專利名稱：轉基因大豆gts40-3-2核酸定量檢測的質粒標準分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術領域的質粒分子，具體來說，涉及一種轉因大豆 GTS40-3-2定量檢測用質粒標準分子及其構建與定量方法。
背景技術：
轉基因生物技術被稱為是“應用最為迅速的生物技術”，隨著生物技術的不斷發展，越來越多的轉基因植物應用于農業領域，促進農業生產，幫助農民增收，為解決全球人口增長所帶來的糧食問題開辟了新的途徑。所謂轉基因植物(Genetically modified organism, GM0)是指利用生物技術，將從不同生物中分離或人工合成的基因在體外進行重組，然后導入受體植物細胞，使新的基因在受體細胞內整合、表達、其再生植株能通過無性或有性增殖過程，將外源基因遺傳給后代，由此獲得的遺傳修飾植物類型稱為轉基因植物。 以轉基因植物直接為食品或為原料加工生產的食品稱為轉基因食品。轉基因技術將基因在不同物種之間轉移，改造生物的遺傳物質，使其在性狀、營養品質、消費品質等方面向人類所需要的目標轉變，滿足人類的各種需求，例如提高產量、表達特殊營養成分甚至獲得抗除草劑抗病毒或抗蟲害的能力。例如轉基因大豆是全世界種植面積最大的轉基因作物，轉基因大豆主要是導入了抗草甘膦基因EPSPS基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)該基因編碼磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶，使大豆能夠耐受除草劑草甘膦的傷害，大大方便大豆農業生產和管理。但是隨著轉基因作物在全世界范圍內的廣泛種植，其食用安全和環境安全問題也引起了廣大消費者和各國政府及相關機構人員的重視。轉基因作物在實驗室內產生，是大跨度、跳躍式的轉移基因，不同于漫長的自然選擇和相近物種的雜交。在理論上，轉基因作物的產生是人為的加快了某些物種的生物進化速度。這些物種沒有經過長期的自然選擇的過程，其本身的安全性未知，并且對已有生物的多樣性會產生影響。因此很多國家和地區紛紛制定轉基因生物安全管理法規，實施標簽制度，并積極發展轉基因作物檢測監測技術。應用于轉基因檢測方法主要有兩種核酸檢測、蛋白質檢測。其中核酸檢測方法由于檢測靈敏度高、適用范圍廣、操作簡便等原因已經成為轉基因植物及其產品的主要檢測方法。另外核酸由于在生物細胞中含量相對穩定，在產品加工中也相對不容易被破壞，因此常用作轉基因植物及其產品的檢測目標。熒光定量聚合酶鏈式反應(real-timeFluorescent Quantitative PCR, FQ-PCR) 方法是聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術的一種，是公認的目前核酸檢測的最常用定量檢測方法。聚合酶鏈式反應又稱體外基因擴增技術，是一項在短時間內體外大量擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。近年來出現的核酸定量PCR技術，尤其是實時熒光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技術，實現了 PCR由定性到定量的飛躍。實時熒光定量PCR技術在PCR反應體系中加入能特異標記 PCR產物的熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。實時熒光定量PCR技術是在PCR定性技術基礎上發展起來的一種核酸定量和分析技術，該技術融會了 PCR的高靈敏性、DNA雜交技術的高特異性和光譜技術的高精確定量優點，且操作簡便、污染少，已成為分子生物學等許多研究及應用科學中的重要工具。在實際檢測中，標準物質十分重要。目前，國內用于轉基因生物檢測的標準物質還很少，目前只有一種轉基因大豆粉末標準物質。國際領先的生物計量單位或者實驗室已經開始進行轉基因定量PCR檢測用標準物質的研制，例如位于比利時的歐盟聯合研究中心下屬的標準物質與測量研究所(IRMM)，已經配制并提供涉及14種轉基因作物的有證標準物質(CRMs)系列標準品60多種，這些標準品已經在市場上銷售，但國際有證標準物質的價格居高不下，不能滿足日益增多的轉基因檢測的需求。并且，現有的這些標準物質多是原始農產品植物材料的植株或者種子等組織器官的干燥粉末，在使用中還需要從中提取DNA，制備、貯存和測定過程因素影響眾多，很難維持恒定的量，很難保證測量的穩定性，溯源性差。相比之下，質粒分子標準物質在很多方面具有明顯優勢，質粒分子是指一種含有轉基因檢測目的外源基因和內標準基因的特異性片段的線性化重組質粒分子。經驗證質粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準陽性物質替代物。質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供無限穩定量的標準物質，并且純度較高； 且操作容易，穩定性高，同一個質粒分子可以同時包含多個外源目的基因，經濟又高效。但目前質粒分子標準物質的研制還不完善，很多檢測實驗室使用的陽性標準樣品缺乏嚴格的溯源性考察，因此檢測結果一致性、互通性和可靠性不能保證，給檢測中的定量帶來了較大的不確定性，制約了我國轉基因產品檢測工作的量值溯源發展。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的轉基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR檢測中陽性品缺乏和陽性標準品配置的難題，提供一種轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子。本發明人通過對轉基因大豆品系GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，設計引物PCR擴增獲得其結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段；通過分子克隆的方法構建到一個質粒分子中而成人工重組質粒分子PXL02 ；用電感耦合等離子體發射質譜(ICP-MQ的方法檢測質粒標準分子的含磷量，從而換算出質粒標準分子的濃度。