專利名稱：微生物中可誘導(dǎo)型基因的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過誘導(dǎo)mRNA表達并檢測誘導(dǎo)的mRNA，來檢測微生物，特別是分枝桿菌屬(Mycobacterium)生長緩慢的細(xì)菌存在的方法。
背景技術(shù)：
盡管存在有效的抗菌療法，結(jié)核病仍然是世界上致病和致死的主要根源，并越來越遍及全世界。結(jié)核性腦膜炎的早期診斷和治療的迅速啟動改善了這種疾病的后果，但是通過常規(guī)方法檢測腦脊髓液(CSF)中的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)始終是一個挑戰(zhàn)。診斷分枝桿菌的挑戰(zhàn)在于結(jié)核分枝桿菌生物體數(shù)量少并且生長緩慢，從而限制了采用耐酸染色和培養(yǎng)技術(shù)檢測(Molavi A和J.L.Lefrock.，Med.Clin.North.Am.69315-331.1985)。
幾個研究小組已描述了用于靈敏并特異性檢測臨床樣本中結(jié)核分枝桿菌的PCR分析。通過PCR擴增特異性靶核酸序列直接鑒定臨床樣本中的分枝桿菌具有在感染的同一天診斷的能力。已將PCR技術(shù)應(yīng)用于實際臨床樣本，但是受可檢測樣本量小、臨床樣本中存在的生物體量低、由于污染導(dǎo)致假陽性和存在PCR抑制劑等方面限制(Kox等，J.Clin Micro32672-678，1994)。
檢測的預(yù)測值極大地依賴于研究的臨床樣品中陽性結(jié)核分枝桿菌樣本的發(fā)生率。Grosset和Mouton建議在PCR技術(shù)充分可靠并且存在內(nèi)部和外部質(zhì)量控制程序前，不應(yīng)將PCR用于結(jié)核病的日常診斷(Grosset J.和Y Mouton.，Tubercle Lung dis 76183-184，1995)。在一次國際合作質(zhì)量控制研究中，30個實驗室中只有5個實驗室正確地鑒定出所有20個樣本中存在或不存在分枝桿菌DNA(Noordhoek G.T.J.Clin.Microbiology 342522-2525.1996)。該研究還顯示缺乏特異性是比缺乏靈敏性更主要的問題。目前，基于擴增的檢測技術(shù)還沒有替代常規(guī)診斷技術(shù)(Piersimoni等，363601-3604，1998，J.Clin Microbioogy；另參見Piersimoni等，35193-196，1997，J.Clin Microbioogy)。
副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium paratubreculosis)是一種慢性腸道病原菌，其可感染包括靈長類的許多不同的動物種類(Chiodini等，Comell Vet.74218-262，1984)。在100年前該生物體作為德國牛的腸道慢性炎癥的病因首次鑒定出來。動物中約內(nèi)氏病或副結(jié)核病的分類特征是感染的腸道中存在數(shù)百萬桿菌型耐酸分枝桿菌及巨噬細(xì)胞而很少有另外的炎性細(xì)胞浸潤。副結(jié)核分枝桿菌很難以來自這些動物的桿菌形式培養(yǎng)。動物中的多桿菌-少微生物型的副結(jié)核病的臨床病理學(xué)譜令人想起人類中以瘤型麻風(fēng)和結(jié)核樣麻風(fēng)為代表的極其嚴(yán)重的情況。近年來由于實驗室中通過常規(guī)培養(yǎng)來鑒定這種物質(zhì)不時遇到極大困難，所以極大地延緩了我們對結(jié)核分枝桿菌及由它引起的疾病的理解進程(Chiodini等，Clin.Microbiol.Rev.290-117，1989)。在英國尤其在高峰期，零售消毒牛奶中存在殘留的結(jié)核分枝桿菌是非常危險的。
因此，仍然需要檢測分枝桿菌屬，特別是檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏、特異的方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測待測樣本中微生物存在的方法，該方法包括將待測樣本暴露于能誘導(dǎo)所述微生物中至少一個基因表達的誘導(dǎo)物下并檢測從暴露于所述誘導(dǎo)物而被誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的存在。
在一個優(yōu)選實施方式中，所述微生物可以為生長緩慢的細(xì)菌。優(yōu)選生長緩慢的細(xì)菌包括，例如，疏螺旋體屬(Borreliae)、片球菌屬(Pediococcus)、支原體屬(Mycoplasma)、和分枝桿菌屬的株系。
最優(yōu)選本方法用于檢測分枝桿菌屬，特別是結(jié)核分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌(如鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(M.avium subsp.paratuberculosis))和牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
