專利名稱：用于特異性核酸檢測和定量的同組異序引物延伸方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用同組異序引物延伸(iPE)法檢測和定量特異性DNA或RNA的方法。
常規用于檢測和定量核酸(如DNA和RNA)特異性序列的方法包括Southern印跡，Northern分析和RNA酶保護分析和聚合酶鏈式反應(PCR)及其他方法。但如果考慮到樣品中的某個特異性RNA的檢測，Northern印跡和RNA酶保護分析就存在以下缺陷有效性有限、勞動強度大、精確度低、成本高、靈敏度低、需要較多的RNA樣品、特定的設備，且將產生大量生物危險性和放射性廢物。具體的說，Northern印跡和RNA酶保護分析都需要2-3天來完成分析。另外，Northern印跡需要RNA凝膠跑樣、將RNA轉移到固相載體上、制備探針、和進行雜交反應。敏感性則需要5μg樣品以保證足夠的敏感度。Northern印跡的理論基礎是靶核酸與探針核酸間的雜交。另外，每次反應的成本非常高，而且產生的生物危險性和放射性廢物的量也非常多。
類似的，RNA酶保護分析需要2-3天得到適合的結果。試驗步驟需要制備模板DNA、制備RNA探針、進行雜交反應、酶消化反應和凝膠跑樣。為了得到良好的結果，需要1μg靶RNA樣品。RNA酶保護分析的理論基礎是將雜交和酶消化反應聯合。與Northern印跡方法相同，進行這種反應的成本也很昂貴。另外也產生大量生物危險性和放射性廢物。表1列出了Northern印跡、RNA酶保護分析和本發明多引物延伸方法各種因素的比較。
美國專利No.5,846,710公開了用引物延伸方法來篩選變異的DNA分子。但該專利并未公開對樣品中靶DNA或RNA的檢測。
美國專利No.5,994,079公開了將DNA引物與特異性RNA退火形成RNA/DNA雜交體，并用逆轉錄酶延伸引物。用對RNA/DNA雜交體的特異性抗體檢測雜交體。但該專利未公開如本發明所述的檢測樣品中靶DNA或RNA的方法。
可以看出本領域需要一種簡單、節約時間的檢測核酸的方法，而且這種方法敏感、成本低、有效，且對環境的影響小。以下所述的本發明滿足了這些要求。
本發明滿足了上述要求。
本發明涉及檢測和定量樣品中靶核酸的方法，該方法包括
(a)制備特異性配對于靶核酸預定位點的一種或多種引物；(b)在高度嚴謹條件下將(a)的一種或多種引物與靶核酸退火，在靶核酸預定位點得到引物-靶核酸雙鏈體；(c)將(b)的引物-核酸雙鏈體與一混合物混合，該混合物含有(1)一種或兩種或三種類型游離非終止子核苷酸，和至少一種類型的非終止子核苷酸，它任選地標記有可檢測標記物，和(2)有或無某一類型的終止子核苷酸，該核苷酸與(1)中的一種或兩種或三種非終止子核苷酸不同；(d)通過酶促或化學反應在適當的緩沖液中進行引物延伸；和(e)檢測或定量引物延伸的核苷酸上標記信號的量，或(f)用質譜分析檢測或定量延伸的引物的量。
在上述方法中，引物可以是一種核酸引物、寡脫氧核苷酸、寡核糖核苷酸或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。感興趣核酸可以是脫氧核糖核酸、核糖核酸或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
在一優選實施例中，該方法包括用含有如下非終止子和終止子核苷酸的組合(a)dATP、dCTP、dGTP、ddTTP或ddUTP，(b)dATP、dCTP、dTTP或dUTP、ddGTP，(c)dATP、dGTP、dTTP或dUTP、ddCTP，(d)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP、ddATP，(e)dATP、dCTP、dGTP(f)dATP、dCTP、dTTP或dUTP，(g)dATP、dGTP、dTTP或dUTP或(h)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。
本發明的方法可使用至少一種標記有可檢測標記物的非終止子核苷酸。可檢測的標記物包括酶或蛋白質部分、放射性同位素、熒光部分或化學基團(如生物素)。另外，檢測或定量方法的步驟中還可用質譜分析進行。
用于本發明引物延伸反應的酶包括模板依賴性酶，如大腸桿菌DNA聚合酶I或其克列諾片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、水生棲熱菌DNA聚合酶、逆轉錄病毒逆轉錄酶、或它們的組合。
可從以下本發明的描述、附帶的參考圖和權利要求，對本發明的這些和其他目的有更全面的理解。


圖1-多引物延伸反應以檢測和定量特異性DNA序列的模式圖。圖2-用多引物延伸方法檢測和定量RNA的模式圖。圖中直線表示引物序列，小寫字母a、g、c和t是從引物延伸的堿基，其中一些標記有可檢測的標記物。u和t可交換使用。
