專利名稱：一種新的大蒜重金屬抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程和植物修復(fù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種對(duì)重金屬具抗性的基因即大蒜植物絡(luò)合素合酶基因，以及含有該基因的對(duì)重金屬具抗性的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步涉及在培育用于清除環(huán)境重金屬污染的工程植物，以及制備在食用部分低吸收重金屬的新型安全農(nóng)作物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前重金屬污染已經(jīng)危及全球生態(tài)環(huán)境以及人類健康。重金屬的危害首先表現(xiàn)為對(duì)植物正常代謝活動(dòng)的干擾，包括對(duì)細(xì)胞膜的損傷、對(duì)參與光合和呼吸代謝的大分子結(jié)構(gòu)的破壞、氧化脅迫、核酸分子的降解等。受重金屬污染的重要經(jīng)濟(jì)作物表現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量下降。其次，通過食物鏈或者重金屬污染的水源等途徑進(jìn)入人體內(nèi)的重金屬可以導(dǎo)致人類嚴(yán)重疾病，如日本的骨痛病便是因?yàn)殚L(zhǎng)期食用被重金屬污染的稻米和大豆所致。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)重金屬污染導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)和品質(zhì)不良進(jìn)而嚴(yán)重威脅人類健康的問題都非常重視，各國(guó)政府及科學(xué)家著力通過兩個(gè)途徑解決這一問題一為利用物理的、化學(xué)的方法試圖清除土壤或水體的重金屬污染，；二為利用現(xiàn)代生物技術(shù)清除污染，其中利用具有重金屬超富集特性的植物清除污染是一種正在興起的生物技術(shù)，稱為植物修復(fù)。然而野生的具有吸收重金屬能力的植物通常都生長(zhǎng)緩慢，生物量小，難以直接利用，使得植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展受到了很大限制。解決這一問題的根本途徑在于研究這類植物耐受重金屬的分子生物學(xué)機(jī)制，克隆這類植物中重金屬耐受的關(guān)鍵基因，通過基因工程手段獲得可直接用于植物修復(fù)的轉(zhuǎn)基因植物。但是目前從這些植物中克隆到的在重金屬排拒、螯合或區(qū)室化過程中起重要作用的基因還很少。
植物對(duì)重金屬的絡(luò)合作用和區(qū)域化作用是有關(guān)重金屬防御機(jī)制研究中資料最為豐富的。重金屬離子與專一性的高親和力配體結(jié)合后，會(huì)降低其在胞內(nèi)的自由離子濃度，從而減輕其對(duì)植物的毒性。同時(shí)，植物會(huì)進(jìn)一步將重金屬加以區(qū)域化隔離，如將其富集于液泡中，以避免細(xì)胞中具有重要生物學(xué)功能的大分子結(jié)構(gòu)受到金屬離子的傷害。目前研究最多的重金屬高親和力配體為植物絡(luò)合素(phytochelatin，PC)和金屬硫蛋白(metallothionin，MT)。
植物絡(luò)合素是一類富含巰基的多肽，可結(jié)合多種重金屬離子。80年代，Grill等人發(fā)現(xiàn)蛇根木Rauvolfia serpentina懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在200μM CdSO4脅迫下，產(chǎn)生結(jié)合重金屬離子的復(fù)合物。他們采用Edman降解和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)結(jié)合的方法，闡明了其一級(jí)結(jié)構(gòu)為(NH3+)-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-COO-。此后，從裂殖酵母Schizosaccharomycespombe中也分離得到一類可與鎘(Cd)結(jié)合的多肽化合物，其一級(jí)結(jié)構(gòu)為(γ-Glu-Cys)n-Gly，其中n＝2～3。迄今為止，人們已發(fā)現(xiàn)這類多肽存在于從酵母、藻類、苔蘚、蕨類直到種子植物的多種生物體內(nèi)。鑒于其在植物界的廣泛分布，人們將這類化合物命名為植物絡(luò)合素，通式為(γ-Glu-Cys)n-Gly，(n＝2～11)。在高等植物中，除了以Gly為C-末端氨基酸的PC分子之外，還存在以其它氨基酸為C-末端氨基酸的PC分子，這類分子常被稱為異植物絡(luò)合素(iso-Phyotchelatins)。Rauser將C-末端氨基酸不同的PC歸為以下五種(1)(γ-Glu-Cys)n；(2)(γ-Glu-Cys)n-Glu；(3)(γ-Glu-Cys)n-Gly；(4)(γ-Glu-Cys)n-β-Ala；(5)(γ-Glu-Cys)n-Ser。
