專利名稱：通過Cre-LoxP定點打靶體細胞克隆家畜作為乳腺生物反應器的研制的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程、胚胎工程與家畜繁殖工程等生物學領域。具體地，本發明涉及將含有LoxP-標記基因定點整合的轉基因克隆家畜的胎兒成纖維細胞和克隆家畜，及其制備方法和用途。
背景技術：
轉基因動物(包括家畜)在生命科學的基礎研究、生物制藥、以及異種器官移植研究中具有廣泛的應用前景，尤其是生物制藥業利用轉基因動物生物反應器來生產具有生物活性的醫用蛋白，將會在生物制藥業中產生巨大的商業利潤。制備轉基因動物的方法有多種，如顯微注射法、脂質體介導法、精子介導等，其中顯微注射法是一種經典的方法，但在家畜中轉基因的整合率僅為2-3％，且轉基因的整合是隨機的，其表達水平受到整合位置的影響，尤其是該方法不能對內源基因進行遺傳修飾等，因此限制了該方法在家畜中的應用。
小鼠胚胎干細胞(ES)系的建立在研究基因功能方面起了重要作用。利用基因打靶技術把外源基因導入ES細胞，經囊胚腔注射法制備嵌合體小鼠，再通過繁育從后代中篩選獲得轉基因小鼠。由于在家畜中至今未能獲得ES細胞株，并且尚需多一個世代方能獲得轉基因動物，限制了在家畜中的應用。
自1952年美國科學家Briggs和King首先在兩棲動物中進行細胞核移植實驗以來，家畜的胚胎細胞核移植也相繼在綿羊、家兔、牛、山羊獲得成功。1997年Willmut等人報道了綿羊乳腺上皮體細胞克隆的研究。
克隆羊多利的誕生，為利用體細胞轉基因進而通過核移植制備轉基因動物開辟了新的思路，一是將外源基因轉染到傳代的胎兒成纖維細胞，然后采用克隆技術獲得轉基因克隆動物，這已在綿羊、山羊和牛中得以證實。該方法產生的轉基因動物可達100％，但外源基因的整合位點是隨機的，其表達水平仍受到位置效應的影響。第二，就是應用基因Knock-out或Knock-in技術，先將體外培養的體細胞進行基因定點整合，再將定點整合的單克隆細胞進行核移植，獲得定點整合的轉基因克隆動物。應用該方法制備轉基因動物，不僅可極大地縮短育種周期，降低成本，而且外源基因定點整合，其表達不受位置效應的影響，盡管核移植的效率不高，但對制備轉基因動物乳腺生物反應器來講和前述任何方法相比是一種理想的方法，目前已在綿羊上得到證實[McCreath KJHowcroft J，Campbell KHS，et a1.，Production of gene-targeted sheep by nucleartransfer from cultured somatic cells.Nature 2000，4051066-1070]。
然而，到目前為止，本領域還缺乏高效快速地制備定點整合的、且乳腺特異性表達的轉基因克隆動物的技術。

發明內容
本發明的目的就是提供一種高效快速地制備定點整合的、且乳腺特異性表達的轉基因克隆動物的方法，該方法利用含有LoxP-標記基因定點整合的通用的轉基因克隆家畜的胎兒成纖維細胞來制備轉基因動物。
本發明的另一目的提供用于該方法的基因構建物以及用該方法獲得的轉基因動物。
在本發明的第一方面，提供了一種定點打靶體細胞克隆家畜乳腺生物應器的制備方法，包括步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物從5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因、和3′同源臂序列；(b)篩選得到LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞；(c)將打靶載體與Cre表達質粒/Cre蛋白，共轉染LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞，所述的打靶載體從5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二標記基因、LoxP序列，并篩選得到定點整合有外源基因的成纖維細胞；(d)將步驟(c)的成纖維細胞的細胞核，移植入家畜去核卵母細胞，再生成克隆動物。
在本發明的優選例中，在步驟(b)和(c)之間，還包括以下步驟(i)將步驟(b)的成纖維細胞的細胞核，核移植入家畜去核卵母細胞，再生成克隆動物；以及(ii)從步驟(i)的克隆動物獲取LoxP序列定點整合的克隆家畜胎兒成纖維細胞。
在另一優選例中，所述的家畜選自下組牛、羊、豬、兔。
在另一優選例中，所述的標記基因選白下組neo基因、hygro基因。
在另一優選例中，在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游(即同源臂序列的外側)還含有負篩選標記基因。
在另一優選例中，所述的5′和3′同源臂序列選自下組β-乳球蛋白基因組序列、αsl-酪蛋白基因組序列、β-酪蛋白基因組序列。
在另一優選例中，各同源臂序列的長度為2-10kb，較佳地為2.5-8kb，更佳地為2-6kb。
在另一優選例中，所述的5′同源臂序列含有乳腺特異性表達基因的5′非翻譯區和/啟動子，或者所述的外源基因帶有乳腺特異性表達調控序列。
在本發明的第二方面，提供了一種家畜胎兒成纖維細胞，在所述細胞的基因組中定點插入有一構建物，其中插入位點是選自下組的基因區域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述構建物基本上由LoxP序列和標記基因構成，或者所述的構建物基本上由LoxP序列、外源基因和標記基因構成。
在本發明的第三方面，提供了一種制備家畜成纖維細胞的方法，所述的成纖維細胞的β-酪蛋白基因位點定點插入LoxP序列，該方法包括步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物含有從5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因和3′同源臂序列；(b)篩選得到LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞。
在本發明的第四方面，提供了一種轉基因的非人哺乳動物，在該動物的細胞基因組中定點插入有一構建物，其中插入位點是選自下組的基因區域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述構建物基本上由LoxP序列和標記基因構成，或者所述的構建物基本上由LoxP序列、外源基因和標記基因構成。
在本發明的第五方面，提供了用于基因打靶的構建物，構建物從5′→3′依次含有以下元件5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因、和3′同源臂序列；或者，從5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二標記基因、和LoxP序列。較佳地，所述的構建物在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游還含有負篩選標記基因。


圖1顯示了本發明方法的技術路線。
圖2A顯示了pBC-LoxP打靶載體基因元件構成示意圖。
圖2B顯示了pBC-LoxP打靶載體基因元件構建過程。
圖2C顯示了pLoxP-HLF.Hyg載體基因元件構成示意圖。
圖2D顯示了pLoxP-HLF.Hyg打靶載體基因元件構建過程。
圖3A和3B是不含有目的基因的基因打靶構件以及含目的基因的基因打靶構件的重組示意圖。
圖4是貼壁生長的經基因打靶的單克隆山羊胎兒成纖維細胞。
圖5A是定點整合檢測鑒定的PCR圖。其中泳道1-3分別為45#樣品、對照、51#樣品。
圖5B顯示了PCR測序片段的位置示意圖。
圖6是應用單克隆細胞制備的包理在瓊脂內的發育至囊胚的NT胚胎。
圖7是獲得的基因打靶的單克隆體細胞克隆羊。
具體實施例方式
本發明經過深入而廣泛的研究，發現利用LoxP序列可以方便而高效地將外源基因定點導入細胞，從而獲得乳腺特異性表達的轉基因動物。在此基礎上完成了本發明。
簡而言之，本發明的技術路線是，通過Knock-out的方法，乳腺特異打靶載體轉染家畜胎兒成纖維細胞，定點敲除乳腺特異位點序列，建立一個通用的基因敲除細胞系(LoxP序列定點整合細胞)。再導入含有功能基因的打靶載體，獲得功能基因定點整合的細胞株。利用核移植技術，獲得含有定點整合的轉基因克隆家畜，培育成年后檢測乳腺中的表達產物。
基因打靶的構建物本發明用于引入LoxP序列的基因打靶的構建物從5′→3′依次含有以下元件5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因、和3′同源臂序列。各元件的作用如下5′同源臂序列和3′同源臂序列用于將位于其間的序列通過同源重組整合入染色體；LoxP序列整合入染色體后，利用LoxP序列可在其之間插入功能基因。
第一標記基因用于篩選發生重組的轉化子。產生重組的轉化子因含有標記基因而被選出。