懷疑含有微生物的“待測樣本”通常主要是取自用于檢測所述微生物存在的個體的臨床樣本。
檢測特異性mRNA序列存在優(yōu)選對從待測樣本中分離的核酸制備物進行檢測。該核酸制備物必須包含mRNA，然而，根據(jù)用于檢測特異性mRNA存在的技術(shù)的特征，該核酸制備物沒有必要是純化的聚腺苷酸化mRNA制備物，并且，整個RNA制備物甚至同時含有RNA和基因組DNA的整個核酸制備物也適于作為起始原料。實質(zhì)上，本領(lǐng)域已知的用于分離包含mRNA的核酸制備物的任何技術(shù)可以用于從待測樣本分離核酸。優(yōu)選的技術(shù)為US-A-5,234,809和EP-B-0389,063中描述的“Boom”分離方法。該方法可以用于分離同時含有RNA和DNA的核酸制備物，其基于在離液劑硫氰酸胍(GuSCN)存在下，二氧化硅顆粒的核酸結(jié)合特性。
在一個優(yōu)選實施方式中，檢測從暴露于誘導(dǎo)物而被誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA存在的步驟包括進行擴增反應(yīng)以擴增全長或部分mRNA并檢測擴增反應(yīng)的特異性產(chǎn)物。更優(yōu)選地，擴增反應(yīng)為反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或依賴核酸序列的擴增(NASBA)。
本領(lǐng)域熟知將RT-PCR用于檢測特異性mRNA序列。可以在標(biāo)準(zhǔn)課本中找到進行RT-PCR并檢測RT-PCR反應(yīng)的特異性產(chǎn)物的方法，例如PCR方案方法和應(yīng)用指南(PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications)，Eds Innis等，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，圣地亞哥，加利福尼亞，1990；生物分析中的PCR分子生物學(xué)方法(PCR inBioanalysisMethods in Molecular Biology)，卷92，S.J.Smeltzer編輯，Humana出版社，Totowa，NJ.，1998)。NASBA是擴增RNA的相對新的方法(參見Compton，自然(Nature)，35091-92(1991))。NASBA是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，并且描述于，例如US-A-5,409,818中。NASBA是體外大量產(chǎn)生靶RNA序列的有效方法，其可以檢測原待測樣本中存在的濃度非常低的靶RNA序列。
NASBA方法是基于使用與PCR的引物組合類似的引物組合，但一個引物用啟動子序列，如T7啟動子修飾。已顯示NASBA擴增的靈敏性和特異性與PCR相同并且比多數(shù)RT-PCR方案更好。由于NASBA方法是一種等溫分析且依賴RNA酶H，所以它不能用于擴增DNA。
NASBA優(yōu)選按照如下步驟進行(a)組裝反應(yīng)混合物，該混合物包含適用于通過NASBA擴增靶微生物mRNA一段區(qū)域的NASBA P1和NASBA P2引物對(見下)、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體的RNA鏈而不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識別NASBA P1引物中存在的啟動子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸；(b)在允許NASBA擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件下將反應(yīng)介質(zhì)與從懷疑含有微生物的待測樣本中分離的核酸制備物一起溫育；并且(c)檢測和/或定量測定NASBA擴增反應(yīng)的任何微生物特異性產(chǎn)物。
可采用許多不同的方法檢測NASBA反應(yīng)的特異性產(chǎn)物(即，靶RNA的正義和/或反義拷貝)。在一個方法中，可使用能特異性退火于NASBA產(chǎn)物的靶特異性雜交探針來檢測NASBA產(chǎn)物。所述雜交探針可結(jié)合于顯色標(biāo)記，例如熒光、發(fā)光、放射性或化學(xué)發(fā)光化合物或酶標(biāo)記或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它類型的標(biāo)記。這些標(biāo)記的精確特性并不是特別關(guān)鍵，但是它應(yīng)該能夠通過其本身或與一種或多種額外物質(zhì)結(jié)合(如酶的底物)，產(chǎn)生外源方法可檢測的信號。