本發明涉及用同組異序引物延伸(iPE)法檢測和定量特異性核苷酸序列的方法。概括而言，本發明是將樣品中的靶DNA或RNA與單個或多個寡核苷酸引物雜交。然后在存在一種、兩種或三種類型預標記的游離核苷酸時，用DNA聚合酶或逆轉錄酶延伸引物。連續延伸所需的四種類型的核苷酸中至少一種未參與反應，或被相應類型的終止子核苷酸(如雙脫氧核苷酸)替代。然后通過確定延伸的引物上是否存在標記物產生的信號，檢測和定量特異性靶核酸。因為延伸的引物與游離核苷酸分開，延伸的引物可用于分析標記物的摻入量。
延伸相應于靶核酸某一位置的引物，將產生許多相同長度(同組異序)的引物延伸的核酸，因為序列依賴性地摻入了確定量的核苷酸。定量這些同等延伸的引物，就能精確定量靶核酸的數目或數量。如果樣品中有許多靶DNA或RNA的拷貝，摻入帶標記核苷酸的引物延伸產物的拷貝數也相應地增加，從而產生更強的總信號。因此，將未知樣品中觀察到的信號強度與已知DNA或RNA量的標準樣品相比較，就可檢測和/或定量樣品中的靶DNA或RNA。在另一實施例中，用質譜分析測定這些相同長度引物延伸核酸的數量，即可檢測或定量特異性靶核酸。
反應緩沖液中無某一游離核苷酸將使引物延伸終止，這里原應插入缺少的核苷酸。這樣就可得到不連續長度的引物延伸產物。
本發明范圍中可有許多顯而易見的改變。例如，在引物延伸反應中不僅可缺少一種類型的核苷酸，也可以缺少兩種或三種類型核苷酸。同樣也可使用各種標記物，不僅僅限于放射性核苷酸，也可以是熒光的或酶促的。
這里所用的“核酸”或“核苷酸”可以是脫氧核糖核酸、核糖核酸或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。核酸樣品可以是天然的或合成的。核酸樣品可以是天然來源的核酸，也可來自任何生物體。可用于本發明方法的一些生物體為植物、微生物、病毒、鳥、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、人、馬、狗、牛、貓、豬或羊。靶核酸可以是天然的，或可以是體內酶促合成的、體外酶促合成的或非酶促合成的。
含有一種感興趣的核酸或多種感興趣的核酸的樣品可以含有來自生物體的基因組DNA、它們的RNA轉錄物、或由這些RNA轉錄物制備的cDNA。含有一種感興趣的核酸或多種感興趣的核酸的樣品也可含有生物體基因組外的DNA、它們的RNA轉錄物、或由這些RNA轉錄物制備的cDNA。同樣，該感興趣的核酸或這些感興趣的核酸可通過聚合酶鏈式反應合成。
感興趣的核酸可包括非天然核苷酸類似物，如脫氧肌苷或7-脫氮-2’-脫氧鳥苷。這些類似物使DNA雙鏈失去穩定，且可以在雙鏈樣品中與引物退火，并發生延伸反應，而無需完全分離鏈。
感興趣的核酸可以包括一種或更多組成成分，使得可以從未摻入的試劑和/或引物中親和分離出感興趣的核酸。例如，感興趣的核酸可以含有生物素，使得可以通過使生物素結合于抗生物素蛋白或其類似物(附著于固相載體)，從未摻入的試劑和/或引物中親和分離出感興趣的核酸。感興趣的核酸序列可包括的DNA或RNA序列，可通過與存在于核酸中的互補序列配對的堿基(附著于固相載體)，從未摻入的試劑和/或引物中親和分離出感興趣的核酸。感興趣的核酸可標記有可檢測的標記物；該可檢測標記物可不同于試劑中存在的或附著于引物的任何可檢測標記物。
這里的“正常核苷酸”或“正常堿基”是試圖在該堿基位點鑒定突變的野生型或以前已知的標準核苷酸堿基。“標準核苷酸堿基”包括任何已知的堿基，可以是野生型或已知的突變型堿基(只要該堿基是已知的并希望了解其變體)。所以作為例子，正常堿基可以是已知的野生型堿基，而想在該位點尋找突變。相反，已知的堿基可以是已知的突變體，則在該位點尋找野生型堿基的存在。另外，已知的正常堿基可以是已知的突變體，而對其尋找另一個突變體變異堿基。所以，本發明的方法可應用于用于確定該位點是否存在任何其它堿基變體的任何已知的序列。
這里的術語“引物”或“寡核苷酸引物”指一種寡核苷酸，當處于存在各種因子如核苷酸和酶(如DNA聚合酶)以及適合的溫度和pH允許合成與核酸(模板)鏈互補的引物延伸產物的條件下，其具有作為合成起始點的能力。
術語“引物”也可定義為從任何來源得到的任何核酸片段。例如，引物可以通過破碎較大的核酸片段(如基因組DNA、cDNA、或從PCR得到的DNA)產生。也就是說，引物的特性不受如何得到該引物的限制，無論其是破碎天然或合成核酸或由合成核酸引物得到的。另外，引物可以是寡脫氧核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸共聚物、寡核糖核苷酸、核糖核苷酸共聚物、或脫氧核苷酸和核糖核苷酸共聚物。引物可以是天然或合成的。寡核苷酸引物可以是體內酶促合成的、體外酶促合成的、或體外非酶促合成的。引物可標記有可檢測的標記物；該可檢測的標記物可不同于試劑中存在的或附著于感興趣的核酸的任何可檢測標記物。另外，引物的序列必須相應于感興趣的特定位置的側翼序列，該位置毗鄰被鑒定的核苷酸堿基或為其上游。
