專利名稱：一種氨芐青霉素抗性質粒載體及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和微生物學領域。具體地講，本發明涉及一種β-內酰胺酶泄漏減少的氨芐青霉素抗性質粒載體及其制備與應用。
背景技術：
1973年，美國科學家發明了重組DNA技術，標志著人類認識生命本質并能按照自己意愿改造生命的新時期開始。在這之后的三十多年里，以重組DNA技術為基礎的基因工程得到了蓬勃發展。基因工程技術通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，實現基因改造和重新組合，然后導入宿主細胞進行無性繁殖，并誘導重組基因的表達，產生出所需要的基因產物。基因工程技術不僅在基礎研究中有著廣泛的應用，也在數以千億美元計的生物技術產業中發揮著重要作用。載體是用來協助將目的基因引入宿主細胞進行增殖或表達的DNA片段。基因工程中常用的載體主要包括質粒、噬菌體和病毒三大類，其中以質粒的使用最為廣泛。質粒是獨立于細胞染色體外具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA。最早使用的質粒載體是PBR322， 它是一人工構建的DNA片段，分子大小為4. 3kb，帶有抗氨芐青霉素和抗四環素基因以利于篩選的標志基因，并含有EcoRI、BamHLHindIII等單一的限制酶切點以方便目的基因的克隆。現今使用的質粒大多來自pBR322的改造，它們的一個共同特點是使用抗氨芐青霉素基因作為篩選標志。氨芐青霉素是現今使用最廣泛的抗生素，它的抑菌機理是使細菌細胞膜的內層轉肽酶失活從而抑制細胞壁的合成，細菌因無法合成完整的細胞壁而導致無法生長。抗氨芐青霉素基因(bla)編碼β -內酰胺酶(β-lactamase)，β -內酰胺酶在胞質內合成后經自身信號肽引導進入周質空間(細胞內、外膜之間一狹窄區域)。跨膜后，信號肽被信號肽酶切除，產生成熟的β "內酰胺酶。β "內酰胺酶水解氨芐青霉素的β "內酰胺環使其失效，轉化菌因而也得以在氨芐青霉素存在的環境下生長。可以看出，β -內酰胺酶分泌至周質空間是轉化菌產生氨芐青霉素抗性的先決條件。有研究表明，大腸桿菌外膜蛋白的信號肽引導內酰胺酶至周質空間的效率相比內酰胺酶的自身信號肽要高出 100倍以上。然而，因為尚未知的原因，分泌至周質空間的β -內酰胺酶可進一步泄漏至胞外， 將胞外環境中的氨芐青霉素破壞掉。當轉化菌在瓊脂固體培養基上培養時，泄漏至胞外的
內酰胺酶在轉化菌周圍形成一個無氨芐青霉素選擇壓力的區域，在那個區域非轉化菌也能夠生長，形成大家所熟知的“衛星菌落”，這會干擾對轉化菌的挑選。當轉化菌被應用于液體培養基中培養時，內酰胺酶的泄漏會造成更嚴重的問題。由于內酰胺酶的迅速擴散，液體培養基中的氨芐青霉素會被全部破壞掉，使得整個環境的選擇壓力消失。轉化菌細胞中的質粒存在分離不穩定性，質粒在細胞分裂過程中不是平均分配，在細胞分裂時會產生不含有質粒的細胞。在選擇壓力消失的環境中，不含有質粒的細胞會迅速生長。因為不含有質粒的細胞代謝負擔比含有質粒的細胞要輕，不含有質粒的細胞生長速度比含有質粒的細胞要快。由于存在競爭優勢，培養物最終將被不含有質粒的細胞所主導，含有質粒的細胞在培養物中只占很小的比例，這對相關的應用如質粒的抽提、蛋白質的表達等會造成嚴重的負面影響。培養基中氨芐青霉素的選擇壓力也會因為受培養基酸化影響而被破壞。隨著培養時間的延長，細菌的代謝活動促使培養基的PH降低，而氨芐青霉素在酸性環境下易發生水解，這個問題可以通過調控培養基的PH或者采用羧芐青霉素來避免，因為羧芐青霉素在酸性環境中的穩定性相比氨芐青霉素要高很多。但是，羧芐青霉素的價格是是氨芐青霉素的數倍；而且，跟氨芐青霉素一樣，羧芐青霉素不能抵抗β -內酰胺酶的水解作用。因此，減少甚至消除內酰胺酶的泄漏對于保持培養環境中的選擇壓力是至關重要的。對于以重組蛋白質表達為目的的培養而言，保持培養環境的選擇壓力非常重要。 如果選擇壓力消失，導致最終培養物中無質粒的細胞占主導，則由于目的基因的丟失，目標蛋白質的表達水平將很低。一些方法已經被報道用來減少內酰胺酶泄漏造成的負面影響，包括在培養物中加入β “內酰胺酶的抑制劑甲氧苯青霉素；洗滌細胞以去除β “內酰胺酶；使用高度稀釋的培養物用于接種等。但是，這些方法并不解決內酰胺酶的泄漏問題，只是β-內酰胺酶的泄漏后的補救措施。因為每批次的培養都需要進行這些操作，這些方法費事、也不經濟。同時，由于內酰胺酶的不斷合成和泄漏，這些方法的效果是有限的。