所謂的“實時NASBA”也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該方法可以在反應(yīng)的過程中，持續(xù)監(jiān)測NASBA反應(yīng)產(chǎn)物的形成。如WO95/13399所述，這可通過采用“分子標(biāo)燈”探針完成，所述的分子標(biāo)燈探針包含能夠退火于NASBA產(chǎn)物的靶特異性序列、形成發(fā)夾的寡核苷酸序列和一對熒光劑/淬滅劑。以下將更詳細(xì)地描述分子標(biāo)燈技術(shù)。如果在擴增之前將分子標(biāo)燈探針加入反應(yīng)混合物中，其可以實時監(jiān)測NASBA產(chǎn)物的形成(參見Leone等，核酸研究(Nucleic Acids Research)，1998，卷26，2150-2155)。
在進一步的方法中，如下所述，分子標(biāo)燈技術(shù)可與一個NASBA擴增中使用的寡核苷酸引物結(jié)合，以利于實時監(jiān)測NASBA反應(yīng)而不需要單獨的雜交探針。
在更進一步的方法中，可以采用一種通用的已標(biāo)記檢測探針監(jiān)測NASBA反應(yīng)產(chǎn)物，該探針可與引物2的5’端的核苷酸序列雜交。這與Organon Teknika提供的“NucliSensTM”檢測系統(tǒng)等同。在該系統(tǒng)中，可采用靶特異性捕獲探針獲得針對靶mRNA的NASBA產(chǎn)物的特異性，所述的靶特異性捕獲探針包含如本文所述與固體支撐物例如磁性微珠結(jié)合的探針寡核苷酸。最優(yōu)選地，通用的帶有標(biāo)記的檢測探針是由OrganonTeknika提供的ECLTM檢測探針。NASBA復(fù)制子與HPV-特異性捕獲探針和通用的ECL探針雜交(通過引物2的互補序列)。雜交后，微珠/復(fù)制子/ECL探針復(fù)合體可被捕獲在自動ECL讀數(shù)器的磁電極上(如Organon Teknika提供的NucliSensTM讀數(shù)器)。隨后，電壓脈沖引發(fā)ECLTM反應(yīng)。
“被誘導(dǎo)的基因或多個基因”可以是能被外界刺激如化學(xué)試劑或環(huán)境變化誘導(dǎo)的任何基因。一個或多個基因表達的誘導(dǎo)及隨后特異性檢測至少一個誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄本增加了擴增的水平，因此與依賴mRNA表達而沒有誘導(dǎo)步驟的檢測方法相比提高了靈敏性。
實質(zhì)上，“誘導(dǎo)物”可以是任何能誘導(dǎo)靶微生物種類中一個或多個基因表達的物質(zhì)。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境刺激，如，暴露于特定波長的光下。
將需要檢測微生物存在的待測樣本暴露于誘導(dǎo)物一段時間以足以誘導(dǎo)產(chǎn)生期望的基因表達。所需要的精確暴露時間將根據(jù)誘導(dǎo)物和被誘導(dǎo)的靶基因的特性而變化。對于任何給定的誘導(dǎo)物/基因組合可通過例行試驗依照經(jīng)驗決定。在暴露于誘導(dǎo)物之后，可如上所述，從待測樣本中分離核酸。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種檢測微生物的方法，該方法基于將待測樣本暴露于氧或過氧化氫來誘導(dǎo)編碼過氧化物歧化酶的基因的表達，然后檢測與該基因?qū)?yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在。該方法優(yōu)選用于檢測分枝桿菌屬，更有利于結(jié)核分枝桿菌或副結(jié)核分枝桿菌，但也適用于檢測任何具有過氧化物歧化酶基因的微生物，其中由于暴露于氧或過氧化氫而誘導(dǎo)該基因的表達。在結(jié)核分枝桿菌中將編碼過氧化物歧化酶的基因表示為sodA(GenBank登記號AF061030；SEQ ID NO57和58)。在鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種中，將編碼過氧化物歧化酶的基因表示為sod(GenBank登記號AF180816；SEQ ID NO59和60)。其它種類微生物的SodA/sod同系物也可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法鑒定，例如通過檢索可公開獲得的序列數(shù)據(jù)庫和/或通過直接篩選基因組DNA。
檢測與過氧化物歧化酶基因?qū)?yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本存在的步驟可通過采用RT-PCR或NASBA擴增全長或部分mRNA并檢測過氧化物歧化酶特異性擴增產(chǎn)物來完成。
下面給出了用RT-PCR或NASBA擴增SodA mRNA的適合的引物組合。這些引物組合可用于檢測所有分枝桿菌屬的種，但特別適用于檢測結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。