PC的合成是以GSH為前體的。植物細(xì)胞內(nèi)合成GSH的酶系及相應(yīng)的生化反應(yīng)目前已研究得較清楚，這些酶主要分布于細(xì)胞質(zhì)及質(zhì)體中。首先，Glu與Cys由依賴ATP的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)催化合成二肽γ-Glu-Cys；然后，由依賴ATP的GSH合成酶催化將Gly轉(zhuǎn)到γ-Glu-Cys上合成GSH。在闡明從GSH合成PC的生物合成途徑時(shí)，Grill等首先在膀胱麥瓶草Silenecucubalus的細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了一種酶，這種酶在體外特定的反應(yīng)系統(tǒng)中可利用GSH先合成(γ-Glu-Cys)2-Gly，15分鐘后產(chǎn)生(γ-Glu-Cys)3-Gly，繼而是(γ-Glu-Cys)4-Gly。這種將GSH的半分子γ-Glu-Cys轉(zhuǎn)移到另一個(gè)GSH分子上的酶被命名為γ-谷氨酰半胱氨酸二肽轉(zhuǎn)肽酶，簡(jiǎn)稱為PC合酶(phytochelatin synthase，PCS，E.C.2.3.2.15)。
PC合酶是PC合成途徑的關(guān)鍵酶。自從Grill在膀胱麥瓶草中鑒定了PC合酶的活性之后，類似的酶活也在豌豆、西紅柿、擬南芥、水稻中被發(fā)現(xiàn)。膀胱麥瓶草中的PCs合酶，分子量為Mw＝95KDa，等電點(diǎn)pI＝2.7；被Cd2+激活的PCs合酶呈25KDa亞單位四聚體形式，可在較寬的溫度范圍內(nèi)保持活性，最適反應(yīng)溫度為35℃，最適pH值為7.9；其二聚體形式仍然保持合酶活性。它催化的反應(yīng)可用Grill總結(jié)的反應(yīng)式表示(γ-Glu-Cys)n-Gly+(γ-Glu-Cys)n-Gly→(γ-Glu-Cys)n+1-Gly+(γ-Glu-Cys)n-1-Gly其中，γ-Glu-Cys由GSH提供(對(duì)GSH，Km＝6.7mM)，當(dāng)胞內(nèi)GSH缺乏時(shí)，PC如(γ-Glu-Cys)2-Gly亦可提供該半分子，作為供體以合成更長(zhǎng)鏈的PC。此酶只有在金屬離子存在的條件下才表現(xiàn)活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，Cd2+是最強(qiáng)的激活劑，其次有Ag+，Bi3+，Pb2+，Zn2+，Cu2+，Hg2+，AuCl4-等；而其它一些離子，如Na+，K+，Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，Al3+沒有激活作用。
盡管Grill等在1989年就得到了PC合酶，但是直到1999年，才有三個(gè)研究小組分別從擬南芥、小麥和裂殖酵母中分離得到編碼PC合酶的基因。擬南芥中PC合酶基因AtPCS1編碼一個(gè)55-KD的多肽，含485個(gè)氨基酸殘基。就N-端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而言，它與裂殖酵母中PC合酶SpPCS在此序列區(qū)的同源性達(dá)45％；C-端結(jié)構(gòu)域的序列同源性較低。但兩者在C-端結(jié)構(gòu)域都有多個(gè)Cys殘基(擬南芥中為10個(gè)，裂殖酵母中為7個(gè))，并分別有4個(gè)和6個(gè)Cys殘基成對(duì)存在。這些Cys殘基在位置上并不保守。小麥中TaPCS與擬南芥AtPCS全序列同源性有55％，其中TaPCS有14個(gè)Cys(在C-端結(jié)構(gòu)域形成2個(gè)Cys殘基對(duì))。早期的研究表明，PC合酶基因的表達(dá)是組成型的，也就是說(shuō)在PC生物合成的調(diào)控機(jī)制中可能不存在PC基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。如AtPCS1的表達(dá)產(chǎn)物的Northern Blot和RT-PCR分析表明其mRNA水平在Cd2+處理前后無(wú)明顯變化。然而，小麥根中TaPCS1的mRNA水平會(huì)因Cd2+的處理而上升。而在翻譯后的蛋白質(zhì)水平上，PC合酶的激活特性卻可調(diào)節(jié)胞內(nèi)PC的合成。