另外，引物必須具有與感興趣的核酸中的核苷酸雜交或退火的能力。一種實現所希望的雜交的途徑是，讓模板依賴性引物實際上或完全互補于已知的堿基序列。
寡核苷酸引物可包括一種或多種成分，將引物連接于固相載體，使得可以從未摻入的試劑和/或感興趣的核酸中親和分離出引物。這些親和成分包括，但不限制于，毛地黃皂苷、磁珠、和配體，如蛋白配體(包括抗體)。較佳的成分是生物素。在用生物素的實驗中，含有生物素的引物通過生物素結合于鏈霉抗生物素蛋白(附著于固相載體)，可從未摻入的試劑和/或感興趣的核酸中親和分離出引物。寡核苷酸引物序列可包括的DNA序列，通過與核酸中互補序列配對的堿基(附著于固相載體)，能從未摻入試劑和/或感興趣的核酸中親和分離出引物。
這里所用的術語“引物延伸反應”指的是在反應條件下可進行模板依賴性核酸合成反應。部分地通過適當的模板依賴性酶的存在，可創造發生模板依賴性引物延伸反應的條件。一些適合的模板依賴性酶是DNA聚合酶。DNA聚合酶可以有許多類型。但DNA聚合酶必須是引物和模板依賴性的。例如可以用大腸桿菌DNA聚合酶I或大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶(“測序酶”)、水生棲熱菌DNA聚合酶、或逆轉錄病毒的逆轉錄酶。同樣在一些方案中可用RNA聚合酶，如T3或T7 RNA聚合酶。在雜交和延伸反應中，不同的聚合酶必須用不同的條件和不同的溫度范圍。
這里所用的術語“引物延伸鏈”包括，在引物被加入后，形成的與雙鏈體中模板相反的鏈。較佳的是，通過終止子摻入引物延伸鏈終止引物延伸。
這里所用的術語“模板”指的核酸，包括雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA，或任何它們的修飾，而且可以是任何長度或序列。
這里所用的術語“終止子”或“鏈終止子”指核酸堿基，如A、G、C、T、或U，或類似物，它在摻入與模板鏈相反的引物延伸鏈時能有效地終止引物延伸反應。較佳的終止子是雙脫氧核苷酸。同樣較佳的是，終止子或者無標記物或者有標記物，但應區別于非終止子的標記物。當這里所用的術語“終止子”或“鏈終止子”為單數時，并不意味所用的是單個核苷酸分子。術語“終止子”的單數形式是指用于分析的核苷酸、核酸堿基或核酸類似物的類型。例如，如果終止子是ddA，則單數形式指所有ddA整體，而不是ddA單分子。另外，“終止子”可以是特定類型核苷酸的缺乏，這樣可以通過基因座上缺少特定核苷酸而終止引物的延伸。例如，如果希望引物延伸反應終止于模板鏈上“C”的對面，則在引物延伸反應混合物中應包括非終止堿基A、T和C，但不能有“G”(與“C”互補)。所以，缺乏互補堿基將終止引物延伸反應，其效果與加入雙脫氧終止子核苷酸的效果一樣。
這里所用的術語“非終止子”或“非鏈終止子”包括的核苷酸堿基，在摻入引物延伸鏈時不終止引物延伸反應。較佳的是，在引物延伸反應中至少標記一種非終止子。如這里所用，當術語“非終止子”或“非鏈終止子”為單數時，并不意味所用的是單個核苷酸分子。術語“非終止子”的單數形式是指用于分析的核苷酸、核酸堿基或核酸類似物的類型。例如，如果終止子是G，則單數形式是指所有的G的整體，而不是指單分子G。
這里所用的術語“突變體”或“突變”指模板鏈上任何不同于野生型或正常堿基的堿基。用本發明方法檢測的突變可以是任何類型的突變，包括單堿基突變、插入、缺失、或基因易位，只要與緊靠退火的引物3’位的堿基直接相對的模板上的堿基受到影響。
這里所用的術語“標記物”指任何連接于終止子或非終止子核苷酸來提供檢測信號的分子。標記物可以是放射性的、化學發光的，蛋白配體如抗體，或者如果用熒光基團時，每一類型的非終止子核苷酸堿基可用不同的熒光基團。這些熒光標記物的發射光譜應可分辨。
另外，確定在引物延伸產物中摻入核苷酸堿基的水平的方法，可用質譜技術測定，在美國專利No.5,885,775中已列舉，這里引用作為參考。
這里所用的短語“高度嚴謹的雜交條件”指核酸雜交條件如，但不限制于，42℃用0.1XSSC洗滌條件。在常規分子生物學手冊中一般可找到雜交條件，如Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology，Greene和Wiley，pub.(1994)，這里引用作為參考。
這里所用的“薄層層析(TLC)”可在以纖維素產品為基礎的紙介質上進行，但可由能讓分子很好分散并形成均勻一層的任何物質組成。該物質包括，但并不限制于，無機物如硅膠、氧化鋁、硅藻土或硅酸鎂。有機物包括，但并不限制于，纖維素、聚酰胺或聚乙烯粉末。薄層層析方法一般描述于化學手冊，如闡述于Freifelder，Physical Biochemistry-Applications to Biochemistry and Molecular Biology，second ed.，由Freeman和Co.出版(1982)，這里引用作為參考，特別是第8章在229-232頁討論了層析技術尤其是薄層層析。