用于NASBA檢測的引物組合包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物和包含SEQID NO25的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO61的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO62的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO64的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO65的NASBA P2引物；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-85；引物4-92和包含SEQ ID NO64的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-91；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-103；引物4-122和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-115；用于RT-PCR檢測的引物組合包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物；包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物；包含SEQ ID NO61的PCR引物和包含SEQ ID NO62的PCR引物；或包含SEQ ID NO64的PCR引物和包含SEQ ID NO65的PCR引物。
在每種情況下，“SEQ ID NOs”指表1中列出的序列，“引物號”指表2列出的引物。
如下所述，本發(fā)明還提供使用這些特異性引物組合，適用于進行檢測NASBA和RT-PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的探針寡核苷酸。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供一種檢測微生物的方法，該方法基于將待測樣本暴露于化學(xué)誘導(dǎo)物而誘導(dǎo)pncA基因的表達，所述化學(xué)誘導(dǎo)物可以是異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或吡嗪酰胺，然后檢測與pncA基因?qū)?yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在。本方法也優(yōu)選用于檢測分枝桿菌屬。結(jié)核分枝桿菌pncA的完整cDNA序列可在GenBank登記號U59967獲得(也可參見SEQ ID NO98和99)。其它種類微生物的pncA同系物也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法鑒定。
再次，檢測與pncA基因?qū)?yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本存在的步驟可通過采用RT-PCR或NASBA擴增全長或部分mRNA并檢測pncA-特異性擴增產(chǎn)物來完成。
下面給出了特異性用于通過RT-PCR或NASBA擴增結(jié)核分枝桿菌pncA mRNA的適合的引物組合。
用于NASBA檢測的引物組合包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物；引物4-2和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-1；引物4-8和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-7；或引物4-14和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-15。
用于RT-PCR檢測的引物組合包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；或包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物。
本發(fā)明進一步提供了通過RT-PCR或NASBA檢測分枝桿菌屬，特別是檢測分枝桿菌屬的靶特異性引物和寡核苷酸探針。
特別地，本發(fā)明提供了引物和探針寡核苷酸，其包含表1中如SEQ IDNO1到42，61到69和74到97所示的序列。
表1-引物和探針中包含的分枝桿菌特異性序列