然而，迄今為止PC合酶基因在植物對(duì)重金屬抗性中究竟起什么作用仍不清楚，也沒有從重金屬耐受或超富集植物中克隆到PC合酶基因的報(bào)道。大蒜富含巰基化合物，如大蒜素等，大蒜的根、鱗莖、葉片均可超量累積重金屬，那么在大蒜對(duì)重金屬的抗性中哪些基因起關(guān)鍵作用？PCs合酶基因的表達(dá)產(chǎn)物在大蒜富含巰基化合物的合成及大蒜對(duì)重金屬的富集中是否起重要作用？發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于從重金屬超富集植物中克隆重金屬抗性基因，即從對(duì)重金屬具抗性的大蒜中克隆了重金屬抗性基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于制備用于清除環(huán)境重金屬污染的轉(zhuǎn)化體，進(jìn)一步培育高耐受低吸收重金屬的新型農(nóng)作物。
發(fā)明詳述本發(fā)明克隆了一種新的植物絡(luò)合素合酶基因，尤其是一種大蒜重金屬抗性相關(guān)基因大蒜PC合酶基因。
本發(fā)明也包括含有大蒜重金屬抗性相關(guān)基因的重組載體，尤其是涉及含有大蒜重金屬抗性相關(guān)基因的酵母穿梭表達(dá)載體pFL61-AsPCS。
本發(fā)明還在真核細(xì)胞中表達(dá)了大蒜PC合酶基因，獲得了抗不同種類和不同濃度的重金屬的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。尤其是轉(zhuǎn)化的酵母菌株。
本發(fā)明進(jìn)一步包括大蒜PC合酶基因的編碼產(chǎn)物。
發(fā)明效果本發(fā)明從一種對(duì)重金屬高度抗性的植物材料中克隆了植物絡(luò)合素合酶的全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特性和在重金屬的抗性中的功能進(jìn)行了分析。結(jié)構(gòu)特性分析表明，PC合酶基因所編碼的氨基酸序列中氨基端有7個(gè)完全保守的Cys殘基和4個(gè)完全保守的His殘基，而不是原來(lái)報(bào)道的5個(gè)Cys和1個(gè)His；而且在羧基端也有4個(gè)完全保守的Cys殘基，以前的報(bào)道認(rèn)為羧基端不保守是由于已克隆的PC合酶基因甚少所致。與擬南芥、小麥、印度薺菜不同的是，大蒜氨基端第47位為Cys殘基而非Tyr，而且在保守區(qū)內(nèi)大蒜有17個(gè)氨基酸殘基與已報(bào)道的不同，表明這是一個(gè)新的序列。以酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明該cDNA在酵母中的表達(dá)可以使對(duì)重金屬敏感的酵母菌株耐受一定濃度的重金屬，其中對(duì)砷的抗性提高此前未見報(bào)道。
本發(fā)明在以下兩方面將產(chǎn)生有益效果將該cDNA置于植物強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控之下，轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)速度快、生物量大、適生性強(qiáng)的植物，培育用于清除環(huán)境重金屬污染的工程植物；將該cDNA的反義序列置于主要農(nóng)作物的種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的調(diào)控下，轉(zhuǎn)化主要農(nóng)作物，在食用部分低吸收重金屬的新型安全農(nóng)作物。


附圖1為大蒜植物絡(luò)合素合酶cDNA(AsPCS)的全序列；附圖2為AsPCS表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列；附圖3A為表達(dá)AsPCS的酵母轉(zhuǎn)化株ABDE-1/AsPCS與對(duì)照在含10μM Cd2+YPD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線；附圖3B為表達(dá)AsPCS的酵母轉(zhuǎn)化株FD236-6A/AsPCS與對(duì)照在含200μM As3+YPD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一大蒜PC合酶基因(phytochelatin synthasegene of Allium sativum，AsPCS)全序列的克隆〖一〗RNA的提取取l00mg大蒜根和葉，利用Trizol(Gibcol)提取其總RNA。
〖二〗cDNA的合成取1μl總RNA，按照SMARTTMcDNA Library ConstructionKit(Clontech)合成cDNA。
〖三〗大蒜PC合酶基因片段的克隆根據(jù)擬南介、酵母、線蟲的PC合酶基因(AtPCS1，CePCS，SpPCS)的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，并以大蒜的cDNA為模板進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，得到一條350bp左右大小的條帶。將所得條帶進(jìn)行回收、純化(鼎國(guó)DNA回收試劑盒)，并測(cè)序。