本發明中構建的質粒標準分子完全可以替代轉基因大豆品系GTS40-3-2陽性標準品，該質粒標準分子完全適用于對轉基因大豆品系GTS40-3-2樣品的結構特異性、品系特異性定量PCR分析和檢測，徹底解決轉基因大豆品系GTS40-3-2檢測中標準物質缺乏的難題，并保證了質粒標準分子的溯源性。本發明解決上述技術問題的技術方案之一是一種轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子，含有轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。本發明中，所述的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列，是指轉基因大豆 GTS40-3-2基因組中外源插入片段的一段序列，這段序列可作為轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列，較佳的如其基因組中的CTP4序列以及CTP4序列兩側的序列所組成的核苷酸片段，其優選的形式可以是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分CP4EPSPS序列。其中，所述的“部分”是50-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉基因大豆GTS40-3-2 的結構特異性序列。其更優選的形式是109bp長的35S啟動子序列、CTP4序列(共長216bp) 及36^p的CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段。所述的轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，是指轉基因大豆GTS40_3_2基因組中的一段序列，這段序列可作為轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，較佳的如其基因組中含有的外源插入載體序列以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的片段。所述轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列優選的形式可以是部分外源插入載體序列和與該外源插入載體相鄰接的部分大豆基因組序列所組成的核苷酸片段。其中，所述的“部分”是50-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉基因大豆GTS40-3-2 的品系特異性序列。所述轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列更優選的形式是包括 192bp的載體序列和127bp與該載體序列相鄰接的大豆基因組序列。本發明中，所述的大豆內標準基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點。本發明中所述的大豆內標準基因Lectin的特異性片段，是指大豆凝集素基因中具有大豆凝集素基因特異性的片段。在大豆凝集素基因中，全長基因的l(^9bp 1579bp的片段是具有特異性的。本發明所述的大豆內標準基因Lectin的特異性片段優選的就是選自Lectin全長基因的第10 位至第1579位的連續的50-550bp的核苷酸片段，最優的就是Lectin全長基因的第10 位至第1579位的片段。本發明的技術方案之二是一種所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子的制備方法，包括以下步驟①利用引物通過PCR特異性擴增轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段；②分別依次將PCR擴增得到的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段克隆至克隆質粒載體上，得到質粒標準分子PXL02。本發明中，所述的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分CP4EPSPS序列；所述的轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列是轉基因大豆GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組相鄰接的序列；所述的大豆內標準基因 Lectin是大豆凝集素基因。本發明中，所述的PCR引物是長度為的寡核苷酸鏈，其與轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列或者大豆內標準基因Lectin的特異性片段完全相同或互補。本發明中，所述的特異性擴增是利用設計的PCR引物特異性擴增轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。本發明中，所述的克隆是將上述PCR擴增得到的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段按照設計的限制性內切酶酶切位點依次連接到質粒載體上，獲得標準質粒分子PXL02。本發明中，所述的質粒載體可以是任何常規載體，較佳的是克隆載體，更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，如pUC19、pUC18，，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptII SK或pGEM系列載體。本發明的技術方案之三是一種所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子的定量方法，包括以下步驟①提取質粒標準分子pXL02 ；②根據步驟①所得的質粒標準分子PXL02的堿基組成和序列長度，計算質粒標準分子pXL02分子中的磷元素的含量；③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出電感耦合等離子體發射質譜 (ICP-MS)的標準曲線。