關(guān)鍵詞X1代表包含啟動子的核苷酸序列。適于用作NASBA P1引物的寡核苷酸具有通用的結(jié)構(gòu)“X1-序列(X1-SEQ)”，其中“X1”代表包含啟動子的核苷酸序列，“序列(SEQ)”代表所附序列表中指定的靶特異性序列(SEQ ID NO)。如下所述，NASBA P1引物中必須包含啟動子序列但PCR引物中并不是必須的。在一個優(yōu)選實施方式中，X1可以是包含T7啟動子的序列，最優(yōu)選序列AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAGAAGG。
X2和X3代表熒光劑和淬滅劑，當(dāng)將這兩部分保持在近距離時，該淬滅劑能基本上或完全地淬滅來自熒光劑的熒光。
nt-表示在相關(guān)cDNA序列上的位置。
本發(fā)明進一步提供表2列出的寡核苷酸，這些為加入特定啟動子序列的NASBA P1引物和加入結(jié)合通用檢測探針的序列的NASBA P2引物(見下)，用于采用NASBA檢測分枝桿菌屬的種系。然而，并不意味著本發(fā)明的范圍應(yīng)該限制于這些特異性分子。
表2

本發(fā)明提供的寡核苷酸引物和探針可歸納為幾個類型。第一種寡核苷酸類型是NASBA P1引物，其一般為大約50個堿基長的寡核苷酸，在3’端含有與靶mRNA一段區(qū)域互補的平均大約20個堿基。表1中的“NASBA P1/PCR”表示適合用作NASBA P1引物的寡核苷酸。P1引物寡核苷酸的5’端(在此通常用術(shù)語X1代表)包含可被特異性RNA聚合酶識別的啟動子序列。因為噬菌體啟動子，例如T7、T3和SP6啟動子，僅依賴適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶的結(jié)合即可提供高水平的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選將它們用于本發(fā)明的寡核苷酸中。在一個優(yōu)選實施方式中，P1引物寡核苷酸的5’端序列可包含序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGG。該序列包含一個T7啟動子，T7啟動子包含T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點。在表1中以“NASBA P1/PCR”表示的分枝桿菌特異性序列適合在NASBA P1引物和標(biāo)準(zhǔn)PCR引物中使用。當(dāng)使用這些序列作為NASBA P1引物的基礎(chǔ)時，它們具有通用的結(jié)構(gòu)“X1-SEQ”，其中“X1”代表包含啟動子的序列，SEQ代表靶特異性序列。啟動子序列X1在NASBA P1引物中是必須的。然而，當(dāng)使用同樣的序列作為標(biāo)準(zhǔn)PCR引物的基礎(chǔ)時，并不是必須包含X1。相應(yīng)地，權(quán)利要求中使用的短語“序列號”也這樣理解。
為避免疑惑，短語“包含SEQ ID NO1的NASBA P1引物”理解為在SEQ ID NO1列出的分枝桿菌特異性序列的5’端要求存在X1序列，而短語“包含SEQ ID NO1的PCR引物”表示包含分枝桿菌特異性序列的任何合適的PCR引物，X1并不是PCR引物的本質(zhì)特征。
本發(fā)明提供的第二種寡核苷酸類型是NASBA引物2寡核苷酸，其一般包含與靶mRNA一段區(qū)域基本上相同的大約20個堿基的序列。在表1中以“NASBA P2/PCR”表示的寡核苷酸序列適合在NASBA P2引物和標(biāo)準(zhǔn)PCR引物中使用。在特殊的但非限定的實施方式中，欲用作NASBA P2引物的寡核苷酸，在5’端進一步包含一段核苷酸序列，該核苷酸序列與靶mRNA無關(guān)但能夠與一個通用的檢測探針雜交。優(yōu)選用熒光、發(fā)光或酶標(biāo)記物標(biāo)記該檢測探針。在一個實施方式中，可用ECLTM技術(shù)檢測的標(biāo)記物標(biāo)記檢測探針，但是應(yīng)意識到本發(fā)明決不是限定于這個特定的檢測方法。在一個優(yōu)選實施方式中，引物2寡核苷酸的5’端可含有序列GATGCAAGGTCGCATATGAG。該序列能夠與從OrganonTeknika商購的通用ECLTM探針雜交，該探針具有下列結(jié)構(gòu)Ru(bpy)32+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3’在另一個實施方式中，為了實時監(jiān)測NASBA反應(yīng)，可將引物2寡核苷酸與“分子標(biāo)燈”技術(shù)結(jié)合，“分子標(biāo)燈”技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并由Tyagi和Kramer描述于如WO 95/13399，Nature Biotechnology，14303-308，1996中。