〖四〗AsPCS 5’RACE根據(jù)得到的PCS片段的序列，以及大蒜cDNA5’端特有的引物序列(SMART III5’Primer)，在所得的序列靠近5’端的序列區(qū)設(shè)計(jì)合成了一條可以與SMART III配合使用的GSP(GeneSpecific Primer)，分別為GSP15’CAGTTCCAGTCTGACCGAAAGC3’以SMART III/GSP1為引物，以大蒜的cDNA為模板，按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit進(jìn)行5’-RACE，得到一條600bp大小的條帶并克隆到pGEM-T(購(gòu)自Promega公司)載體上進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)得的序列，再設(shè)計(jì)另一條靠近SMARTIII的引物GSP25’ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’以GSP2/CDSIII為引物，以大蒜的cDNA為模板，進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR(LD PCR)，得到1.8kb大小的條帶并克隆到pGEM-T(購(gòu)自Promega公司)載體中。
〖五〗AsPCS的序列分析測(cè)序結(jié)果表明這一1868bp的cDNA AsPCS為一全長(zhǎng)cDNA(見附圖1)。其中開讀框架為1521bp，編碼507個(gè)氨基酸(見附圖2)；5’端非翻譯區(qū)98bp，3’終止區(qū)249bp含24個(gè)polyA。其編碼的氨基酸序列與已知的其他物種的PCS cDNA具有較高的同源性。根據(jù)PSORT分析，其表達(dá)產(chǎn)物很可能定位在細(xì)胞質(zhì)中，并且自身未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。
〖六〗大蒜、絆根草、小麥、擬南芥和印度芥菜PC合酶基因產(chǎn)物的氨基酸同源性比較通過blastp比較發(fā)現(xiàn)PC合酶基因在單、雙子葉植物之間不僅氨基端的序列有較高的保守性，羧基端同樣有較高的保守性。這在以前的文獻(xiàn)中沒有報(bào)道。其中同為禾本科植物的絆根草和小麥之間的同源性最高，同為十字花科植物的擬南芥和印度芥菜之間的同源性也很高，而屬單子葉植物百合科的大蒜介于絆根草、小麥與擬南芥、印度芥菜之間。與前人之報(bào)道不同的是，這五種植物的PC合酶氨基酸序列中氨基端有7個(gè)完全保守的Cys殘基和4個(gè)完全保守的His殘基，而不是原來(lái)報(bào)道的5個(gè)Cys和1個(gè)His，而且在羧基端也有4個(gè)完全保守的Cys殘基。此外與擬南芥、小麥、印度薺菜不同的是，大蒜氨基端第47位為Cys殘基而非Tyr，而且在保守區(qū)內(nèi)大蒜有17個(gè)氨基酸殘基與已報(bào)道的不同，表明這是一個(gè)新的序列。
實(shí)施例二大蒜PC合酶基因的功能分析本實(shí)施例中利用酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析大蒜PC合酶基因(AsPCS)的功能。
〖一〗酵母表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)以下一對(duì)引物，在AsPCS兩端引入BstXI的酶切位點(diǎn)。
PAsPCSbst15’CCAGTGTGCTGGATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’PAsPCSbst25’AGCCAGTGTGATGGATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’以大蒜的cDNA為模板進(jìn)行PCR。分別將PCR產(chǎn)物和酵母穿梭表達(dá)載體pFL61(M.Minet，M-E.Dufour and F.Lacroute.Complementation of Saccharomyces cerevisiae auxotrophicmutants by Arabidopsis thaliana cDNAs.Plant J.，1992.2417-422.)，用BstXI進(jìn)行酶切，并將酶切產(chǎn)物回收、連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)鑒定，得到了與pFL61中的啟動(dòng)子正向(pFL61-AsPCS+)和反向(pFL61-AsPCS-)連接的兩種重組子。