發明內容
如背景技術中所述，為了減少培養過程中內酰胺酶泄漏造成的不利影響，已經提出了一些方法。但這些方法要求在每批次培養中都進行相關操作，既費事、又不經濟。 本發明的目的在于克服現有技術中的局限性，將減少內酰胺酶泄漏作為目標，而不是去想辦法補救內酰胺酶泄漏造成的負面影響。在此基礎上，提供一種減少攜帶有氨芐青霉素抗性質粒的大腸桿菌在培養過程中內酰胺酶泄漏的方法及其應用。本發明主要通過對現有質粒載體質粒骨架上氨芐青霉素抗性基因的改造，來解決 β-內酰胺酶泄漏的問題。為了實現上述目的，本發明首先公開了一種氨芐青霉素抗性質粒載體，所述氨芐青霉素抗性質粒載體的質粒骨架上含有抗氨芐青霉素基因，所述抗氨芐青霉素基因為 β-內酰胺酶的編碼基因(bla)與β-半乳糖苷酶α肽編碼基因(IacZa)的融合基因。所述融合基因中，β-半乳糖苷酶α肽編碼基因連接于β -內酰胺酶編碼基因的 3’端。半乳糖苷酶α肽編碼基因與內酰胺酶編碼基因直接相連，或者兩者之間經連接肽編碼基因連接，連接肽編碼基因編碼的連接肽應不影響融合蛋白功能。常用的不影響融合蛋白功能的連接肽序列可以是=GlyGlySer, (GlyGlySer)2, (GlyGlySer)3, (GlyGlySer)4, SerProGlySer, GlySerGlySerGly, (GlySerGlySerGly)2, (GlySerGlySerGly)3 GlyGlySerGlyGly, (GlyGlySerGlyGly)2, (GlyGlySerGlyGly)3 GlyGlyGlyGlySer, (GlyGlyGlyGlySer)2, (GlyGlyGlyGlySer)3, (His)6, (His)8, GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly 或 GlySerAlaGlySerAlaAlaGlySerGlyGluPhe。本發明的氨芐青霉素抗性質粒載體質粒骨架上的其他構架均為常規。進一步的，所述融合基因編碼序列為SEQ ID NO 14的融合蛋白，或者所述融合基因編碼的蛋白質其氨基酸序列與SEQ ID NO :14具有高度同源性。進一步的，所述融合基因的序列為SEQ ID NO :1，或者所述融合基因的序列與SEQ ID NO :1具有高度同源性。本發明的氨芐青霉素抗性質粒載體可用將現有氨芐青霉素抗性質粒載體中的 β-內酰胺酶編碼基因采用所述融合基因替換的方法獲得。所述現有氨芐青霉素抗性質粒載體可以是任一具有氨芐青霉素抗性并以β _內酰胺酶編碼基因作為其抗氨芐青霉素基因的載體。現有氨芐青霉素抗性質粒載體可以是如 PET系統、pMAL系統、pTrc系統或pGEX系統中的載體。本發明的氨芐青霉素抗性質粒載體可用于構建重組載體。轉化有本發明的氨芐青霉素抗性質粒的菌株，相比轉化有未改造的氨芐青霉素抗性質粒載體的菌株，轉化菌培養過程中內酰胺酶泄漏顯著減少，從而避免內酰胺酶泄漏對于轉化菌培養所造成的不利影響。本發明還提供了一種減少攜帶有氨芐青霉素抗性重組載體的菌株在培養過程中 β -內酰胺酶泄漏的方法，選自以下任一1)采用本發明的氨芐青霉素抗性質粒載體構建重組載體，而后轉化并用于培養；2)將所述菌株攜帶的氨芐青霉素抗性重組載體進行基因改造，將該氨芐青霉素抗性重組載體質粒骨架中的內酰胺酶編碼基因改造為內酰胺酶的編碼基因與半乳糖苷酶α肽編碼基因的融合基因，而后轉化并用于培養。