在優選例中，所述構建物在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游還含有負篩選標記基因，其作用是排除非同源重組型的轉化子。發生同源重組時，位于同源臂外側的負篩選標記基因將不會整合入染色體；而發生非同源的重組時，位于同源臂外側的負篩選標記基因可能會整合入染色體。通過篩選不含負篩選標記基因的轉化子，就獲得了發生預定的定點同源重組的轉化子。可用于本發明的負篩選標記基因包括(但并不限于)自殺基因，如TK基因等。
本發明的用于引物外源功能基因的構建物從5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二標記基因、和LoxP序列。各元件的作用如下
LoxP序列用于將位于其間的序列(外源基因和第二標記基因)通過同源重組整合入染色體上的LoxP；外源基因編碼所需的蛋白。
第二標記基因用于篩選發生重組的轉化子。產生重組的轉化子因含有第二標記基因而被選出。
制備方法具體而言，本發明的技術路線如圖1所示，它包括以下二個階段。
第一，獲得含LoxP序列定點整合細胞用含LoxP序列的打靶載體，對山羊胎兒成纖維細胞進行打靶，得到轉染基因的成纖維細胞。所述的LoxP序列打靶載體(構建物)，從5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因、3′同源臂序列和(任選的)負篩選標記基因。通過選擇對應于乳腺特異性表達的基因(如β-乳球蛋白基因組序列、αsl-酪蛋白基因組序列、β-酪蛋白基因組序列等)的同源臂序列，使該構建物定點地在這些乳腺特異性表達基因處發生重組。如果對第一標記基因(如新霉素Neo抗性基因等)和負篩選標記基因(如TK抗性基因等)的篩選，可以獲得抗性細胞。該細胞的獲得建立了一個通用的基因敲除細胞系。因為該細胞在乳腺特異性表達位點處含有LoxP序列，因而可以方便地利用該LoxP序列將需要表達的外源基因定點引入。
該LoxP序列定點整合細胞可以直接用作受體細胞，用含待表達的外源基因的打靶載體進行打靶，也可冷存。
此外，還可用核移植技術將LoxP序列定點整合細胞的細胞核，引入另一卵母細胞，從而得到妊娠的受體。并從該妊娠受體獲得LoxP序列定點整合細胞，或者獲得不含功能基因的定點整合克隆羊。經過核移植后獲得的LoxP序列定點整合細胞，不僅數量大大提高，而且活力也大幅提高。
第二、將待表達的外源基因引入LoxP序列定點整合細胞。
將含外源基因的打靶載體與Cre表達質粒和/或Cre蛋白，共轉染LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞。其中所述的打靶載體從5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二標記基因、LoxP序列。在Cre表達質粒和/或Cre蛋白的協助下，含外源基因的打靶載體會在LoxP序列處發生定點重組，通過篩選(例如根據第二標記基因)，就得到定點整合有外源基因的成纖維細胞；然后，將定點整合有外源基因的成纖維細胞的細胞核，移植入家畜去核卵母細胞，再生成克隆動物。
本發明除了LoxP打靶載體和含外源基因的打靶載體的結構不同于現有技術之外，其他的技術，如轉染技術、篩選技術、雜交方法、PCR方法、核移植方法等技術都可以采用本領域的各種常規技術。因此，對于這些技術不再重復描述。
本發明技術的優點在于建立的基因剔除的細胞(僅含LoxP)是一個通用性的細胞系，利用LoxP序列可在其之間插入功能基因，就可獲得不同功能基因的定點整合細胞系，再應用核移植技術就可制備出帶有不同功能基因定點整合的克隆動物。技術平臺的建立，尤其是基因剔除的細胞系的建立為制備定點整合轉基因克隆動物，提供了較為快捷的方法，并且對乳腺功能和對功能基因以及對調控元件與功能基因的組合的一些基礎研究具有重要價值。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 定點打靶載體的構建(A)pBC-LoxP打靶載體的制備pBC-LoxP打靶載體的示意如圖2A所示，其中各元件的具體序列如SEQ IDNO1-5所示。

1.各部分元件的來源1)本地山羊β-酪蛋白同源臂根據GENBANK gi15425979報道的序列設計并合成如下引物BCZ5’sTTCACGCAAAGATGGGCAC(SEQ ID NO6)和BC-PcGTCTTGGATTGCTTAGAAAACCC(SEQ ID NO7)。以抽提的山羊基因組DNA為模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃3min，30個循環)擴增β-酪蛋白5’同源臂前半部分序列。PCR產物并克隆于pGEM-Teasy載體(購自Promega公司)，得質粒pnBC51。
根據GENBANK gi15425979報道的序列設計并合成如下引物BC-Pl’GGAAGCTCTTAGGTAACATTGC(SEQ ID NO8)和BC5’a.B.S.XCCT AGG CCC GGG CTCGAG TCC TGT GAA TGG GAA GAT GAG(SEQ ID NO9)。以抽提的山羊基因組DNA為模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃ 45s；72℃ 3min，30個循環)擴增β-酪蛋白5’同源臂后半部分序列。PCR產物并克隆于pGEM-Teasy載體，得質粒pnBC52。
根據GENBANK gi15425979報道的序列設計并合成如下引物BCZ3’-s.B.BamHICCT AGG CGG ATC CAG GAA CAA CAG CAA ACA GAG G(SEQ ID NO10)和BCZ3’-aGCC ATA TTT CCA GTC GCA G(SEQ ID NO11)。以抽提的山羊基因組DNA為模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃3min，30個循環)擴增β-酪蛋白3’同源臂前半部分序列。PCR產物并克隆于pGEM-Teasy載體，得質粒pnBC3人工合成兩條單鏈核苷酸NBCTK.MCS1GGCCTGTCGACCTCGAGCCGCGGCAGCTGGGTACCAGCGGCCGCG(SEQ ID NO12)和NBCTK.MCS2TCGACGCGGCCGCTGGTACCCAGCTGCCGCGGCTCGAGGTCGACA(SEQ ID NO13)高溫變性、退火后將其連入用SalI和NotI雙酶切的pBCl載體(購自Invitrogen公司)的原核部分，得質粒pH79-MCS。
以HindIII和Sac I雙酶切pnBC52，回收β-酪蛋白5’同源臂后半部分片段(約3200bp)。將該片段連于pnBC51的HindIII和SacI雙酶切位點，得質粒pBC5’。
以BlnII和SacII雙酶切pnBC3’，回收pnBC3’片段(約3.1Kb)。將該片段連于pBC5’的BlnII和SacII雙酶切位點，得質粒pBC-T。
2)LoxP基因根據相關文獻報道，人工合成兩端帶有XhoI位點的兩條單鏈核苷酸CTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATC(SEQ ID NO14)和TCGAGATAACTTCGTATACGTATGTATATACGAAGTTATC(SEQ ID NO15)3)TK基因合成兩條PCR引物TK.KpnIGGGGTACCCTGCTTCATCCCCGTGGCCC(SEQ IDNO34)；TK.NotIATAAGAATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCC(SEQ ID NO35)。以pNTKV1906質粒(購自Stratagen公司)為模板，常規PCR擴增TK基因。PCR產物用NotI和KpnI雙酶切后，被克隆到得到pBSK載體(購自Stratagen公司)NotI和KpnI雙酶切位點中，得pBSK-TK質粒。TK基因片段包含TK基因自身的啟動子、編碼序列和PolyA序列。
4)Neo抗性基因以SalI和XhoI雙酶切pCDNA3(購自Invitrogen公司)，回收Neo基因片段(約2.2Kb)。該片段包括一個PolyA序列和Neo抗性基因的啟動子、編碼序列和PolyA序列。
2.pBC-LoxP打靶載體的構建構建過程如圖2B所示。以KpnI和NotI雙酶切pBSK-TK質粒，回收TK基因片段(約2100bp)將該片段連于pH79-MCS的KpnI和NotI雙酶切位點得pH79-TK；以SacI和SacII雙酶切pBC-T回收β-酪蛋白同源臂片段(約9.2Kb)將該片段連于pH79-TK的SacI和SacII雙酶切位點得質粒pBC-TK，以SalI和XhoI雙酶切pCDNA3回收Neo基因片段(約2.2Kb)將該片段連于pBC-TK的SacI和XhoI雙酶切位點得質粒pBC-Neo.TK，將人工合成兩端帶有XhoI位點的兩條單鏈核苷酸變性、退火形成LoxP基因并將基因片段(約40bp)連于pBC-Neo.TK的XhoI酶切位點得最終的打靶載體PBC-LoxP。