本發(fā)明提供的第三種寡核苷酸類型是靶特異性探針寡核苷酸(在表1表示為“探針”)。該探針寡核苷酸一般包含與靶mRNA一段區(qū)域基本上相同的大約20-25個堿基的序列。該探針寡核苷酸可作為靶特異性雜交探針用于檢測NASBA或PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。就此而論，可將探針寡核苷酸與一個固體支撐物如順磁珠結(jié)合以形成捕獲探針(見下)。在一個優(yōu)選實施方式中探針寡核苷酸的5’端可用生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記物的加入可促進探針通過生物素/鏈霉抗生物素或生物素/抗生物素蛋白的聯(lián)接結(jié)合于固體支撐物上。
本發(fā)明提供的第四種寡核苷酸類型(在表1表示為“MB探針”)是結(jié)合“分子標(biāo)燈”技術(shù)的靶特異性探針，該技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并由Tyagi和Kramer描述于如Nature Biotechnology，14303-308，1996和WO95/13399中。采用分子標(biāo)燈技術(shù)可對擴增反應(yīng)如NASBA或RT-PCR反應(yīng)進行實時監(jiān)測。
除靶特異性序列以外，分子標(biāo)燈探針一般還包含可形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的其它堿基、熒光劑和淬滅劑，其中在本文中熒光劑和淬滅劑用符號X2和X3表示。熟知技術(shù)的讀者將意識到，選擇熒光劑和淬滅劑以使當(dāng)將這兩部分保持在近距離時，例如不存在靶序列時，探針處于發(fā)夾“關(guān)閉”構(gòu)象時，淬滅劑能基本上或完全地淬滅來自熒光劑的熒光。表1中顯示的分子標(biāo)燈探針在5’和3’末端加入互補的側(cè)翼序列，該側(cè)翼序列在分枝桿菌特異性序列的側(cè)翼并能夠雜交以形成莖雙鏈體。除了要求該側(cè)翼序列在探針不結(jié)合靶HPV序列時能形成莖雙鏈體外，其具體的核苷酸序列并不是本發(fā)明的實質(zhì)。因此，熟知技術(shù)的讀者將意識到在不影響實質(zhì)范疇內(nèi)分子標(biāo)燈探針的功能下，這些序列可以變化。可使用表1中表示為“探針”的任何序列加入合適的互補側(cè)翼序列和熒光劑及淬滅劑作為分子標(biāo)燈探針的基礎(chǔ)。
本領(lǐng)域已知許多適合用于分子標(biāo)燈探針的淬滅劑/熒光劑組合的例子(參見WO 95/13399，Tyagi和Kramer，ibid)。可使用許多不同顏色的熒光團，包括如5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、熒光素、FAM和得克薩斯紅(參見Tyagi、Bratu和Kramer，1998，Nature Biotechnology，16，49-53)。使用不同顏色熒光團標(biāo)記的探針可進行“多重”檢測，在單個反應(yīng)管中檢測兩個或多個不同的探針。一個優(yōu)選的淬光劑是苯甲酸4-(4’-二甲基氨苯氮基)苯甲酸(DABCYL)，其為非熒光發(fā)色團，用作大范圍熒光團的“萬用”淬光劑。熒光劑和淬光劑可以采用某種方向共價地結(jié)合到探針上，熒光劑在5’端或接近5’端、淬光劑在3’端或接近3’端或者反之亦然。本領(lǐng)域已知用于合成分子標(biāo)燈探針的方法。Sanjay Tyagi等，(分子遺傳學(xué)系(Department of Molecular Genetics)，公共健康研究所(Public Health Research Institute)，455第一大街，紐約，NY 10016，美國)在一篇名為“分子標(biāo)燈用于檢測均質(zhì)溶液中核酸的雜交探針”的文章中提供了合成的具體方法，可通過PHRI網(wǎng)站在線獲得(www.phri.nyu.edu或www.molecularbeacons.org)。
可使用適當(dāng)?shù)囊?和引物2寡核苷酸分子的組合通過NASBA檢測靶mRNA。為了驅(qū)動NASBA擴增反應(yīng)，引物1和引物2寡核苷酸必須能從mRNA的靶區(qū)域啟動雙鏈DNA的合成。為此，引物1和引物2寡核苷酸必須包含分別能與靶mRNA正義和反義鏈區(qū)域互補的靶特異性序列。
在NASBA擴增循環(huán)的第一個時期，所謂的“非循環(huán)”期，引物1寡核苷酸退火于靶mRNA的互補序列并且它的3’端在依賴RNA的DNA聚合酶(例如反轉(zhuǎn)錄酶)作用下延伸以合成第一鏈cDNA。隨后將得到的RNA:DNA雜合體的RNA鏈消化，如通過RNA酶H的作用，以釋放單鏈DNA。引物2寡核苷酸退火于該單鏈DNA 3’端的互補序列并且延伸它的3’端(通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用)，形成雙鏈DNA。然后RNA聚合酶能從該雙鏈DNA中現(xiàn)在具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子序列轉(zhuǎn)錄大量的RNA拷貝。該RNA轉(zhuǎn)錄本，與原始靶mRNA反義，能作為NASBA反應(yīng)進一步循環(huán)的模板，引物2可退火于此RNA并啟動第一條cDNA鏈的合成，并且引物1啟動第二條cDNA鏈的合成。本領(lǐng)域熟知NASBA反應(yīng)的一般原理(參見Compton，J.Nature，35091-92)。