對感興趣的核酸鑒定和/或定量方法的一種改變是，在合適的變性條件下進行延伸反應后，分離出來自感興趣核酸的引物延伸鏈。這種變性條件可以包括加熱、堿性條件、甲酰胺、尿素、乙二醛、酶和它們的組合。這種變性條件還可包括用2.0N NaOH處理。
本領域技術人員將理解，終止子可標記有不同于非終止子的標記物，用于辨別引物延伸鏈中終止子或非終止子的摻入。本發明申請中為簡化說明，終止子示例為缺少特定類型的核苷酸，但該說明對權項無任何形式的限制。本發明還包括不同標記的或未標記的終止子，只要終止子上的標記物不同于非終止子上的標記物。
本領域技術人員同樣可以理解，只要模板序列至少有部分已知就可設計一種引物，該引物能結合于模板鏈而發生引物在模板鏈上的結合。本領域的技術人員還可理解，本發明的方法可通過用一支或更多支分析試管中的若干引物實踐。
本發明方法的一個特性為，如果幾種非終止子同樣被標記的話，就可產生強信號，因為幾種標記的非終止子摻入引物延伸鏈將產生有加和作用的信號。當各種終止子或非終止子有特異的不同標記物時，觀察其信號可提高精確度。
本發明的另一目的是提供一種試劑盒和試劑，用于如所需要的定量或非定量地、迅速且精確地確定樣品中是否存在靶核酸。可將試劑盒的各成分各自裝在適合的容器中。各容器也可以識別其內含物的形式貼上標簽。另外，可將各包裝好的成分置于一較大的能儲存所有需要成分的容器中。且試劑盒附帶有說明如何使用此試劑盒的說明書。這種說明書可以印在試劑盒上或附在其中。
以下實施例用于說明本發明，但對權項無任何限制。
實施例用RNAzol B(Tels-tel，TX)方法從大鼠腦提取全RNA。用O.D.260nm吸光度測定全RNA的濃度。用無RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水稀釋全RNA。將5μl各種含量的RNA稀釋液(如表2所示)置于各管中，然后與1μl合成的寡核苷酸引物5’-GTGGGAACCGTGTCA-3’(SEQ ID NO1)混合，此序列是與大鼠腦特異性cDNA配對的序列(未發表資料)。70℃加熱此RNA-引物混合物3分鐘，在冰上培育3分鐘。將這些管迅速旋動后，加入14μl含終濃度為20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)、15單位的RNA酶抑制劑、0.5mM dATP、dGTP、1μl dCTPα32P和100單位MMVL-逆轉錄酶的反應混合物，開始引物延伸反應。在37℃下反應進行20分鐘，100℃加熱反應管2分鐘終止反應。將1μl反應混合物作薄層層析(TRIM USA，Maryland)分出游離的dCTPα32P。然后用閃爍計數器(Beckman LS 5000)測定標記引物的放射性。表2顯示了結果。
上述所有步驟包括化學、操作和流程是自動化的或是能夠自動化的。因此，將本發明優選模式納入適當編程的機器人工作區的操作，將顯著節省成本并將增加任何診斷手續(依賴于檢測得自生物樣品的核酸中特定核苷酸序列或序列差異的手續)的效率。
這里引用的所有參考文獻都全部引證包括在說明書中。
表1MPE方法與Northern分析和RNA酶保護分析的比較
表2
序列表<110>王小兵森澤 紳勝<120>用于特異性核酸檢測和定量的同組異序引物延伸方法及其試劑盒<130>900315<140><141><150>US 60/209,987<151>2000-06-08<150>US<151>2001-05-23<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>1gtgggaaccg tgtca 15<210>2<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>2tgatcagcag gctgaaatcg tcgtggattg caacgacgcc gacgattctc gtcctttaag 60gcgatagcat 70<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>3tcgtcggcgt cgttgc16<210>4<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>4aaaggacgag aa12<210>5<211>70<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>5ugaucagcag gcugaaaucg ucguggauug caacgacgcc gacgauucuc guccuuuaag 60gcgauagcau70<210>6<211>8<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>6gcctgctg 8<210>7<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>7ccacgacga 9<210>8<211>8<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>8ttaaagga 8<210>9<211>5<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>9gattt 權利要求