3.在pBC-LoxP打靶載體中各部分接頭及其臨近序列如下1)5’臂-LoxP-Neo接頭5’臂 接頭 LoxPTCATACGCTGTTTCCTCATCTTCCCATTCACAGGACCTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAG接頭 NEOTTATCCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTG(SEQ ID NO16)2)Neo-3’臂接頭Neo-3’ 接頭 3’臂ATGTCTGTATACCGTCGAGCCCGGGCCTAGGGCGGATCCAGGAACAACAGCAAACA(SEQ ID NO17)3)3’臂-TK接頭3’臂 接頭TKGACTGGAAATATGGCAATCGAATTCCCGCGGTGGCGGCCTCGACTGCTTCATCCC(SEQ ID NO18)(B)pLoxP-HLF.Hyg載體的制備pLoxP-HLF.Hyg打靶載體的示意如圖2C所示，其中各元件的具體序列如SEQ ID NO19-20所示。

1.各部分元件的來源
1)LoxP-HLF(cDNA)基因根據GENBANK AY137470報道的序列，設計并合成如下引物gggagctctcgagataactt cgtatagcat acattatacg aagttatcat gaaacttgtc ttcctcgtcctgc(SEQ ID NO21)和ccggtacctc gagataactt cgtatacgta tgtatatacgaagttatctt acttcctgag gaattcacag g(SEQ ID NO22)以人乳房組織cDNA反轉錄產物為模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃3min，30個循環)擴增LoxP-HLF基因。PCR產物用以KpnI和SacI雙酶切并克隆于pBSK載體(購自Stratagen公司)KpnI和SacI雙酶切位點，得質粒pLoxP HLF。
2)Hgy抗性基因來自pIRESHyg質粒(購自Clontech公司)，以NruI和XhoI雙酶切回收Hyg基因片段(約3.2Kb)包括一段IRES序列和Neo抗性基因的啟動子、編碼序列和PolyA序列。
2.pLoxP-HLF.Hyg載體的構建構建過程如圖2D所示。以KpnI和SacI雙酶切質粒pIRESHyg，回收Hyg基因片段(約3200bp)。將該片段連于pLoxP-HLF的KpnI和SacI雙酶切位點，得pLoxP-HLF.Hyg載體。
3.在pLoxP-HLF.Hyg載體中各部分接頭及其臨近序列如下1)LoxP-HLF接頭LoxP起始密碼子 HLFCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCATGAAACTTGTCTTCCTCGTCCT(SEQ ID NO23)2)HLF-Hyg接頭HLF 接頭 HygCCCCTCCTGGAAGCCTGTGAATTCCTCAGGAAGTAAGTCGACGACGATGTACGGGCCAGATATAC(SEQ IDNO24)3)Hyg-LoxP接頭Hyg 接頭 LoxPTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATCGACTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACG實施例2 定點打靶載體的細胞轉染篩選與鑒定1.薩能奶山羊胎兒成纖維細胞薩能奶山羊胎兒成纖維細胞按照常規方法培養獲得。即從懷孕35天母山羊經手術采集胎兒，去頭、四肢以及內臟后，將其剪成泥狀，加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin/1mM EDTA)，37℃，消化20min，接著加入含10％FCS的DMEM培養液終止消化，500g離心15min。棄去上清，將細胞重懸于培養液內，接種至培養瓶中，置于培養箱中，37℃、5％CO2培養與冷凍。
2.山羊纖維母細胞(GEF)的復蘇和擴增將凍存的雌性山羊纖維母細胞(GEF)復蘇，用15％胎牛血清的DMEM/F12培養液置于37℃含有5％C02培養箱內培養2-3天，待細胞長滿后，再擴增傳代。一般一次轉染需要1×107細胞。
3.電穿孔轉染在轉染前確認細胞的生長處于良好狀態。
將長滿細胞的培養瓶從CO2培養箱取出后，用胰酶消化5-10分鐘。當細胞全部分散成單個細胞后，加入少量含有15％胎牛血清的DMEM/F12培養液終止反應。調整細胞濃度為1×107/ml。
在電穿孔杯內加入細胞懸液和實施例1中制備的構件DNA，在電穿孔儀上通電電擊。電擊完畢后取出電穿孔杯，室溫靜置10分鐘。
將細胞轉移到含有15％胎牛血清的DMEM/F12培養液的無菌60mm平皿中，每個平皿約(1×106細胞)，置于CO2培養箱內培養。
4.正負篩選轉染細胞培養48小時后，培養液中加入G418和Ganc進行正負篩選。當出現細胞集落時，將細胞集落挑出，轉移到96孔板內。待細胞長滿后依次轉移到48孔、24孔、12孔、6孔及60mm平皿中，其中部分細胞抽提DNA，用于PCR和Southern雜交檢測外源基因的整合情況，部分細胞冷凍保存。
圖3A和3B顯示了不含有目的基因的基因打靶構件以及含目的基因的基因打靶構件的重組示意圖。圖4顯示了貼壁生長的經基因打靶的單克隆山羊胎兒成纖維細胞。
5.乳鐵蛋白基因定點整合的檢測(1)檢測同源重組的PCR試驗1)PCR引物的設計構件設計時，取β-酪蛋白3’端的3.2kb序列(11711-14950)作為同源臂連接到構件上。當同源重組時，tk基因丟失，同源臂與基因組上β-酪蛋白3’序列發生重組。
為了檢測細胞內是否發生同源重組，設計了如下兩對引物。第一對上游引物自neor基因起(P1)，下游引物自構件外β-酪蛋白3’序列起(P1’)。第二對引物設計在第一對引物的內側(P2、P2’)。
P1Neo69CTGGGCACAACGGACAATCGG(SEQ ID NO26)
P2Neop3 CTC TGA TGC CGC CGT GTT CC (SEQ ID NO27)P2’BC13553a GGCTAAGGGTTAATTTATTGAAATGACTGG(SEQ ID NO28)P1’BC13988a GCTCCTTCTAGTTGTAACACTAGTCC (SEQ ID NO29)2)PCR擴增條件。常規PCR擴增條件。
3)結果PCR結果如圖5A所示，第45和51號有4.4kb大小片段。
此外，對PCR產物進行了分離和測序，PCR產物測序結果與預計的片段序列完全一致，證實發生了同源重組。圖5B顯示了各片段的位置示意圖。
(2)檢測同源重組的Southern雜交1)特異性探針的選擇因neor基因在哺乳動物體內不存在，選擇neor基因片段作為探針。用Smal在構件1122bp和2294bp處各有一個位點，片段長1.2kb。用Smal酶切后回收1.2kb作為探針。
2)限制性內切酶的選擇選Sacl和Hpal雙酶切后做Southern雜交。因構件外β-酪蛋白3’序列有Hpal位點，同源重組后雙酶切片段長5.8kb；而隨機整合因tk基因沒有Hpal位點，雙酶切后片段大于7.4kb。
3)結果Southern雜交顯示有預計的5.8kb條帶。
上述各實驗證實了，本實施例獲得了定點打靶的單克隆成纖維細胞株。
實施例3 定點打靶單克隆細胞的克隆動物制備1材料與方法1.1. 試劑 均為胚胎級試劑，除另有說明外均為Sigma產品。
1.2 方法1.2.1 供質卵母細胞采集 奶山羊應用FSH按常規進行超數排卵，在注射LRH后29-30小時，采用手術回收卵母細胞，用含5％小牛血清(FCS，Gibco)的F-10(Gibco)培養液沖洗輸卵管。收集卵母細胞，透明質酸酶去除附著的顆粒細胞。收集的卵母細胞置于M16液中，37.5℃，5％的二氧化碳培養箱中培養。
1.2.2 供核細胞的饑餓處理 將獲得定點整合的單克隆細胞株，0.5％FCS饑餓72h后，一部分細胞凍存于-80℃冰箱，使用前四天復蘇(記為P1，再傳代記為P2，類推)，培養2-5天，再饑餓48小時，豐度在70-85％時用作供核細胞。
1.2.3 重構卵的構建及其激活1.2.3.1 重構卵的構建卵母細胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB7.5μg/ml)液中洗滌3次，在M16-Hepes中處理10min；同時將培養的細胞用胰酶消化、分散成單個細胞后立即加入小牛血清以終止消化，經500g離心2min后，去除上清，加入20μl M16-Hepes液。將卵母細胞與供核體細胞同時移入M16-Hepes中，在顯微鏡下將卵母細胞核去除后隨即將供核細胞移入卵周隙。移入供核細胞的卵在M16培養液中洗滌3次，置于M16液中，37℃培養30min后，進行電融合(0.3mM甘露醇、0.05mM CaCl2、0.1mM MgSO4、5％BSA)，融合條件為DC、140-160V/cm，脈沖持續時間為80μs，連續刺激二次。刺激后的卵置于M16培養液中培養20-30min觀察是否融合，融合卵為重構卵；未融合的重復一次。