④ICP-MS檢測質粒標準分子PXL02溶液，并根據步驟③所得的標準曲線得出質粒標準分子PXL02溶液的磷含量。⑤根據步驟④所得的質粒標準分子pXL02溶液的磷含量和步驟②所得的質粒標準分子PXL02分子中的磷元素的含量，計算出質粒標準分子PXL02的濃度。本發明中，電感耦合等離子體發射質譜檢測的參數優選RF power為1100W，霧化氣流量為1. 08L/min，輔助氣流量為1. 2L/min，等電子體氣流量為16L/min。本發明的技術方案之四是一種轉基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR檢測方法， 所采用的標準物質是所述的質粒標準分子。本發明的有益效果在于，利用PCR擴增和分子克隆的方法構建了含有轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段的質粒標準分子，并利用電感耦合等離子體發射質譜(ICP-MQ對其進行定量，保證了其良好的溯源性。本發明的質粒標準分子可以替代轉因大豆GTS40-3-2的陽性標準物質，用于轉基因大豆GTS40-3-2結構特異性、品系特異性的定量PCR檢測。


圖1是本發明一質粒標準分子pXL02的構建流程圖。圖2是本發明一質粒標準分子PXL02的圖譜。
具體實施例方式本發明提供了一種轉基因大豆GTS40-3-2核酸定量檢測用的質粒標準分子及其構建與定量方法。本質粒標準分子可以替代轉因大豆GTS40-3-2陽性標準物質，用于轉基因大豆GTS40-3-2結構特異性、品系特異性的定量PCR檢測。本發明通過對轉基因大豆GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，設計PCR引物， 經PCR擴增獲得其結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段；通過分子克隆的方法將其構建到一個質粒中，從而形成人工重組質粒分子PXL02 ；用電感耦合等離子體發射質譜(ICP-MQ的方法檢測質粒陽性標準分子的含磷量，從而換算出質粒陽性標準分子的濃度。本發明構建的質粒標準分子完全可以替代轉基因大豆GTS40-3-2陽性標準物質， 本質粒標準分子完全適用于對轉基因大豆GTS40-3-2樣品的結構特異性、品系特異性定量 PCR分析和檢測，徹底解決轉基因大豆GTS40-3-2檢測中陽性標準物質缺乏的難題，并保證了質粒標準分子的溯源性。
核酸定量PCR檢測大豆GTS-40-3-2的原理采用實時熒光PCR技術和可特異性擴增轉基因大豆GTS-40-3-2中結構基因或品系特異性基因以及大豆Lectin基因的引物和兩端標記熒光的探針，分別擴增測試樣品 DNA，并實時監測PCR產物。與此同時，用相同的引物、探針和條件擴增已知濃度的陽性標準物質(或陽性標準分子)，以獲得穩定的標準曲線。根據外源基因(結構特異性基因或品系性特異基因)和內源基因的標準曲線可分別計算出樣品中對應基因的絕對含量(拷貝數或濃度)，并由絕對含量計算計算轉基因大豆GTS-40-3-2在測試樣品中的相對含量。如采用陽性標準分子時計算相對含量應使用轉換系數。標準物質標準物質是具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準設備，評價測量方法或給材料賦值的材料或物質。轉基因植物檢測標準物質包括標準陽性物質和質粒標準分子。標準陽性物質是一類用原始植物材料制成的標準物質，是純合的轉基因植物材料，在PCR檢測過程中用作陽性對照和配置定量檢測的標準品，用于對GMO混合水平進行量化和分析。在轉基因定量PCR檢測過程中，陽性標準品是必須的，因此陽性標準品的配置要求非常嚴格，必須經過多個實驗室的實驗驗證方可應用于轉基因定量PCR檢測。這類來源于農產品的標準物質，其制備、貯存和測定過程受很多因子影響，很難維持恒定的量，而且并非所有的作物轉基因品系都存在標準陽性物質。質粒標準分子質粒標準分子是指一種含有轉基因檢測目的外源基因和內標準基因的特異性片段的線性化重組質粒分子。經驗證質粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準陽性物質替代物。質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供無限穩定量的標準物質，并且純度較高；且操作容易，穩定性高，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，經濟又高效。甚至有學者將質粒標準分子稱為“金標準物質”。在轉基因定量PCR檢測過程中，標準分子根據分子量大小與植物基因組DNA分子換算，從而完成對轉基因樣品的定量分析。標準分子可以應用到轉基因PCR檢測，尤其是定量PCR檢測中。本發明的質粒標準分子，含有轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。本發明中，所述的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列，是指轉基因大豆 GTS40-3-2基因組中外源插入片段的一段序列，這段序列可作為轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列，較佳的如其基因組中的CTP4序列以及CTP4序列兩側的序列所組成的核苷酸片段，其優選的形式可以是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分CP4 EPSPS序列。其中，所述的“部分”是50-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉基因大豆GTS40-3-2 的結構特異性序列。其更優選的形式是109bp長的35S啟動子序列、CTP4序列(共長216bp) 及365bp的CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段。