1.一種檢測或定量樣品中靶核酸的方法，其特征在于，包括(a)制備一種或多種引物，該引物特異性配對于靶核酸的預定位置；(b)在高度嚴謹的條件下，將(a)中的一種或多種引物與靶核酸退火，在靶核酸預定位置上得到引物-核酸雙鏈體；(c)使(b)的引物-核酸雙鏈體與以下混合物混合，該混合物包括(1)一種或兩種或三種類型的游離的非終止子核苷酸和至少一種類型的的任選地標記有可檢測的標記物的非終止子核苷酸，和(2)有或無一種類型與(1)的一種或兩種或三種類型非終止子核苷酸不同的終止子核苷酸；(d)在合適的緩沖液中用酶或化學反應進行引物延伸反應；和(e)檢測或定量引物延伸的核苷酸中標記信號的量，或(f)用質譜檢測或定量延伸的引物的量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物是核酸引物、寡脫氧核苷酸、寡核糖核苷酸、或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感興趣的核酸是脫氧核糖核酸、核糖核酸、或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非終止子核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的終止子是雙脫氧核糖核苷酸。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非終止子和終止子核苷酸混合液的組合是(a)dATP、dCTP、dGTP、ddTTP或ddUTP，(b)dATP、dCTP、dTTP或dUTP、ddGTP，(c)dATP、dGTP、dTTP或dUTP、ddCTP，(d)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP、ddATP，(e)dATP、dCTP、dGTP(f)dATP、dCTP、dTTP或dUTP，(g)dATP、dGTP、dTTP或dUTP或(h)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的至少一種非終止子核苷酸標記有可檢測的標記物。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的終止子核苷酸標記有或未標記與非終止子核苷酸的標記物不同的可檢測標記物。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標記物包括酶或蛋白質部分、放射性同位素、熒光部分或化學基團。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非終止子和終止子核苷酸是不帶標記物的，通過質譜分析延伸的引物量進行檢測或定量步驟。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶是模板依賴性的。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的模板依賴性酶是DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的模板依賴性酶是大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、噬熱菌DNA聚合酶、逆轉錄病毒逆轉錄酶、或它們的組合。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是在體內、體外酶促合成的或非酶促合成的。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是由聚合酶鏈式反應合成的。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸含有非天然核苷酸類似物。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述的非天然核苷酸類似物包括脫氧肌苷或7-脫氮-2’-脫氧鳥苷。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸包括生物體的基因組DNA、它的RNA轉錄物、或由生物體RNA轉錄物制備的cDNA。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物體是植物、微生物、細菌、病毒。