1.2.3.2 重構卵的激活 重構卵在M16液中，37℃、5％CO2培養箱中培養5小時后，用含5μM離子霉素、7.5μg/ml細胞松弛素B(CB)、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes液處理5min，再在2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、7.5μg/ml CB、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes培養液中培養4-5小時。激活后的重構胚置于M16培養液中作短暫培養。
1.2.4 重構胚體內培 養應用手術的方法，將激活后的NT胚胎用1％的低熔點瓊脂糖包理后，吸入移卵管內，從輸卵管喇叭口處插入將卵移進輸卵管內，隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結扎。在體內培養6天后(不同種的動物培養的時間不同)，剪下輸卵管，用培養液沖出胚胎，觀察胚胎發育情況。
1.2.5 重構胚的移植 將發育至桑椹與囊胚期的重構胚移植到自然發情后第六天的受體羊子宮內(有黃體側)，共移植2-3枚。
1.2.6 受體羊妊娠檢查與產羔移植后的受體在1至2月齡時用B超進行妊娠檢查，出現孕囊的判定為懷孕。妊娠到期后，采用自然分娩或剖腹產術產羔、記錄羊羔的初生體重、性別及其它表型特征。
1.2.7 克隆羔羊的基因型鑒定羔羊的鑒定采用微衛星DNA-PCR擴增片段長度多態性(VNTR-PCR)方法分析。供檢樣品分別取自所有出生的定點整合克隆山羊、供核細胞、受體羊，其基因組DNA按照常規方法提取，濃度為200ng/μl。
山羊微衛星DNA引物選擇具有多態性的山羊微衛星DNA引物21對SRCRSP10，ILSTS 005、006、008、019、029、030、049、052、065、076、078、104，BM1258，ETH10，INRADERN172、175、192，INRA005、040、063(參見Vaiman D.，D，Mercier，K.Moazami-Goudarzi，A.Eggen，R.Ciampolini，A.Lepingle，R.Velmala，J.Kaukinen，S.L.Varvio，P.Martin，1994，A set of 99 cattlemicrosatellitescharacterization，synteny mapping，and polymophism，Mammalian Genome，5288-297等文獻)。PCR反應條件94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35℃ 30s，共35個循環，72℃ 10min，最后4℃保存。PCR產物用8％聚丙烯酰胺120V電泳，90min，0.5g/NIEB染色，照相。
1.2.8 克隆羔羊的外源基因的鑒定克隆羊的外源基因鑒定，通過檢測NEO基因進行。取克隆羔羊的耳組織，經蛋白酶K消化后，用通常的酚氯仿方法進行抽提，其DNA用水溶解，濃度為200ng/μl。
采用PCR反應的方法進行檢測，其設計如下引物GB4895’GAG GAG AAG GCT GCT GTT GC3’(SEQ ID NO30)GB8185’ATT TCC AAA GGA GTT CAG CAC3’(SEQ ID NO31)NE0935’CTC TGA TGC CGC CGT GTT CC3’(SEQ ID NO32)NE03315’CGG CAG GAG CAA GGT GAG ATG3’(SEQ ID NO33)引物濃度均為20μM。NE093，NE0331是在NEO基因上設計的引物。GB489，GB818是在山羊球蛋白基因上設計的引物，這一對引物作為內參。
反應條件95℃預熱5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，進行30個循環，然后72℃延伸10min。
PCR產物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳。NEO基因擴增片段長度為238bp，球蛋白基因擴增片段長度為329bp，含有NEO基因的樣品能同時擴增出NEO基因片段(238bp)和球蛋白基因片段(329bp)，而不含NEO基因的樣品只能擴增出球蛋白基因片段(329bp)。
2.結果本次試驗供投入羊數105頭，其中供質羊數84頭，寄母羊21頭；平均每只供體羊經超數排卵后獲9.3(785/84)枚，將卵細胞去核后再移入供核細胞，其移核率為92.3％(724/785)；移核卵經電刺激后融合率為78.67％(426/541)；將融合卵經瓊脂包埋后移入寄母輸卵管內培養6天再回收，其回收率為86.69％(469/541)；回收卵發育至桑椹與囊胚期的比率為56.29％(264/469)(圖6)；將發育的桑椹與囊胚期胚胎移入受體羊的子宮內，共移124頭植受體，至35日齡時，受體羊的妊娠率為38.7％。在妊娠35-40日齡時，取3只胎兒，性別均為雄性，并制備了胎兒成纖維細胞，凍存供進一步試驗。到2002年10月14日，妊娠到期產21只克隆羊，性別均為雄性，其中存活16只(圖7)。詳見表1。
存活的6只隆羊經外源基因檢測，均含有NEO基因。
表1、定點整合體細胞克隆試驗結果

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>通過Cre-LoxP定點打靶體細胞克隆家畜作為乳腺生物反應器的研制<130>026308<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6080<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6080)<223>酪蛋白5’同源臂<400>1cgcgaattca ctagtgattt tcacgcaaag atgggcacaa taaaggacag aaattttatg 60gaggagttgc tgatggagag ggaggcctgg cgcgctgcga ttcatggggt cgcaaagagt120cggacacaac tgagcgactg aattgaactg aactgaactg gacaaagcag aagatattaa180gaagaggtgg taagaataca cagaagaaca atataaaaaa gatcttcatg acccagataa240ccacgatgat gtgatcactc acctagagcc agacaccctg gaatgcaaag tcaagcggcc300ttagaaagcc tcactatgaa caaagctagt ggaggtgatg gaattccagt tgagctattt360caaatcttaa aaggtgatgc tgtgaaagtg ctgcactcaa tatgtcagca aatttggaaa420actcagcagt ggccacagga ctgccacaat cccaaagaaa agcaatgaca aagaatgttc480aaacacccac atgattgcac tcatctcaca tgctagcaaa ataactctca aaattctcca540agccaggctt caacagtacg tggaccatga acttccagat gttcaagctg gatttagaaa600aggcagagga accagagatc aaattgccaa catccattgg atcatcaaaa aagcacgaga660gttccagaaa aacatctgct ttattgacta cgctaaagcc tttgattgtg tggatcacaa720taaactgtgg aaaattcttc aagagatggg aataccagac cactttacct gcctcctgag780aaatctgtat gcaggtccag aagcagcagt tagaactgga catggaacaa cagactggtt840ccaaactgcg aaaggggtac atcaaggaat attcattgga aggattgatg ctgaagctga900aactcctata ctttggccac ctaatgtgaa gatctgactc attggaaaag actccaatgc960tgggaaagat tgaaggcagg agaagaggat gacagaggat gagatggttg gatgggatca 1020ctgactcaat ggacatgagt ttgagtaagc tccaggggtt ggtggtggac aggaaagcct 1080ggcgtgctgc agtccacaag gtcacaaaga ttcggacatg actgagtgac tgaactgata 1140ctgatgtgct caacaaatgt