〖二〗酵母的轉(zhuǎn)化1.按照Gietz和Schiestl(1995 Methods in Molecular andCelluar Biology 5255-269)的方法對(duì)釀酒酵母突變菌株〖Saccharomyces cerevisiae〗ABDE-1(cuplΔmutant，對(duì)銅、鎘等重金屬敏感)[(arg4-8，leu2-112，his7-2，trp1-289，ade5 andcupΔ1)參見J.Zhou，P.B.Goldsbrough，F(xiàn)unctional homologs offungal metallothionein genes from Arabidopsis，Plant Cell6(1994)875-884.]和裂殖酵母〖Schizosaccharomyces pombes〗FD236-6A(對(duì)砷敏感)[(MATa ura3-52，trp163，leu21，his3200acr3-1∷URA3，GAL2)參見R.Wysocki，P.Bobrowicz and S.Uaszewski.The Saccharomyces cerevisiae ACR3 gene encodes aputative membrane protein involved in arsenite transport.J.Biol.Chem.，1997.27230061-30066]的轉(zhuǎn)化，對(duì)照組用水代替質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
〖三〗轉(zhuǎn)化子的篩選制備含不同重金屬濃度的1/2 YPD平板，以對(duì)照組的酵母菌株涂板，30℃培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定其重金屬脅迫下的生長(zhǎng)臨界濃度，得到ABDE-1對(duì)Cd2+生長(zhǎng)臨界濃度為10μM，而FD236-6A對(duì)As3+的生長(zhǎng)臨界濃度為200μM。將轉(zhuǎn)化的酵母菌株ABDE-1涂布于含10μM的Cd2+的1/2 YPD平板，轉(zhuǎn)化的酵母菌株FD236-6A涂布于含200μM的As3+的1/2 YPD平板，培養(yǎng)72小時(shí)，挑選長(zhǎng)出的單菌落。
〖四〗轉(zhuǎn)化子對(duì)重金屬抗性的測(cè)定挑選轉(zhuǎn)化后的ABDE-1于含5μM Cd2+的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)過夜至OD600＝0.5，取10μl分別加入Cd2+濃度為0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM的YPD培養(yǎng)基(各20ml)，30℃，200rpm培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)，分別測(cè)定它們的OD600。同樣的方法測(cè)定轉(zhuǎn)化子在Cd2+濃度為10μM的YPD培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線(每6小時(shí)測(cè)定一次OD600)。轉(zhuǎn)化后的FD236-6A的對(duì)As3+敏感度的測(cè)定方法同上。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)大蒜植物絡(luò)合素合酶基因的ABDE-1在含20μM Cd2+的YPD液體培養(yǎng)條件下可以正常生長(zhǎng)，而對(duì)照在5μM Cd2+的時(shí)便完全不能生長(zhǎng)(見附圖3)；AsPCS的表達(dá)還提高了FD236-6A對(duì)砷的抗性，這在前人的研究中未見報(bào)道。進(jìn)一步在含不同種類和不同濃度重金屬的培養(yǎng)基中進(jìn)行平板培養(yǎng)證實(shí)了上述結(jié)果。這些研究結(jié)果表明，大蒜植物絡(luò)合素合酶基因在大蒜對(duì)重金屬銅、鎘和砷的防御中有重要功能。
實(shí)施例三 用RT-PCR分析AsPCS的表達(dá)〖一〗材料的處理取生長(zhǎng)一周的大蒜幼苗，以5mM的Cd2+處理，分別于處理0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)后取根尖及莖尖，置于-70℃保存。同法取以0mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM的Cd2+處理6小時(shí)后的大蒜的根尖及莖尖。
〖二〗RNA的提取及eDNA的合成按照前述方法分別提取各種處理材料的RNA，根據(jù)PCR mRNAselective kit(TAKALA)合成cDNA的第一鏈。
〖三〗大蒜Tublin基因片段的克隆根據(jù)小麥等禾本科植物Tublin基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以大蒜的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條600bp左右大小的條帶，經(jīng)過回收、連接、測(cè)序、比較，證明它與禾本科其他植物的Tublin基因具有較高的同源性，是大蒜的Tublin基因片段。因?yàn)門ublin基因的表達(dá)比較穩(wěn)定，不因外界環(huán)境刺激或組織不同而變化，因此是很好的RT-PCR的內(nèi)參。