所述菌株為大腸桿菌菌株，菌株可以是BL21，BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，DH5α， DH10B, JM109, MachlTl，Origami, Origami (DE3)，Origami (DE3)pLysS, Origami B, Origami B (DE3), Origami B(DE3)pLysS, Rosetta, Rosetta (DE3), Rosetta (DE3) pLysS, TGl， TOPlO 或 XLl-Blue。本發明將編碼β -內酰胺酶的DNA片段與編碼β -半乳糖苷酶α肽的DNA片段融合得到融合基因，再用融合基因替換原質粒上內酰胺酶編碼基因，或者將原質粒上 β-內酰胺酶編碼基因改造為融合基因。融合基因編碼的融合蛋白保留內酰胺酶的活性，轉化菌能夠在含有氨芐青霉素的環境中正常生長；但在另一方面，融合蛋白的分泌水平大大降低，泄漏至胞外的量也極大地減少，導致胞外的內酰胺酶活力極低，從而達到了減少β-內酰胺酶泄露的目標。此方法從基因改造的角度來達到減少β-內酰胺酶泄露的目標，質粒載體改造好后，具有一勞永逸的特點，不需像其它方法那樣，為避免內酰胺酶泄露造成的負面影響在每批次培養都需要進行相關操作，因而更簡便和經濟。


圖1 β -內酰胺酶與改造后的β -內酰胺酶與β -半乳糖苷酶α肽的融合蛋白在過表達條件下的泄漏情況M 標準分子量蛋白質；1 :BL21 (DE3)/pOmpAssbla(表達β -內酰胺酶)胞內可溶性蛋白質；IIB :BL21 (DE3)/pOmpAssbla 胞內包涵體；2 :BL21(DE3)/pXYZ3(表達β -內酰胺酶與β _半乳糖苷酶α肽的融合蛋白)胞內可溶性蛋白質；
2IB :BL21 (DE3)/pXYZ3 胞內包涵體；1，BL21(DE3)/p0mpAssbla 胞外蛋白質；2，:BL21(DE3)/pXYZ3 胞外蛋白質；(箭頭表示目標蛋白質的包涵體及胞外蛋白質條帶)。圖2以pGEX-4T-l質粒骨架上β -內酰胺酶編碼基因的改造為例說明在質粒上實現該基因改造的方法
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限制本發明的適用范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗指南 (第三版)》(J.薩姆布魯克等著，2003)中所述的條件進行。實施例1 β -內酰胺酶與改造后的β -內酰胺酶與β “半乳糖苷酶α肽的融合蛋白在過表達條件下的泄漏情況對比1. 1表達載體的構建1. 1. 1 大腸桿菌外膜蛋白 A (outer membrane protein A, ompA)基因擴增以大腸桿菌基因組為模板，ompA-F (5，-ggaattccatatgAAAAAGACAGCTATCGCGATTG-3'SEQ ID NO 2)和 ompA-R(5，-cggggtaccGAACTGGTAAACGATACCC_3，SEQ ID NO 3)為上、下游引物，PCR反應擴增包含信號肽的全長基因，產物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用生工生物工程(上海)有限公司提供的“SanPrep柱式膠回收試劑盒”回收目的片段，得到ompA 基因擴增產物。1. 1. 2 β -內酰胺酶的過表達載體構建文獻報道，大腸桿菌外膜蛋白A信號肽(ompAss)引導β -內酰胺酶的分泌相比其自身信號肽效率要高出100倍以上，構建融合基因并置于Τ7強啟動子下表達，具體方式如下以 ompA-F 為上游引物，Lactam-R(5，-cccaagcttatcaCCAATGCTTAATCAGTGAG-3，SEQ ID NO 4)為下游引物，IP0M(5，-GTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCCACCCAGAAACGCTGGTGAAAG-3，SEQ ID NO 5)為中間搭橋引物，以ompA基因擴增產物(ompA信號肽模板)和pGEX_4T_l質粒 (β-內酰胺酶編碼基因模板)為模板，通過重疊PCR擴增編碼ompA信號肽和β-內酰胺酶成熟蛋白質的雜合基因。