atcttgaact tgtgtgaagt tctatggtca catgtaaagg 1200aagaataatc aggattagct gtgtgtctta ggaatcaggg ttctgagttt tatgtgttca 1260tagtatctgc tggttcacaa aacatttttc ttattctctg gttcttgatt tactttataa 1320agtaatctta atagttatac ttcacataga taggaaatta ttatatttgg ataatctcat 1380ggaaaggatt aaatactcca tctatatgag taatgctgaa ctatctactc ctacctaata 1440atttgtcaga attcactaat tctgtgttat attgtttcta aatctgaatc attatatgaa 1500tcctcagtat tttgttttcc ttcctctata ttttggaatt tattaaacag tgcttcaaat 1560aatttttagg aaactgaagt ttttagtaac agctctatct ctaaatagct ttagtatctt 1620gaaaaagtaa tacaaattct cacatcctta atttcctctt ctctaaaata tctttaaaat 1680attctatgaa tgatatctct taatatttat ttttttggca atccaacaca gcttatggga 1740tcttagttcc ccagtggggg attatatcca tgccaactgc agtgaaagta caaaatccta 1800aactggactc accggggatt tcccaatatc tcctctagtt cttatttctg aatatttttg 1860gtccctttat tgtactcttc atccaacttt tctattgatt tctttcttga ggatattatt 1920tacttggttt cagctagaaa tatatgcaaa tctcaggact gcatattcca gattcattgg 1980ccaatatggg aaaaaacctt tggctgaaca aatcatgctt ataaaaaata gtactagagc 2040atcttacttt gactatatct tgctcctcat tcagggttat ctaatacaat ttccccatat 2100
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<221>misc_feature<222>(1)..(3234)<223>酪蛋白3’同源臂<400>4ggaacaacag caaacagagg taatttgttc actatgagta tattttgaga agtattatga 60aacataacac ataaaaagat ttataataat tatgttcagt ctaagaatgg taatataaat120gtcagtgtaa gaaatgaaaa ctttgacaaa atgaaaatat tttaaagata gaaacacatt180tttaaacaca taatcaaatt tcagagtata gaataaatac ccaagaataa ctactggtat240attcatttta ctaatggtat acctggtttt aataaatgca tattagtagg aacaattcca300gactagggac tgtgatcccc ttattctaat gatggatatg ctaatgaaag acagtagggt360gacagtgtgg cactaatcct catttgatca tttatcagct gtataacctt ggctccatgt420ttctctgtac atcattttct tcacctgtaa attgagaata ttcataatta cccagagttg480atgaactggc acacagtgac tattcaatgg ttttatatta tatttgatag ttttatactc540acatttatga atgtgtggag ttctaaaaag tatttccatt acccagatga gagaagtgag600gtacaaaaca attgagtata caaatgtgtg accataccac atagttatta attagcagaa660cttgcttaaa aataaggatt tggggacagc ataaaattct ttcattatat tactcttgtg720gtaacatatt tatctaattg tgatatttaa gctttcctgt tttagaattg aagattgatt780gtttggcact taggccaaat attttctaag tcaaaatgaa tttacaactt gatgccttta840aagactcaag attaccacct tctaccaaga gaagtagtgc tagaagctgg ccattgttaa900ggaactcctt gaattaaaaa aacacatatt aagacttaat ttccattaaa acaaacaaaa960ataaacctca gagtaacttt ttaagtcttt ttaaaataga tctttctttg ttatatgaaa 1020tcagtttgga ctattatcca aagtatgtag ctaccactct gcaggcaact caggaagagg 1080tggaataagt gttgaaatct ccaaaccctg atttcacttg actctctgat ttcacttgtg 1140aaggaagttg ggttaatgag aaatccttca gcgagcattt tactcattag tcttcatatg 1200accccaaaca atttcttaac taaaccaaat ggaagatttt ctttctctct cttcactgaa 1260ttatgtttta aaaagaggag gataattcat catgaataac aattataact ggattatgga 1320ctcaaagatt ttttttcctt ctttccagga tgaactccag gataaaatcc acccctttgc 1380ccaggcacag tctctagtct atcccttcac tgggcccatc cctaacagcc tcccacaaaa 1440catcctgcct cttactcaaa cccctgtggt ggtgccgcct ttccttcagc ctgaaataat 1500gggagtcccc aaagtgaagg agactatggt tcctaagcac aaagaaatgc ccttccctaa 1560
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<221>misc_feature<222>(1)..(2096)<223>TK基因序列<400>5gtggcggcct cgactgcttc atccccgtgg cccgttgctc gcgtttgctg gcggtgtccc 60cggaagaaat atatttgcat gtctttagtt ctatgatgac acaaaccccg cccagcgtct120tgtcattggc gaattcgaac acgcagatgc agtcggggcg gcgcggtccc aggtccactt180cgcatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta240acagcgtcaa cagcgtgccg cagatcttgg tggcgtgaaa ctcccgcacc tcttcggcaa300gcgccttgta gaagcgcgta tggcttcgta cccctgccat caacacgcgt ctgcgttcga360ccaggctgcg cgttctcgcg gccatagcaa ccgacgtacg gcgttgcgcc ctcgccggca420gcaagaagcc acggaagtcc gcctggagca gaaaatgccc acgctactgc gggtttatat480agacggtcct cacgggatgg ggaaaaccac caccacgcaa ctgctggtgg ccctgggttc540gcgcgacgat atcgtctacg tacccgagcc gatgacttac tggcaggtgc tgggggcttc600cgagacaatc gcgaacatct acaccacaca acaccgcctc gaccagggtg agatatcggc660cggggacgcg gcggtggtaa tgacaagcgc ccagataaca atgggcatgc cttatgccgt720gaccgacgcc gttctggctc ctcatatcgg gggggaggct gggagctcac atgccccgcc780cccggccctc accctcatct tcgaccgcca tcccatcgcc gccctcctgt gctacccggc840cgcgcgatac cttatgggca gcatgacccc ccaggccgtg ctggcgttcg tggccctcat900cccgccgacc ttgcccggca caaacatcgt gttgggggcc cttccggagg acagacacat960cgaccgcctg gccaaacgcc agcgccccgg cgagcggctt gacctggcta tgctggccgc 1020
