專利名稱：一種乙型肝炎病毒核酸快速提取試劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及生物樣品中乙型肝炎病毒核酸提取。
背景技術：
在臨床乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus, HBV)核酸定量檢測中，HBV DNA提取是首先進行的第一步操作。目前，國內外臨床應用的HBV核酸提取方法主要有:(I)堿裂解煮沸法，或同時先進行多聚糖濃縮沉淀HBV病毒，在沉淀中加入裂解液煮沸提取HBV DNA ；
[2]硅膠膜吸附柱法，采用硅膠膜層析柱吸附、清洗、洗脫獲得HBVDNA; (3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脫獲得HBV DNA。這三種方法都需要經過多步驟離心(或負壓抽吸、磁棒分離)、換管或移液操作才能獲得核酸，存在操作步驟繁多、過程中核酸容易丟失或污染的不足。

發明內容
本發明的目的是提供一種HBV核酸快速提取試劑，它采用一步法操作完成生物樣品血清、血漿中HBV DNA的快速釋放提取，獲得的核酸適用于熒光PCR等下游檢測，具有操作簡便、使用安全，成本低廉的優點，適合在臨床基因檢測中推廣應用。技術方案本發明提供一種HBV核酸快速提取試劑，它含有1-5% KCl (質量/體積比，w/v)、
0.01-0.5mg/ml 表面活性肽、0.1-2% Triton X-100 或 Tween 20 (質量 / 質粒比，v/v)、以及0.001-0.005%孔雀石綠(w/v)，所述質量或體積百分比以提取試劑體積為計算基準。本發明的HBV核酸快速提取試劑配制方法為:在滅菌去離子水中加入KCl終濃度達到1-5% (w/v)、加入表面活性肽終濃度達到0.01-0.5mg/ml、加入TritonX-1OO或Tween20終濃度達到0.1-2% (v/v)、加入孔雀石綠終濃度達到0.001-0.005% (w/v)。配制的試劑可在室溫保存。本發明的HBV核酸快速提取試劑使用方法為:取上述配制的核酸快速提取試劑，加入等體積待處理的生物樣品中，用移液器吹打5-10次混勻，HBV DNA即從病毒顆粒中提取釋放。所述的生物樣品為血清、血漿。提取試劑與樣品混合后液體由藍綠色轉為無色，可以作為模板直接加入PCR反應液進行擴增檢測。本發明的核酸快速提取試劑采用蛋白變性劑和防腐劑，能快速破壞HBV病毒顆粒外殼蛋白結構，釋放HBV DNA,提取試劑含有抑制核酸酶的組分且不對后續PCR實驗產生影響；提取試劑中加入樣品后顏色發生改變，避免引起是否加樣的混淆。采用本發明所述的HBV核酸快速提取試劑，和目前常用的方法比較，無需加熱、離心操作，只需要一支移液器即能在室溫條件下一步法完成生物樣品中HBV DNA的提取。獲得的核酸能廣泛應用于后續熒光PCR定量檢測、PCR-基因芯片雜交檢測等領域。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以通過技術常識對本發明作各種技術性改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發明中所涉及的主要試劑說明:KCl為分析純，Triton X-100和Tween 20等表面活性劑為生物級純度，孔雀石綠為化學純，上述試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，表面活性肽購自Sigma。實施方式中所用的Highpure Total Nucleic Acid Kit (娃膠膜法)購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；臺塑DNA/RNA萃取試劑(磁珠法)購自臺塑生醫科技股份有限公司；乙型肝炎病毒(HBV)核酸熒光定量PCR檢測試劑盒為上海克隆生物高技術有限公司產品。實施例1:和堿裂解煮沸法比較用于血清HBV DNA提取熒光PCR檢測(I)HBV核酸快速提取試劑配制按照發明內容，首先配制HBV核酸快速提取試劑:在滅菌去離子水中加入KCl終濃度達到2% (w/v)、加入表面活性肽濃度達到0.5mg/ml、加入Triton X-100或Tween 20濃度達到0.5% (v/v)、加入指示 劑孔雀石綠濃度達到0.001% (w/v)。(2) HBV陽性血清核酸提取對5例HBV陽性血清，采用發明內容中的提取方法處理:取3.5 μ I提取試劑加入0.2ml PCR擴增管，分別加入3.5μ I血清，用移液器反復吹打5_10次，操作所需時間為5min。同時，以乙型肝炎病毒(HBV)核酸熒光定量PCR檢測試劑盒中傳統的病毒沉淀-堿裂解煮沸提取HBV DNA方法為對照:各取50 μ I血清，分別加入50 μ I核酸提取液Α，振蕩混勻10秒種，13，OOOrpm離心10分鐘,棄上清；分別加入50 μ I核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10秒鐘，100°C沸水浴10分鐘，13，OOOrpm離心2分鐘，操作所需時間為30min。(3) HBV DNA熒光定量PCR檢測兩種方法提取的HBV DNA用HBV核酸熒光定量PCR試劑盒檢測，取試劑盒HBV PCR緩沖液ηΧ30μ l、MgCl2nX5y 1、HBV熒光探針ηΧ5μ l、Taq酶ηΧ3μ I混于一離心管中(η為待擴增的樣品數)，旋渦振蕩器上振蕩混勻10秒，低速離心數秒，按每管43 μ I分裝PCR反應液。對本發明核酸快速提取試劑提取獲得的HBV DNA，只要將PCR反應液加入上述含有提取試劑和血清混合液的擴增管中即可；對對照方法，則吸取7μ I模板加入43 μ I分裝的PCR反應液擴增管中。在ΑΒΙ7500熒光擴增儀上進行擴增檢測，程序為:50°C 2min、94°C 5min后按照93°C 30秒一60°C 90秒循環擴增40次。反應結束后用儀器軟件分析結果，兩種方法對5例血清HBV DNA定量結果如表1，可知兩種方法定量結果相近，但采用本發明提取試劑的方法操作更簡便、時間更短，具有優勢。表I和堿裂解煮沸法比較用于血清HBV DNA提取熒光PCR檢測結果
權利要求
1.本發明為一種用于血清、血漿樣品中乙型肝炎病毒(HBV)核酸快速提取的試劑，其特征在于，該提取試劑含有1-5% KCl(w/v)、0.01-0.5mg/ml表面活性肽、0.1-2% TritonX-100或Tween 20 (v/v)、以及0.001-0.005%孔雀石綠(w/v),所述質量或體積百分比以提取試劑體積為計算基準。
2.如權利要求1所述，其特征在于，使用時取該HBV核酸快速提取試劑，加入等體積HBV陽性血清或血漿，室溫條件下用移液器 吹打5-10次混勻，此時HBV DNA將釋放到混合液體中，可以在該液體中加入PCR緩沖液進行熒光PCR檢測。
全文摘要
本發明為一種用于血清、血漿樣品中乙型肝炎病毒(HBV)核酸快速提取的試劑，該提取試劑含有1-5％KCl(w/v)、0.01-0.5mg/ml表面活性肽、0.1-2％Triton X-100或Tween 20(v/v)、以及0.001-0.005％孔雀石綠(w/v)。使用時取所述核酸提取試劑，加入等體積HBV陽性血清或血漿，室溫條件下用移液器吹打5-10次混勻，此時HBV DNA釋放到混合液體中，可以在該液體中加入PCR緩沖液進行熒光PCR檢測。本發明提供的HBV核酸快速提取試劑操作簡便、使用安全，并且成本低廉。
文檔編號C12Q1/68GK103184214SQ20111044852
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者吳大治, 夏懿, 韓倩, 吳梅 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司