〖四〗AsPCS的表達(dá)分析根據(jù)AsPCS的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物
PAsPCSrt3 5’ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’PAsPCSrt4 5’CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG 3’以不同處理的cDNA為模板，按以下程序進(jìn)行28個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增90℃40秒；54℃50秒；72℃50秒；取等量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，掃描，利用BiolD對(duì)各個(gè)泳道的條帶進(jìn)行積分。同法測(cè)定對(duì)應(yīng)的Tublin基因表達(dá)量，并將兩者進(jìn)行比較，得到不同處理的AsPCS的表達(dá)差異。
結(jié)果表明，在鎘的誘導(dǎo)下，大蒜根部和莖部的PC合酶基因的表達(dá)均有所提高。在根部，其最大表達(dá)量出現(xiàn)在處理后僅1小時(shí)，說(shuō)明大蒜對(duì)重金屬的脅迫能很快做出反應(yīng)。PC合酶基因表達(dá)量的提高，是引起植物絡(luò)合素合成量提高的一個(gè)重要原因，所以該基因的表達(dá)量的提高暗示植物體內(nèi)植物絡(luò)合素含量的提高。大蒜莖部PC合酶基因的表達(dá)量的最大值出現(xiàn)在處理后6小時(shí)，可能是與植物體內(nèi)重金屬離子的運(yùn)輸需一定的時(shí)間有關(guān)。通過對(duì)相同處理時(shí)間內(nèi)的根部與莖部的PC合酶基因的表達(dá)量的比較，發(fā)現(xiàn)根部植物絡(luò)合素合酶基因的表達(dá)量高于莖部，說(shuō)明植物絡(luò)合素對(duì)重金屬作用的主要場(chǎng)所可能在根部。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院植物研究所<120>一種新的大蒜重金屬抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用<130>1234<160>2<170>Patent In version 3.1<210>1<211>1868<212>DNA<213>大蒜(Allium sativum)<400>1ggccattatg gccggggatc tcagcttcaa taagatagat cacttttcag gccctcaaaa60tttgaaaaac acccaattac ttcctcattt ccacttaaat ggcgcttgcg ggactttatc120gtcgagttct cccgtcaccc ccggccgtcg agtttgcctc gactgaggga aagaaacttt180tcgctgaagc tctacaaaat ggtacgatgg aaggattttt taagttaatt tcctgcttcc240agactcagtc tgaacctgct tattgtggtc tggctagtct atctatggtg ttaaatgccc300ttgcaattga tccaggaaga aagtggaaag gcccttggag atggttcgac gagtcaatgt360tagattgttg cgaacctttg gaaaaagtca aagaagaagg aatcacattt gggaaagttg420catgcttggc ccattgtgcc ggtgctaatg ttcaagctat tcgtacaagc caaggcagtc480ttgaggattt ccgccagcat attatcagat gcacttcttc tgatgattgc catgtgatca540catcgtacaa ccgaaaagct ttcggtcaga ctggaactgg acatttttca ccaattggtg600gttatcacaa aggaagtgat atggcactca ttttagacac tgcacgtttc aaatatcctc660ctcattgggt cccacttcaa cttctttggg aggctatgaa gtatgaagat cctgctaccg720gatatcctag gggattcatg cttatatcaa agcttcagag agcgccatct cttctttaca780ccctgagctg cagacacgag agctgggttc aaaccgcaaa gtacttgatg gatgatgtcc840ctattcttct gaaaaaggca aatttaaaca cagtacaaga tgtactctct cttattttca900aatctctcct ttccaatgct ggggatttta ttaaatgggt tgcagaagtt agaagaccag960aagaaaattc