的培養基， 就可以解決以上問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法。
本發明的目的是通過以下方法實現的。本發明的一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，包括抑菌劑的配制、培養容器消毒、農桿菌轉化、培養基配制、共培養、選擇培養、篩選培養、壯苗培養和生根培養，其特征在于
1.抑菌劑的配制使用益培隆殺菌劑配制抑菌劑1號和抑菌劑2號；抑菌劑1號的配制方法在益培隆殺菌劑A瓶藥劑中加入20 ml蒸餾水稀釋后與B瓶藥劑混合，并用蒸餾水定容到100 ml，即為抑菌劑1號；抑菌劑2號的配制方法在益培隆殺菌劑A瓶藥劑中加入 20 ml蒸餾水稀釋后與B瓶藥劑混合，加入6 g Timentin，并用蒸餾水定容到100 ml，即為抑菌劑2號；所述益培隆殺菌劑由A瓶藥劑和B瓶藥劑組成；Timentin為一種抗生素，固體， 由替卡西林鈉與克拉維酸鉀，按照重量比為15:1的比例組成，其中替卡西林鈉純度不低于 99. 1%，卡拉維酸鉀純度不低于99. 2%，由市場購得；Timentin具有廣譜殺菌作用；
2.培養容器消毒將培養瓶及瓶蓋在抑菌劑1號與水的體積比為0.3 % 0. 5 %(V / V)的水溶液中浸泡不少于10 h，保存備用；
3.農桿菌轉化選擇攜帶bar基因的植物表達載體，導入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中、制備轉化菌液、侵染甘蔗心葉；
4.培養基配制共培養培養基為1/2MS+3.0 mg/L 2，4-D+100 μ mol/L乙酰丁香酮 +3 5 ml/L抑菌劑2號+20. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8 ；選擇培養基為MS+3. 0 mg/L 2，4-D+3 5 ml/L抑菌劑2號+30. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8 ；篩選培養基為 MS+2 mg/L 6-BA+0. 2 mg/L NAA+2 6 mg/L PPT+3 5 ml/L 抑菌劑 2 號 +30. 0 g/L 蔗糖 +3. 5 g/L 瓊脂粉，pH5. 8 ；壯苗培養基為 MS+0. 5 1 mg/L 6-BA+0. 5 1 mg/L KT+3 5 ml/L抑菌劑2號+30. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，ρΗ5· 8 ；生根培養基為1/2MS+3 mg/L NAA+3 5 ml/L抑菌劑2號+40 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8 ；所述MS培養基為1962 年，Murashige和Skoog公開的MS培養基；所述2，4-D，指2，4- 二氯苯氧乙酸；所述6-BA，指 6-芐氨基嘌吟；所述NAA，指^ -萘乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌吟；配制培養基時，先不加抑菌劑2號，按各培養基配方配齊其他原料后，用蒸餾水定容、加熱至瓊脂粉完全溶解，然后按各培養基配方添加抑菌劑2號，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調pH值至5. 8， 分裝到培養容器中，封口，冷卻凝固后備用；
5.共培養將侵染后的材料從轉化菌液中取出后，用滅菌濾紙吸干表面的轉化菌液， 然后轉至共培養培養基上，在22 °C黑暗條件下共培養3 d；
6.選擇培養將共培養后的材料移至選擇培養基中，在觀！黑暗條件下培養二代， 每14 d轉接一次為一代；
7.篩選培養將選擇培養后的材料移至篩選培養基上，15d部分愈傷組織分化出小芽；培養室溫度為觀°C，光照12 h，光照強度為1200 Ix ；
8.壯苗培養將篩選培養后獲得的小芽轉到壯苗培養基上，15d后形成小苗；培養室溫度為28 °C，光照12 h，光照強度為1200 Ix ；
9.生根培養將壯苗培養后獲得的小苗分成單株接種到生根培養基上，15 30d即可形成完整植株；培養室溫度為觀°C，光照12 h，光照強度為1500 Ix0本發明的應用效果
1.本發明培養基對農桿菌侵染后的甘蔗愈傷組織生長的影響由于本發明配制的培養基是無需高溫高壓，所以在增殖過程中，除了要考慮愈傷組織生長狀況外，還要考慮農桿菌的污染問題。表1試驗結果表明，本發明一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法與常規的農桿菌介導甘蔗轉基因方法相比，在愈傷組織生長狀況和農桿菌污染率方面都沒有差異。如果常規培養基中不添加頭孢霉素，只用高溫高壓的話，其農桿菌污染率達到100 %。
表1本發明培養基對農桿菌侵染后的甘蔗愈傷組織生長的影響
權利要求
1.一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，包括抑菌劑的配制、培養容器消毒、農桿菌轉化、培養基配制、共培養、選擇培養、篩選培養、壯苗培養和生根培養，其特征在于(1)抑菌劑的配制抑菌劑1號的配制方法在益培隆殺菌劑A瓶藥劑中加入20 ml 蒸餾水稀釋后與B瓶藥劑混合，并用蒸餾水定容到100 ml，為抑菌劑1號；抑菌劑2號的配制方法在益培隆殺菌劑A瓶藥劑中加入20 ml蒸餾水稀釋后與B瓶藥劑混合，加入6 g Timentin,并用蒸餾水定容到100 ml，為抑菌劑2號；所述Timentin為一種抗生素，由替卡西林鈉與克拉維酸鉀，按照重量比為15:1的比例組成，其中替卡西林鈉純度不低于99. 1%， 卡拉維酸鉀純度不低于99. 