產物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產物經NdeI和HindIII雙酶切后，連入經同樣酶切的pET24a載體，測序后獲得正確的克隆， 質粒命名為pOmpAssbla。1. 1. 3 β -內酰胺酶(β -lactamase)與 β -半乳糖苷酶 α 肽(β -galactosidase α peptide)的融合蛋白質的過表達載體構建以質粒 pMALp2x 為模板，IacZ α -F(5' -gtcggtaccGCACTGGCCGTCGTTTTAC_3，SEQ ID NO 6)禾口 IacZ α-R(5，-cccaagctttcaTCCGCCAAAACAGCCA-3，SEQ ID NO 7)為上、下游引物，PCR反應擴增β-半乳糖苷酶α肽的編碼基因IacZa，產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產物經KpnI和HindIII雙酶切后，連入經同樣酶切的 pET32a載體，測序后獲得正確的克隆，質粒命名為pXYZl。以質粒 pOmpAssbla 為模板，ompA-F 和 bla_R(5，-ggggtaccCAACCAATGCTTAATCAGTGAG-3'SEQ ID NO 8)為上、下游引物，PCR反應擴增編碼ompA信號肽與β -內酰胺酶成熟蛋白質(不含終止子)的雜合基因，產物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產物經NdeI和KpnI雙酶切后，連入經同樣酶切的pXYZl載體，測序后獲得正確的克隆，質粒命名為PXYZ2。用NdeI和HindIII對質粒pXYZ2進行雙酶切，酶切產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收小片段(ompAss-bla-lacZa雜合基因)，純化后連入經同樣酶切的 pET24a載體，測序后獲得正確的克隆，質粒命名為pXYZ3。1.2蛋白質表達與檢測構建好的質粒pOmpAssbla和pXYZ3分別轉化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，得到的工程菌命名為 BL21 (DE3)/p0mpAssbla 和 BL21 (DE3)/pXYZ3。分別挑取BL21 (DE3) /pOmpAssbla 和 BL21 (DE3) /pXYZ3 單菌落接入含有 50mg/L 卡那霉素的MR培養基中，30 0C，200rpm,過夜培養。將過夜培養的BL21 (DE3)/pOmpAssbla 和 BL21 (DE3)/pXYZ3 按 5% 的接種量接入含有50mg/L卡那霉素的MR培養基中，30°C，200rpm,培養至OD6tltl 3. 0時，加入終濃度為 0. 5mM的誘導劑IPTG，誘導培養3. 5小時。將菌液于12000rpm離心5分鐘后，取發酵液上清制備樣品用于目標蛋白質泄漏的檢測。菌體用20mM pH 8. 0的磷酸緩沖液重懸，超聲破碎，將破碎液于12000rpm離心10 分鐘后，分別取上清和沉淀制備樣品用于胞內可溶性蛋白質和包涵體的檢測。MR培養基是以甘油為碳源的合成培養基，培養基組分明確。BL21(DE3)在MR培養基中生長時，細胞外膜的通透性提高，分泌至周質空間的蛋白質大部分泄漏至發酵液中。 用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析制備的蛋白質樣品后發現，內酰胺酶過表達后大部分泄漏至發酵液中，而β-內酰胺酶與β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白過表達后，絕大部分以包涵體的形式存在，發酵液中檢測不到融合蛋白(圖1)。這表明，將半乳糖苷酶α肽與 β“內酰胺酶融合是阻止β“內酰胺酶泄漏至胞外環境的好方法。