agctttaagc aaagaagaga aggagagact tgcgattaag gaaatcgtac 1020tgcaacaaat tcgtgaaacc aaactgtata agtatgtgtc ggaatggctg tctgatatgc 1080ggtcgtgttg ctgcaacgca tcagctttca gtggaaaaga ttcattaact gatattgcgg 1140ccagtgtatg ttgccagggt gctttattgt tggctggaaa tttaggtagg gacaataaat 1200catgccttaa agaaacatgc gttaacaatg tgaaatccaa tggaggtggc cccataactg 1260tagtgtcagg tactgtagtt tcagagggtg gtgagcaagg ggttgatatg ttggtaccca 1320catcgccatc aaaatcacat ggttgcaatg caggttcttc ttctttctgt gctatagctc 1380acccgggaca tggtgacgta ttaactattc tttcactagc cttgtttacc aactcttggt 1440tcgatatcag caataagaag ctgcttgatg aaattcgtgc tctagtttca tttcagaatc 1500ttcccgatgt acttcaggag gaggttctac acctgcgcag gcaactaatg tttctgaaga 1560aatgcaaaga caaagaggtc gacggggacg ttttattgcc ttccatttcc atggtgtaat 1620tgatatgata tcaaaattca catacttact aagagaatgt tcgctgttgc taatttgttg 1680tatacctgct tactagtgaa agcggtatca tatggatgtg tattgtccat tttggaattc 1740agttctgaat aaacggtgag cctgacgcaa gcttgcaatt tgactttgaa tataacgtgc 1800cttgaacaat gaatcttagt agcaaattgt tagttttcgt ctccaaaaaa aaaaaaaaaa 1860aaaaaaaa 1868<210>2<211>506<212>PRT<213>大蒜(Allium sativum)<400>2Met Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Arg Arg Val Leu Pro Ser Pro Pro Ala1 5 10 15Val Gl u Phe Ala Ser Thr Glu Gly Lys Lys Leu Phe Ala Glu Ala Leu20 25 30Gln Asn Gly Thr Met Glu Gly Phe Phe Lys Leu Ile Ser Cys Phe Gln35 40 45Thr Gln Ser Glu Pro Ala Tyr Cys Gly Leu Ala Ser Leu Ser Met Val50 55 60Leu Asn Ala Leu Ala Ile Asp Pro Gly Arg Lys Trp Lys Gly Pro Trp65 70 75 80Arg Trp Phe Asp Glu Ser Met Leu Asp Cys Cys Glu Pro Leu Glu Lys85 90 95Val Lys Glu Glu Gly Ile Thr Phe Gly Lys Val Ala Cys Leu Ala His100 105 110Cys Ala Gly Ala Asn Val Gln Ala Ile Arg Thr Ser Gln Gly Ser Leu115 120 125Glu Asp Phe Arg Gln His Ile Ile Arg Cys Thr Ser Ser Asp Asp Cys130 135 140His Val Ile Thr Ser Tyr Asn Arg Lys Ala Phe Gly Gln Thr Gly Thr145 150 155 160Gly His Phe Ser Pro Ile Gly Gly-Tyr His Lys Gly Ser Asp Met Ala165 170 175Leu Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Lys Tyr Pro Pro His Trp Val Pro180 185 190Leu Gln Leu Leu Trp Glu Ala Met Lys Tyr Glu Asp Pro Ala Thr Gly195 200 205Tyr Pro Arg Gly Phe Met Leu Ile Ser Lys Leu Gln Arg Ala Pro Ser210 215 220Leu Leu Tyr Thr Leu Ser Cys Arg His Glu Ser Trp Val