本文所述的靶特異性探針寡核苷酸也可與固體支撐物如磁性微珠結(jié)合并用作“捕獲探針”來固定NASBA擴增反應(yīng)的產(chǎn)物(單鏈RNA)。本文所述的靶特異性“分子標(biāo)燈”探針可用于實時監(jiān)測NASBA反應(yīng)。


參照下列實施例和附圖將進一步理解本發(fā)明，其中圖1闡明利用分子標(biāo)燈探針的實時NASBA擴增反應(yīng)，擴增結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌sodA mRNA的時間進程。X-軸熒光(相對單位)，y-軸時間(秒)。
具體實施例方式
實施例1細(xì)菌基因表達的誘導(dǎo)1)用氧處理將含有生長緩慢的分枝桿菌的樣本接種到液體培養(yǎng)基中。將細(xì)菌暴露于氧氣(起泡)10分鐘和60分鐘。
樣本由于收集的細(xì)菌數(shù)量不定，在轉(zhuǎn)移到裂解緩沖液中之前把樣本在培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基中稀釋。稀釋度1∶1和1∶100。
2)接種于生長培養(yǎng)基中將細(xì)菌樣本置于最適所檢測的細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中37℃過夜。即使細(xì)菌沒有繁殖到相當(dāng)多的程度，但對用于啟動NASBA擴增反應(yīng)的基因的誘導(dǎo)是足夠的。
細(xì)菌的裂解·在2-8℃貯存裂解緩沖液(0.9ml，低pH值)。使用之前，必須將緩沖液加熱到37℃，并保持30分鐘以便溶解所有的結(jié)晶。
·將100ml細(xì)菌培養(yǎng)物加到0.9ml緩沖液中，混合均勻。
·將帶有細(xì)菌的裂解緩沖液在37℃溫育10分鐘。
·將裂解的細(xì)菌于-70℃貯存或立刻提取核酸。
3)從誘導(dǎo)的細(xì)菌樣本中提取DNA/RNA下面的步驟根據(jù)NuclisensTM，Organon Teknika的手冊進行操作·在每個樣品中加入50μl硅顆粒并在室溫下溫育10分鐘。每2分鐘混合試管。
·將樣品中的所有物質(zhì)轉(zhuǎn)移到NuclisensTM提取儀中使用的柱子中。
·遵循手冊中的方法“1ml原生質(zhì)的提取”。
檢測分枝桿菌屬的種中過氧化物歧化酶的引物的試驗將2×試劑球2×80μl稀釋液混合均勻，然后加入28μl依賴核酸序列的擴增用水(NASBA water)32μl氯化鉀(所有試劑來自于Organon Teknika提供的NuclisensTM系統(tǒng))分到8個管中，每管27.5μl。以下列方式加入引物。(引物號與表2列出的引物對應(yīng))管號 引物1 1.25μl 4-85(SEQ ID NO70)1.25μl 4-86(SEQ ID NO71)2 1.25μl 4-85(SEQ IDNO70)1.25μl 4-98(SEQ ID NO73)3 1.25μl 4-97(SEQ ID NO72)1.25μl 4-86(SEQ ID NO71)4 1.25μl 4-97(SEQ ID NO72)1.25μl 4-98(SEQ ID NO73)5 1.25μl 4-115(SEQ ID NO53)1.25μl 4-116(SEQ ID NO54)6 1.25μl 4-115(SEQ ID NO53)1.25μl 4-122(SEQ IDNO56)7 1.25μl 4-121(SEQ ID NO55)1.25μl 4-116(SEQ IDNO54)8 1.25μl 4-121(SEQ ID NO55)1.25μl 4-122(SEQ IDNO56)樣本結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌在41℃進行擴增2.5小時。在Agilent生物分析儀上檢測產(chǎn)物。
結(jié)果如所預(yù)料的那樣，引物檢測到了來自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的序列。
實施例3從病人樣本中擴增結(jié)核分枝桿菌樣本1)培養(yǎng)物中生長的ATTC菌株(對照)2)病樣預(yù)混合反應(yīng)液2試劑球2×80μl試劑球稀釋液在一管中混合，加入23μl依賴核酸序列的擴增用水(nasbawater)10μl引物1(4-122；SEQ ID NO56)10μl引物2(4-115；SEQ ID NO53)5μl分子標(biāo)燈(4-125；SEQ ID NO41)32μl氯化鉀樣本電泳

結(jié)果，信號增加

實施例4用結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)燈進行NASBA擴增將2×試劑球2×80μl稀釋液1)加入