所述的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列較佳的如SEQ ID NO. 1所示，其中第1位到109位為部分35S啟動子序列，第110 位到3 位為CTP4序列，第327到691位為部分CP4 EPSPS序列。本發明所述的轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，是指轉基因大豆GTS40-3-2基因組中的一段序列，這段序列可作為轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，較佳的如其基因組中含有的外源插入載體序列以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的片段。所述轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列優選的形式可以是部分外源插入載體序列和與該外源插入載體相鄰接的部分大豆基因組序列所組成的核苷酸片段。其中，所述的“部分”可以是20-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列。所述轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列更優選的形式是包括192bp的載體序列和127bp與該載體序列相鄰接的大豆基因組序列。優選的，所述的轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列如SEQ ID NO. 2所示，其中第1位到第192位是外源插入載體序列，其中第193位到第319位是相鄰接的大豆基因組序列。本發明中，所述的大豆內標準基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點。本發明中所述的大豆內標準基因Lectin的特異性片段，是指大豆凝集素基因中具有大豆凝集素基因特異性的片段。在大豆凝集素基因中，全長基因的第10 位 第1579位的片段是具有特異性的。本發明所述的大豆內標準基因Lectin的特異性片段優選的就是選自Lectin全長基因的第 1029位至第1579位的連續的50-550bp的核苷酸片段，最優的就是Lectin全長基因的第 1029位至第1579位的片段。優選的，所述的大豆內標準基因Lectin的特異性片段的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。本發明所述的質粒標準分子pXL02的序列較佳的如SEQ ID NO. 10所示，其中第 1336位到第20 位為結構特異性序列，第986位到第1305位為品系特異性序列，第413位到第963位為內標準基因Lectin的特異性片段。質粒標準分子構建方法本發明所述質粒標準分子pXL02構建方法，包括以下步驟①利用數據庫(比如Genbank、上海市轉基因生物安全性檢測評估共享服務平臺 http://www. shgmo. org/welcome. htm)進行生物信息學分析，獲得轉基因大豆GTS40-3-2 的結構特異性序列、品系特異性序列、大豆內標準基因Lectin序列。②設計PCR特異性引物；所述的PCR引物，指的是長度為的寡核苷酸鏈，其與轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列或者大豆內標準基因Lectin的特異性片段完全相同或互補。較佳的，擴增轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列的引物對中，一條引物的序列是 SEQ ID N0. 4，另一個是 SEQ ID N0. 5。擴增轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列的引物對中，一條引物的序列是 SEQ ID N0. 6，另一個是 SEQ ID N0. 7。擴增轉基因大豆GTS40-3-2的大豆內標準基因Lectin的特異性片段的引物對中， 一條引物的序列是SEQ ID N0. 8，另一個是SEQ ID N0. 9。③特異性擴增轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。所謂的特異性擴增，指的是利用設計的PCR引物特異性擴增轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。
④分別依次將PCR擴增得到的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段克隆至克隆質粒載體上，得到質粒標準分子pXL02 ；所述的克隆，指的是將上述PCR擴增得到的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段按照設計的限制性內切酶酶切位點依次連接到質粒載體上，獲得標準質粒分子PXL02。所述的質粒載體可以是任何常規載體，較佳的是克隆載體，更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，如 pUC19、pUC18，，pUC118，pUC119, pUC19, pBlueScript II SK 或 pGEM系列載體。⑤測序驗證質粒標準分子pXL02的序列。⑥質粒標準分子pXL02的定量PCR檢測方法驗證。所述的定量PCR檢測方法驗證，是指檢測質粒標準分子PXL02在進行定量PCR分析時的特異性、靈敏度、重復性和重演性等特性，以鑒定該質粒標準分子替代轉基因大豆 GTS40-3-2陽性標準物質的能力，以及實際應用于定量PCR檢測轉基因大豆GTS40-3-2的測定有效性。質粒標準分子的定量方法本發明所述質粒標準分子pXL02的定量方法，包括以下步驟①提取質粒標準分子pXL02 ；②根據質粒標準分子PXL02的堿基組成和序列長度，計算質粒標準分子PXL02的磷元素的含量；③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出ICP-MS的標準曲線。④ICP-MS檢測質粒標準分子PXL02，并根據標準曲線得出質粒標準分子pXL02的