Gln Thr Ala225 230 235 240Lys Tyr Leu Met Asp Asp Val Pro Ile Leu Leu Lys Lys Ala Asn Leu245 250 255Asn Thr Val Gln Asp Val Leu Ser Leu Ile Phe Lys Ser Leu Leu Ser260 265 270Asn Ala Gly Asp Phe Ile Lys Trp Val Ala Glu Val Arg Arg Pro Glu275 280 285Glu Asn Ser Ala Leu Ser Lys Glu Glu Lys Glu Arg Leu Ala Ile Lys290 295 300Glu Ile Val Leu Gln Gln Ile Arg Glu Thr Lys Leu Tyr Lys Tyr Val305 310 315 320Ser Glu Trp Leu Ser Asp Met Arg Ser Cys Cys Cys Asn Ala Ser Ala325 330 335Phe Ser Gly Lys Asp Ser Leu Thr Asp Ile Ala Ala Ser Val Cys Cys340 345 350Gln Gly Ala Leu Leu Leu Ala Gly Asn Leu Gly Arg Asp Asn Lys Ser355 360 365Cys Leu Lys Glu Thr Cys Val Asn Asn Val Lys Ser Asn Gly Gly Gly370 375 380Pro Ile Thr Val Val Ser Gly Thr Val Val Ser Glu Gly Gly Glu Gln385 390 395 400Gly Val Asp Met Leu Val Pro Thr Ser Pro Ser Lys Ser His Gly Cys405 410 415Asn Ala Gly Ser Ser Ser Phe Cys Ala Ile Ala His Pro Gly His Gly420 425 430Asp Val Leu Thr Ile Leu Ser Leu Ala Leu Phe Thr Asn Ser Trp Phe435 440 445Asp Ile Ser Asn Lys Lys Leu Leu Asp Glu Ile Arg Ala Leu Val Ser450 455 460Phe Gln Asn Leu Pro Asp Val Leu Gln Glu Glu Val Leu His Leu Arg465 470 475 480Arg Gln Leu Met Phe Leu Lys Lys Cys Lys Asp Lys Glu Val Asp Gly485 490 495Asp Val Leu Leu Pro Ser Ile Ser Met Val500 50權(quán)利要求
1.一種大蒜重金屬抗性相關(guān)基因，它編碼序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因編碼的多肽，它是由序列表SEQ ID NO1所示的cDNA序列編碼的。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，它是含有所述基因的pFL61-AsPCS。
5.含有權(quán)利要求3所述的載體的宿主細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，它是酵母細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，它是大腸桿菌。
8.一種生產(chǎn)權(quán)利要求2所述的多肽的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，回收所述的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)重金屬具抗性的基因即大蒜植物絡(luò)合素合酶基因，該基因所編碼的氨基酸序列中氨基端有7個(gè)完全保守的Cys殘基和4個(gè)完全保守的His殘基，而且在羧基端也有4個(gè)完全保守的Cys殘基；以酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明其cDNA在酵母中的表達(dá)可以使對(duì)重金屬敏感的酵母菌株耐受一定濃度的重金屬；本發(fā)明進(jìn)一步可用于培育用于清除環(huán)境重金屬污染的工程植物，以及制備在食用部分低吸收重金屬的新型安全農(nóng)作物。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1401771SQ0213103
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月26日
發(fā)明者麻密, 姜瑛楠, 馮保民, 李江川, 楊樹德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所