20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物體是脊椎動物或無脊椎動物。
21.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物體是哺乳動物。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物體是人。
23.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增步驟是在靶核酸上進行的。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述的擴增步驟包括克隆、轉錄、聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應、鏈置換擴增、或環介導的等溫擴增。
25.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物包括一種或多種成分，從而可以從未摻入的試劑和/或感興趣的核酸中親和分離出引物。
26.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物包括一種或多種成分，使引物固定到固相載體上產生固定的引物序列。
27.如權利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述的成分包括特定的化學基團，如生物素或毛地黃皂苷。
28.如權利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述的組成成分包括DNA或RNA序列，可通過堿基配對于固相載體存在的互補序列，將引物連接到固相載體。
29.如權利要求1所述的方法，其特征在于，直接在固相載體上合成引物，產生固定的引物序列。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述的合成是用酶促或化學或物理方法進行的。
31.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述的引物固定在固相載體上，產生固定的靶核酸序列。
32.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物是可逆地固定到固相載體上的。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述的引物可用化學、酶促或物理方法從固相載體上切割下。
34.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸固定在固相載體上，產生固定的靶核酸序列。
35.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是可逆地固定到固相載體上的。
36.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸可用化學、酶促或物理方法從固相載體上切割下。
37.如權利要求31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固定是通過光可切割的鍵實現的。
38.如權利要求26、29、31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固相載體包括小珠、平面、芯片、毛細管、針頭、梳或干糊片。
39.如權利要求31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固定是通過互補的捕捉核酸分子與核酸分子的部分之間雜交完成的，其中捕捉的核酸預先固定在固相載體上，且核酸分子的部分與靶核酸序列不同。
40.如權利要求31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固定是通過固相載體和核酸分子的部分之間直接結合完成的，且所述的核酸分子的部分與靶核酸序列不同。
全文摘要
本發明公開了一種用同組異序引物延伸法檢測和/或定量樣品中存在的靶DNA或RNA的方法。本方法包括于不存在某一游離核苷酸時進行引物延伸反應,從而當不存在的該核苷酸要被插入時,引物延伸反應被終止。所以,檢測引物延伸產物中標記的核苷酸摻入的量,就可確定樣品中靶RNA或DNA的量。
文檔編號C12Q1/68GK1333465SQ0112111
公開日2002年1月30日 申請日期2001年6月8日 優先權日2000年6月8日
發明者王小兵 申請人:王小兵, 森澤紳勝