gattcgccgc gtttacgggc tgcttgccaa tacggtgcgg tatctgcagg gcggcgggtc 1080gtggcgggag gattggggac agctttcggg gacggccgtg ccgccccagg gtgccgagcc 1140ccagagcaac gcgggcccac gaccccatat cggggacacg ttatttaccc tgtttcgggc 1200ccccgagttg ctggccccca acggcgacct gtacaacgtg tttgcctggg ccttggacgt 1260cttggccaaa cgcctccgtc ccatgcacgt ctttatcctg gattacgacc aatcgcccgc 1320cggctgccgg gacgccctgc tgcaacttac ctccgggatg gtccagaccc acgtcaccac 1380ccccggctcc ataccgacga tctgcgacct ggcgcgcacg tttgcccggg agatggggga 1440ggctaactga aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa 1500aaagacagaa taaaacgcac gggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg ggttcggtcc 1560cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt ggggccaata cgcccgcgtt 1620tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac 1680gtcggggcgg caagccctgc catagccacg ggccccgtgg gttagggacg gggtccccca 1740tggggaatgg tttatggttc gtgggggtta ttattttggg cgttgcgtgg ggtcaggtcc 1800acgactggac tgagcagaca gacccatggt ttttggatgg cctgggcatg gaccgcatgt 1860actggcgcga cacgaacacc gggcgtctgt ggctgccaaa cacccccgac ccccaaaaac 1920caccgcgcgg atttctggcg ccgccggacg aactaaacct gactacggca tctctgcccc 1980ttcttcgctg gtacgaggag cgcttttgtt ttgtattggt caccggtatc gataagctag 2040cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatggtac cagcggccgc gtcgac 2096<210>6<211>19<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6ttcacgcaaa gatgggcac 19<210>7<211>23<212>DNA<213>寡核苷酸<400>7gtcttggatt gcttagaaaa ccc 23<210>8<211>22<212>DNA<213>寡核苷酸<400>8ggaagctctt aggtaacatt gc 22<210>9<211>39<212>DNA<213>寡核苷酸<400>9cctaggcccg ggctcgagtc ctgtgaatgg gaagatgag39<210>10<211>34<212>DNA<213>寡核苷酸<400>10cctaggcgga tccaggaaca acagcaaaca gagg 34<210>11<211>19
<212>DNA<213>寡核苷酸<400>11gccatatttc cagtcgcag 19<210>12<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸<400>12ggcctgtcga cctcgagccg cggcagctgg gtaccagcgg ccgcg 45<210>13<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸<400>13tcgacgcggc cgctggtacc cagctgccgc ggctcgaggt cgaca 45<210>14<211>41<212>DNA<213>寡核苷酸<400>14ctcgagataa cttcgtatag catacattat acgaagttat c 41<210>15<211>40<212>DNA<213>寡核苷酸<400>15tcgagataac ttcgtatacg tatgtatata cgaagttatc 40<210>16<211>113<212>DNA<213>寡核苷酸<400>16tcatacgctg tttcctcatc ttcccattca caggacctcg agataacttc gtatagcata 60cattatacga agttatcctc gagcatgcat ctagagggcc ctattctata gtg 113<210>17<211>56<212>DNA<213>寡核苷酸<400>17atgtctgtat accgtcgagc ccgggcctag ggcggatcca ggaacaacag caaaca 56<210>18<211>55<212>DNA<213>寡核苷酸<400>18gactggaaat atggcaatcg aattcccgcg gtggcggcct cgactgcttc atccc 55<210>19
<211>2182<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2182)<223>LoxP-HLF基因序列<400>19gagctctcga gataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatcatga aacttgtctt 60cctcgtcctg ctgttcctcg gggccctcgg actgtgtctg gctggccgta ggagaaggag120tgttcagtgg tgcaccgtat cccaacccga ggccacaaaa tgcttccaat ggcaaaggaa180tatgagaaga gtgcgtggcc ctcctgtcag ctgcataaag agagactccc ccatccagtg240tatccaggcc attgcggaaa acagggccga tgctgtgacc cttgatggtg gtttcatata300cgaggcaggc ctggccccct acaaactgcg acctgtagcg gcggaagtct acgggaccga360aagacagcca cgaactcact attatgccgt ggctgtggtg aagaagggcg gcagctttca420gctgaacgaa ctgcaaggtc tgaagtcctg ccacacaggc cttcgcagga ccgctggatg480gaatgtgcct atagggacac ttcgtccatt cttgaattgg acgggtccac ctgagcccat540tgaggcagct gtggccaggt tcttctcagc cagctgtgtt cccggtgcag ataaaggaca600gttccccaac ctgtgtcgcc tgtgtgcggg gacaggggaa aacaaatgtg ccttctcctc660ccaggaaccg tacttcagct actctggtgc cttcaagtgt ctgagagacg gggctggaga720cgtggctttt atcagagaga gcacagtgtt tgaggacctg tcagacgagg ctgaaaggga780cgagtatgag ttactctgcc