另一方面，BL21 (DE3)/pXYZ3可以在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L氨芐青霉素的雙抗平板上生長，這表明，內酰胺酶與半乳糖苷酶α肽融合后仍然保留內酰胺酶的活性。因此，將編碼β-內酰胺酶的DNA片段與編碼β-半乳糖苷酶α肽的DNA 片段融合得到的融合基因作為抗性基因是可行的。實施例2質粒上β -內酰胺酶編碼基因的改造下面以商品化質粒pGEX-4T-l為例，將質粒骨架上β -內酰胺酶編碼基因改造為編碼內酰胺酶與半乳糖苷酶α肽的融合蛋白的融合基因。2. 1載體的改造以引物對 MutNheI-F (5，-GAACTACTTACTCTAGCTAGCCGGCAACAATTAATAG-3，SEQ ID NO :9)、MutNheI-R(5，-CTATTAATTGTTGCCGGCTAGCTAGAGTAAGTAGTTC-3，SEQ ID NO 10)和 Mu tHindm-F(5，-GTAACTGTCAGACCAAGCTTACTCATATATACTTT-3，SEQ ID NO 11) ,MutHindIH-R (5 ‘-AMGTATATATGAGTAAGCTTGGTCTGACAGTTAC-3‘ SEQ ID NO 12)為引物，以質粒pGEX_4T_l 為模板，PCR反應擴增整個質粒，擴增產物為帶缺刻的開環質粒。用限制性內切酶DpnI (DpnI 的識別序列為甲基化的GATC，GATC幾乎在各種質粒中都會出現且不止一次)切割PCR產物，原來的模板質粒PGEX-4T-1來源于常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的，對Dpn I敏感而被切碎，而體外合成的帶突變序列的質粒由于沒有甲基化而不被切開。Dpn I酶消化模板質粒后轉化大腸桿菌DH5 α，挑取轉化菌單菌落培養、抽提質粒并送交測序。經篩選，得到產生目標突變的質粒，新的質粒命名為pGEXM。相比較pGEX-4T-l，pGEXM質粒骨架上產生了一個Nhe I和一個HindIII酶切位點。其中，HindHI酶切位點由引物對MutHindHI-F、 MutHindm-R引入，其位點位于β-內酰胺酶編碼基因的終止密碼子之后，對β-內酰胺酶編碼基因無任何影響。NheI酶切位點由引物對MutNhel-F、MutNheI-R引入，其位點位于 β -內酰胺酶編碼基因3’端，此位點突變采用的是同義突變，即改造只限于堿基突變，編碼的氨基酸序列完全未變。這樣，就保證了 PGEXM質粒上抗性基因所編碼的內酰胺酶跟質粒PGEX-4T-1完全一致。以質粒 ρΧΥΖ3 為模板，Mbla-F (5，-gctagctagcCGGCAACAATTAATAGACTG-3，SEQ ID NO 13)和IacZ α -R為上、下游引物，PCR反應擴增β -內酰胺酶編碼基因3’端部分序列及β-半乳糖苷酶α肽的編碼DNA，產物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產物經Nhe I和Hindm雙酶切后，連入經同樣酶切的pGEXM載體，改造后的質粒命名為pGEXMZ。pGEXMZ質粒上氨芐青霉素抗性基因的序列符合SEQ ID NO :1，該抗性基因編碼的是β-內酰胺酶與β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 14，全長349個氨基酸。其中，第1-23位氨基酸為β -內酰胺酶信號肽序列，第24-286 位氨基酸為β-內酰胺酶成熟蛋白質序列，第291-349位氨基酸為β-半乳糖苷酶α肽序列，信號肽在跨膜后會被切除。2. 2 β -內酰胺酶泄漏的對比構建好的質粒pGEXM和pGEXMZ分別轉化宿主菌Ε. coli BL21 (DE3)，得到的工程菌命名為 BL21 (DE3) /pGEXM 和 BL21 (DE3) /pGEXMZ。