2% ；(2)培養容器消毒將培養瓶及瓶蓋在抑菌劑1號與水的體積比為0.3% 0.5 %的水溶液中浸泡不少于10 h，保存備用；(3)農桿菌轉化選擇攜帶bar基因的植物表達載體，導入根癌農桿菌Ugr0如cteri tumefaciens)菌株EHA105中、制備轉化菌液、侵染甘蔗心葉；(4)培養基配制共培養培養基為1/2MS+3.0mg/L 2，4-D+100 μ mol/L乙酰丁香酮 +3 5 ml/L抑菌劑2號+20. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8 ；選擇培養基為MS+3. 0 mg/L 2，4-D+3 5 ml/L抑菌劑2號+30. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8 ；篩選培養基為 MS+2 mg/L 6-BA+0. 2 mg/L NAA+2 6 mg/L PPT+3 5 ml/L 抑菌劑 2 號 +30. 0 g/L 蔗糖 +3. 5 g/L 瓊脂粉，pH5. 8 ；壯苗培養基為 MS+0. 5 1 mg/L 6-BA+0. 5 1 mg/L KT+3 5 ml/L抑菌劑2號+30. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，ρΗ5· 8 ；生根培養基為1/2MS+3 mg/L NAA+3 5 ml/L抑菌劑2號+40 g/L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8 ；所述MS培養基為1962 年，Murashige和Skoog公開的MS培養基；所述2，4-D，指2，4- 二氯苯氧乙酸；所述6-BA，指 6-芐氨基嘌吟；所述NAA，指^ -萘乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌吟；配制培養基時，先不加抑菌劑2號，按各培養基配方配齊其他原料后，用蒸餾水定容、加熱至瓊脂粉完全溶解，然后按各培養基配方添加抑菌劑2號，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調pH值至5. 8， 分裝到培養容器中，封口，冷卻凝固后備用；(5)共培養將侵染后的材料從轉化菌液中取出后，用滅菌濾紙吸干表面的轉化菌液，然后轉至共培養培養基上，在22 °C黑暗條件下共培養3 d；(6)選擇培養將共培養后的材料移至選擇培養基中，在觀！黑暗條件下培養二代， 每14 d轉接一次為一代；(7)篩選培養將選擇培養后的材料移至篩選培養基上，15d部分愈傷組織分化出小芽；培養室溫度為觀°C，光照12 h，光照強度為1200 Ix ；(8)壯苗培養將篩選培養后獲得的小芽轉到壯苗培養基上，15d后形成小苗；培養室溫度為28 °C，光照12 h，光照強度為1200 Ix ；(9)生根培養將壯苗培養后獲得的小苗分成單株接種到生根培養基上，15 30d即可形成完整植株；培養室溫度為觀°C，光照12 h，光照強度為1500 Ix0
2.根據權利要求1所述的一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，其特征在于共培養培養基為 1/2MS+3. 0 mg/L 2，4-D+100 μ mol/L 乙酰丁香酮 +4 ml/L 抑菌劑 2 號 +20. 0 g/ L蔗糖+3. 5 g/L瓊脂粉，pH5. 8。
3.根據權利要求1所述的一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，其特征在于選擇培養基為 MS+3. 0 mg/L 2，4-D+4 ml/L 抑菌劑 2 號 +30. 0 g/L 蔗糖 +3. 5 g/L 瓊脂粉，pH5. 8。
4.根據權利要求1所述的一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，其特征在于篩選培養基為 MS+2 mg/L 6-BA+0. 2 mg/L NAA+2 mg/L PPT+4 ml/L 抑菌劑 2 號 +30. 0 g/L 蔗糖 +3.5 g/L 瓊脂粉，pH5. 8。
5.根據權利要求1所述的一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，其特征在于壯苗培養基為 MS+0. 5 mg/L 6-BA+0. 5 mg/L KT+4 ml/L 抑菌劑 2 號 +30. 0 g/L 蔗糖 +3. 5 g/L 瓊脂粉，pH5.8。
6.根據權利要求1所述的一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，其特征在于生根培養基為 1/2MS+3 mg/L NAA+4 ml/L 抑菌劑 2 號 +40 g/L 蔗糖 +3. 5 g/L 瓊脂粉，pH5. 8。
全文摘要
本發明涉及一種簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，包括抑菌劑的配制、培養容器消毒、農桿菌轉化、培養基配制、共培養、選擇培養、篩選培養、壯苗培養和生根培養；本發明的抑菌劑配制方法簡單；培養基配制，只要按不同的培養基配方常規方法配制后，再加上抑菌劑即可；培養容器和培養基都無需高溫高壓滅菌，這在以農桿菌介導的甘蔗轉基因的培養基配制上，大大地減少了工作量和能源消耗，簡化了組培環節，降低了組培成本，與常規的農桿菌介導甘蔗轉基因方法對比，可以降低成本10%以上。本發明簡便的農桿菌介導甘蔗轉基因方法，操作簡單，實用性強，推廣性好。
文檔編號C12N15/84GK102559748SQ20121007046
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月17日 優先權日2012年3月17日
發明者林慶良, 許莉萍, 闕友雄, 陳如凱, 高世武 申請人:福建農林大學