磷含量。⑤據質粒標準分子pXL02的磷含量計算出質粒標準分子PXL02的濃度。下面對本發明的實施方式作詳細說明。本實施例在本發明技術方案的前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方未能，通常按照常規條件操作，如可參照Sambrook等編著分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度， 一般為25 °C。實施例1質粒標準分子的構建一、實驗試劑限制性內切酶Kpnl、Hindlll、XbaI,以及限制性內切酶對應緩沖液購自上海皓嘉科技發展有限公司。pUC19 載體、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、dNTP、DL2000 Marker購自上海皓嘉科技發展有限公司；DNA引物由上海生工生物技術有限公司合成。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。二、實驗儀器
DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學儀器有限公司)PTC-100 型 PCR 擴增儀(MJ Research Inc.)DNA電泳分析系統，包括暗箱、數碼照相機、計算機、掃描儀、噴墨打印機、光敏打印機、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖像分析軟件(上海天能公司)其它儀器包括離心機、恒溫水浴鍋、培養箱、天平等。三、實驗方法和過程1、在GenBank中搜索大豆內標準基因Lectin ；在上海市轉基因生物安全性檢測評估共享服務平臺(http://www.shgmo.org/welcome.htm)上查詢獲得轉基因大豆 GTS40-3-2的外源插入載體在轉基因作物中的具體插入方式和拷貝數，并查閱外源插入載體中主要元件的序列信息。2、構建質粒標準分子pXL02的PCR引物序列設計構建質粒標準分子pXL02的示意圖見圖1。根據獲得的轉基因大豆GTS40-3-2外源插入序列信息，利用軟件I^rimer 5.0設計兩對PCR引物。一對引物用于擴增轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性基因，一條引物位于35S啟動子序列上，一條位于CP4 EPSPS基因序列上；另一對引物用于擴增轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性基因，一條引物位于大豆基因組上，另一條位于轉基因大豆GTS40-3-2的外源插入載體上。另外設計一對引物用于擴增大豆內標準基因Lectin特異性序列。各引物的兩端加上分子克隆所需的酶切位點及保護堿基。在引物設計過程中，力求使構建的質粒適用于更多的轉基因大豆GTS40-3-2的檢測，質粒中包含的序列既可適用于結構特異性序列擴增，也可適用于品系特異性序列擴增， 同時要兼顧檢測結果的特異性。具體的引物序列見表1。 表1.構建質粒標準分子pXL02的PCR引物序列
目標序列引物引物序列(5’ 3、)擴增片段大小(bp)結構特異性序列正向CCCAAGCTTGATGACGCACAATCCCACTATCC709反向CCCAAGCTTGTCGCCGATGAAGGTGCTGTC品系特異性序列正向TGCTCTAGAGATCGGAGTTTCTCCTCCTGC337反向TGCTCTAGACAATTGCGTGGTGAACTTTCTGLectin正向CGGGGTACCTTGGTACTGGTGCTACTGACC570反向CGGGGTACCGGTGGAGGCATCATAGGTAA3、轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因序列的擴增根據表1的引物，以轉基因大豆GTS40-3-2基因組DNA為模板，對其結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因序列進行PCR擴增(反應體系和條件見表2、3)，得到 709bp的結構特異性序列、337bp的品系特異性序列和570bp的大豆內標準Lectin基因序列。對擴增產物進行回收純化。表2.構建質粒標準分子PXL02的PCR擴增體系
反應試劑用量(UL)IOXbuffer2dNTP(2. 5mM)1上游引物(IOnM)1下游引物(IOnM)1Taq酶(2. 5單位/反應)1DNA模板1續20補足至20 μ L 表3.構建質粒標準分子PXL02的PCR擴增條件
循環數溫度(°c)時間1955分鐘309535秒5735秒7240秒1725分鐘4、將PCR產物克隆至質粒載體PUC19上分別用限制性內切酶HindIII消化擴增得到的結構特異性序列與載體pUC19，回收酶切后的結構特異性序列及線性質粒PUC19，T4連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，得到中間質粒分子pUC19_l。分別用限制性內切酶^CbaI消化擴增得到的品系特異性序列與中間質粒分子pUC19_l，回收酶切后的品系特異性序列及線性中間質粒pUC19_l， T4連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5ci，得到中間質粒分子pUC19_2。用限制性內切酶KpnI消化擴增得到的Lectin基因特異性序列與中間質粒分子pUC19_2，回收酶切后的Lectin序列及線性中間質粒pUC19_2，T4連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，得到質粒標準分子pXL02，見圖2。酶切反應體系及連接體系見表4、5。表4.酶切反應體系
權利要求
1.一種轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子，其特征在于，含有轉基因大豆 GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。