cagacaacac tcggaagcca gtggacaagt tcaaagactg840ccatctggcc cgggtccctt ctcatgccgt tgtggcacga agtgtgaatg gcaaggagga900tgccatctgg aatcttctcc gccaggcaca ggaaaagttt ggaaaggaca agtcaccgaa960attccagctc tttggctccc ctagtgggca gaaagatctg ctgttcaagg actctgccat 1020tgggttttcg agggtgcccc cgaggataga ttctgggctg taccttggct ccggctactt 1080cactgccatc cagaacttga ggaaaagtga ggaggaagtg gctgcccggc gtgcgcgggt 1140cgtgtggtgt gcggtgggcg agcaggagct gcgcaagtgt aaccagtgga gtggcttgag 1200cgaaggcagc gtgacctgct cctcggcctc caccacagag gactgcatcg ccctggtgct 1260gaaaggagaa gctgatgcca tgagtttgga tggaggatat gtgtacactg caggcaaatg 1320tggtttggtg cctgtcctgg cagagaacta caaatcccaa caaagcagtg accctgatcc 1380taactgtgtg gatagacctg tggaaggata tcttgctgtg gcggtggtta ggagatcaga 1440cactagcctt acctggaact ctgtgaaagg caagaagtcc tgccacaccg ccgtggacag 1500gactgcaggc tggaatatcc ccatgggcct gctcttcaac cagacgggct cctgcaaatt 1560tgatgaatat ttcagtcaaa gctgtgcccc tgggtctgac ccgagatcta atctctgtgc 1620tctgtgtatt ggcgacgagc agggtgagaa taagtgcgtg cccaacagca atgagagata 1680ctacggctac actggggctt tccggtgcct ggctgagaat gctggagacg ttgcatttgt 1740gaaagatgtc actgtcttgc agaacactga tggaaataac aatgaggcat gggctaagga 1800tttgaagctg gcagactttg cgctgctgtg cctcgatggc aaacggaagc ctgtgactga 1860ggctagaagc tgccatcttg ccatggcccc gaatcatgcc gtggtgtctc ggatggataa 1920ggtggaacgc ctgaaacagg tgctgctcca ccaacaggct aaatttggga gaaatggatc 1980tgactgcccg gacaagtttt gcttattcca gtctgaaacc aaaaaccttc tgttcaatga 2040caacactgag tgtctggcca gactccatgg caaaacaaca tatgaaaaat atttgggacc 2100acagtatgtc gcaggcatta ctaatctgaa aaagtgctca acctcccccc tcctggaagc 2160ctgtgaattc ctcaggaagt aa2182<210>20<211>3301<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3301)<223>Hyg-LoxP基因序列
<400>20cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt120aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta180tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg240gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga300cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt360tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg420gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc480cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg540taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat600aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac660gactcactat agggagaccc aagcttggta ccgagctcgg atccactagt aacggccgcc720agtgtgctgg aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct780caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga840tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg tcagaaaaga900caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga gatctggcca tacacttgag960tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaactgca 1020ggtcgagcat gcatctaggg cggccgcact agaggaattc cgcccctctc cctccccccc 1080ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgtgtttg tctatatgtg 1140attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1200cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1260tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1320cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1380tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1440tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtagtcaac aaggggctga aggatgccca 1500gaaggtaccc cattgtatgg gaatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 1560tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt 1620gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc cgtaccaaag atggatagat ccggaaagcc 1680tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga 1740cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg 1800tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta 1860tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag 1920cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc 1980tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcaccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg 2040gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac 2100actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact 2160gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg 2220gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc 2280ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat 2340tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag 2400cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg 2460tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat 2520gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc 2580gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta 2640ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga atagagtaga 2700tgccgaccga acaagagctg atttcgagaa cgcctcagcc agcaactcgc gcgagcctag 2760caaggcaaat gcgagagaac ggccttacgc ttggtggcac agttctcgtc cacagttcgc 2820taagctcgct cggctgggtc gcgggagggc cggtcgcagt gattcaggcc cttctggatt 2880gtgttggtcc ccagggcacg attgtcatgc ccacgcactc gggtgatctg actgatcccg 2940cagattggag atcgccgccc gtgcctgccg attgggtgca gatctagagc tcgctgatca 3000gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 3060ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 3120cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 3180gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 3240
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<210>28<211>30<212>DNA<213>寡核苷酸<400>28ggctaagggt taatttattg aaatgactgg 30<210>29<211>26<212>DNA<213>寡核苷酸<400>29gctccttcta gttgtaacac tagtcc 26<210>30<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>30gaggagaagg ctgctgttgc20<210>31<211>21<212>DNA<213>寡核苷酸<400>31atttccaaag gagttcagca c 21<210>32<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>32ctctgatgcc gccgtgttcc20<210>33<211>21<212>DNA<213>寡核苷酸<400>33cggcaggagc aaggtgagat g 21<210>34<211>28<212>DNA<213>寡核苷酸<400>34ggggtaccct gcttcatccc cgtggccc 28<210>35<211>36<212>DNA<213>寡核苷酸<400>35ataagaatgc ggccgctcta gaactagtgg atcccc 3權利要求
1.一種定點打靶體細胞克隆家畜乳腺生物應器的制備方法，其特征在于，包括步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物從5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因、和3′同源臂序列；(b)篩選得到LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞；(c)將打靶載體與Cre表達質粒/Cre蛋白，共轉染LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞，所述的打靶載體從5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二標記基因、LoxP序列，并篩選得到定點整合有外源基因的成纖維細胞；(d)將步驟(c)的成纖維細胞的細胞核，移植入家畜去核卵母細胞，再生成克隆動物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)和(c)之間，還包括以下步驟(i)將步驟(b)的成纖維細胞的細胞核，核移植入家畜去核卵母細胞，再生成克隆動物；以及(ii)從步驟(i)的克隆動物獲取LoxP序列定點整合的克隆家畜胎兒成纖維細胞。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家畜選自下組牛、羊、豬、兔。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的標記基因選自下組neo基因、hygro基因，并且在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游還含有負篩選標記基因。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5′和3′同源臂序列選自下組β-乳球蛋白基因組序列、αsl-酪蛋白基因組序列、β-酪蛋白基因組序列。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，各同源臂序列的長度為2-10kb。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5′同源臂序列含有乳腺特異性表達基因的5′非翻譯區和/啟動子，或者所述的外源基因帶有乳腺特異性表達調控序列。
8.一種家畜胎兒成纖維細胞，其特征在于，在所述細胞的基因組中定點插入有一構建物，其中插入位點是選自下組的基因區域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述構建物基本上由LoxP序列和標記基因構成，或者所述的構建物基本上由LoxP序列、外源基因和標記基因構成。
9.一種制備家畜成纖維細胞的方法，所述的成纖維細胞的β-酪蛋白基因位點定點插入LoxP序列，其特征在于，該方法包括步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物含有從5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一標記基因和3′同源臂序列；(b)篩選得到LoxP序列定點整合的家畜胎兒成纖維細胞。
10.一種轉基因的非人哺乳動物，其特征在于，在該動物的細胞基因組中定點插入有一構建物，其中插入位點是選自下組的基因區域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述構建物基本上由LoxP序列和標記基因構成，或者所述的構建物基本上由LoxP序列、外源基因和標記基因構成。
全文摘要
本發明公開了一種通過Cre－LoxP定點打靶體細胞克隆家畜來制備作為乳腺生物反應器的方法。它包括(a)將含LoxP序列的構建物定點引入成纖維細胞；(b)篩選LoxP序列定點整合的細胞；(c)將含外源基因的打靶載體與Cre表達質粒/Cre蛋白，共轉染LoxP序列定點整合的細胞，從而篩選得到定點整合外源基因的細胞；(d)再生成克隆動物。本發明還提供了相應的構建物和克隆細胞。本發明方法可高效地制備定點整合外源基因的乳腺生物反應器。
文檔編號C12N15/87GK1502694SQ0214543
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月20日 優先權日2002年11月20日
發明者成國祥, 陳建泉, 吳國祥, 湯家銘, 趙建陽 申請人:上海杰隆生物工程股份有限公司