分別挑取BL21 (DE3) /pGEXM 和 BL21 (DE3) /pGEXMZ 單菌落接入含有 100mg/L 氨芐青霉素的LB培養基中，37 0C，200rpm,過夜培養。將菌液稀釋10倍，用分光光度計檢測600nm下的吸光度以測定菌濃。另取菌液于 12000rpm離心5分鐘后，取發酵液上清檢測β -內酰胺酶的活力。β -內酰胺酶的活力測定是以青霉素G鉀鹽為底物，β -內酰胺酶能夠水解青霉素 G鉀鹽使其在240nm的特定吸收峰消失。取50 μ L發酵液上清跟950 μ L含有200 μ g/mL青霉素G鉀鹽的磷酸緩沖液(50mM，pH 7. 0)混合，37°C下反應30分鐘，測定240nm下的吸光度。β-內酰胺酶的活力以反應時間內青霉素G鉀鹽被水解的百分比表示。表1 β -內酰胺酶編碼基因的改造對菌體生長和β -內酰胺酶泄漏的影響
權利要求
1.一種氨芐青霉素抗性質粒載體，所述氨芐青霉素抗性質粒載體的質粒骨架上含有抗氨芐青霉素基因，所述抗氨芐青霉素基因為β-內酰胺酶的編碼基因與β-半乳糖苷酶α 肽編碼基因的融合基因。
2.如權利要求1所述氨芐青霉素抗性質粒載體，其特征在于，所述融合基因中，半乳糖苷酶α肽編碼基因連接于內酰胺酶編碼基因的3’端。
3.如權利要求1所述氨芐青霉素抗性質粒載體，其特征在于，所述融合基因中，半乳糖苷酶α肽編碼基因與內酰胺酶編碼基因直接相連，或者兩者之間經連接肽編碼基因連接。
4.如權利要求1所述氨芐青霉素抗性質粒載體，其特征在于，所述融合基因編碼序列為SEQ ID NO :14的融合蛋白，或者所述融合基因編碼的蛋白質其氨基酸序列與SEQ ID NO: 14具有高度同源性。
5.如權利要求1所述氨芐青霉素抗性質粒載體，其特征在于，所述融合基因的序列為 SEQ ID NO :1，或者所述融合基因的序列與SEQ ID NO :1具有高度同源性。
6.權利要求1-5任一所述氨芐青霉素抗性質粒載體的制備方法，為將現有氨芐青霉素抗性質粒載體中的內酰胺酶編碼基因采用內酰胺酶的編碼基因與半乳糖苷酶 α肽編碼基因的融合基因替換的方法獲得。
7.權利要求1-5任一所述氨芐青霉素抗性質粒載體用于構建重組載體的用途。
8.一種減少攜帶有氨芐青霉素抗性重組載體的菌株在培養過程中內酰胺酶泄漏的方法，選自以下任一1)采用權利要求1-5任一所述氨芐青霉素抗性質粒載體構建重組載體，而后轉化并用于培養；2)將所述菌株攜帶的氨芐青霉素抗性重組載體進行基因改造，將該氨芐青霉素抗性重組載體質粒骨架中的內酰胺酶編碼基因改造為內酰胺酶的編碼基因與半乳糖苷酶α肽編碼基因的融合基因，而后轉化并用于培養。
9.如權利要求8所述方法，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌菌株，菌株可以是但不限于:BL21, BL21(DE3), BL21 (DE3)plysS, DH5α，DH10B, JM109, MachlTl, Origami, Origami(DE3), Origami(DE3)pLysS, Origami B, Origami B(DE3), Origami B (DE3)pLysS, Rosetta, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS, TGI,TOPlO 或XLl-Blue。
全文摘要
本發明公開了一種氨芐青霉素抗性質粒載體及其制備與應用。本發明的氨芐青霉素抗性質粒載體的質粒骨架上含有抗氨芐青霉素基因，所述抗氨芐青霉素基因為β-內酰胺酶的編碼基因與β-半乳糖苷酶α肽編碼基因的融合基因。本發明的氨芐青霉素抗性質粒載體可用于構建重組載體。相比未改造的氨芐青霉素抗性質粒載體，轉化有本發明的氨芐青霉素抗性質粒的菌株在培養過程中β-內酰胺酶泄漏顯著減少，從而避免了β-內酰胺酶泄漏對于轉化菌培養所造成的不利影響。
文檔編號C12R1/19GK102329811SQ20111027390
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者傅向陽, 李威 申請人:生工生物工程(上海)有限公司