2.如權利要求1所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子，其特征在于，所述的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列是部分35S啟動子序列、CTP4序列以及部分CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段；所述的轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列是轉基因大豆GTS40-3-2外源插入載體以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的核苷酸片段，所述的“部分”是50-500bp的長度；其特征在于，所述的大豆內標準基因 Lectin是大豆凝集素基因。
3.—種如權利要求1或2所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子的制備方法， 其特征在于，包括以下步驟①利用引物通過PCR特異性擴增轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段；②分別依次將PCR擴增得到的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段克隆至克隆載體上，得到質粒標準分子 pXL02。
4.如權利要求3所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子的制備方法，其特征是， 所述的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分 CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段；所述的轉基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列是轉基因大豆GTS40-3-2外源插入載體以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的核苷酸片段；所述的大豆內標準基因Lectin是大豆凝集素基因。
5.如權利要求3所述的轉基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質粒標準分子的制備方法， 其特征是，所述的特異性擴增是利用設計的PCR引物特異性擴增轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。
6.如權利要求3所述的轉基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質粒標準分子的制備方法， 其特征是，所述的克隆是將上述PCR擴增得到的轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、 品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段依次連接到質粒載體上，獲得標準質粒分子PXL02。
7.—種如權利要求1或2所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子的定量方法， 其特征在于，包括以下步驟①提取質粒標準分子PXL02；②根據步驟①所得的質粒標準分子PXL02的堿基組成和序列長度，計算質粒標準分子 PXL02分子中的磷元素的含量；③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出電感耦合等離子體發射質譜 (ICP-MS)的標準曲線。④ICP-MS檢測質粒標準分子PXL02溶液，并根據步驟③所得的標準曲線得出質粒標準分子PXL02溶液的磷含量。⑤根據步驟④所得的質粒標準分子PXL02溶液的磷含量和步驟②所得的質粒標準分子pXL02分子中的磷元素的含量，計算出質粒標準分子pXL02的濃度。
8.如權利要求7所述的所述的轉基因大豆GTS40-3-2的質粒標準分子的定量方法，其特征是，ICP-MS參數如下RF power為1100W，霧化氣流量為1. 08L/min，輔助氣流量為 1. 2L/min，等電子體氣流量為16L/min。
9.一種轉基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR檢測方法，其特征是，所采用的標準物質是如權利要求1或2所述的質粒標準分子。
10.如權利要求1或2所述的質粒標準分子在轉基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR 檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種適用于轉基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質粒標準分子，其含有轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段。通過對轉基因大豆GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，設計引物PCR擴增獲得其結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因Lectin的特異性片段；通過分子克隆的方法構建到一個質粒分子中形成人工重組質粒分子pXL02；用電感耦合等離子體發射質譜(ICP-MS)的方法檢測質粒標準分子的含磷量，從而換算出質粒標準分子的濃度。本發明中構建的質粒標準分子完全可以替代轉基因大豆GTS40-3-2陽性標準品，該質粒標準分子完全適用于對轉基因大豆GTS40-3-2樣品的結構特異性、品系特異性定量PCR分析和檢測。
文檔編號C12N15/66GK102517393SQ20111043921
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者丁敏, 任淑貞, 劉剛, 孫榮榮, 徐勤, 李蘭英, 許麗, 龔飛雁 申請人:上海市計量測試技術研究院