11.5μl水5μl引物4-115(SEQ ID NO53)5μl引物4-122(SEQ ID NO56)16μl氯化鉀2)也加入11.5μl水5μl引物4-121(SEQ ID NO55)5μl引物4-116(SEQ ID NO54)16μl氯化鉀將這兩種引物混合物分為4管(共8管)，每管29.5μl。
加入分子標(biāo)燈每管0.63μl1a)4-118(SEQ ID NO34)1b)4-119(SEQ ID NO35)1c)4-124(SEQ ID NO40)1d)4-125(SEQ ID NO41)2a)4-118(SEQ ID NO34)2b)4-119(SEQ ID NO35)2c)4-124(SEQ ID NO40)2d)4-125(SEQ ID NO41)將2×酶在2×55μl稀釋液中稀釋試劑來自NucliSens，Organon Teknika樣本樣本2和24是結(jié)核分枝桿菌樣本7是牛分枝桿菌

在41℃擴增并在讀數(shù)器檢測2.5個時間段。結(jié)果，信號數(shù)倍地增大。認(rèn)為增加1.5是陽性。

在所有樣本中均檢測到擴增-最好的檢測結(jié)果是預(yù)混合反應(yīng)液1d。
采用下列引物和分子標(biāo)燈的組合檢測到最佳結(jié)果引物24-115(SEQ ID NO53)引物14-122(SEQ ID NO56)分子標(biāo)燈4-125(SEQ ID NO41)見圖1中擴增的圖解形式。
實施例5 結(jié)核分枝桿菌sodA引物的特異性樣本


預(yù)混合反應(yīng)液2試劑球 2酶球2×80μl試劑球稀釋液 2×55μl酶稀釋液在一管中混合，然后加入23μl依賴核酸序列的擴增用水10μl引物1(4-122；SEQ ID NO56)10μl引物2(4-115；SEQ ID NO53)5μl分子標(biāo)燈(4-125；SEQ ID NO41)32μl氯化鉀樣本電泳

結(jié)果信號增大倍數(shù)(陽性信號1.5以上)

結(jié)論引物是結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌特異性的，不與其它分枝桿菌或相關(guān)細(xì)菌如藤黃微球菌反應(yīng)。
序列表SEQ ID NO57結(jié)核分枝桿菌sodA的核苷酸序列SEQ ID NO58結(jié)核分枝桿菌sodA的氨基酸序列SEQ ID NO59鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種sod的核苷酸序列SEQ ID NO60鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種sod的氨基酸序列SEQ ID NO98結(jié)核分枝桿菌pncA的核苷酸序列SEQ ID NO99結(jié)核分枝桿菌pncA的氨基酸序列序列表<110>挪其普公司<120>微生物中可誘導(dǎo)型基因的檢測<130>P03GB102363<160>99<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gaagcggcgg actaccatca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ctcgattgcc gacgtgtcca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>3cattgcgtca gcggtactcc20
<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>4cccgatcatt gcgtcagcgg tactccatcg gg 32<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>5gcccgatcat tgcgtcagcg gtactccatc gggc 34<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>6ccgccgcatt gcgtcagcgg tactcccggc gg 32<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7accaaggact tccacatcga 20
<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8taccgaccac atcgacctca 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>9attgcgtcag cggtactccc 20<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>10cgtcgtattg cgtcagcggt actcccacga cg32<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>11cgtcggattg cgtcagcggt actcccccga cg32<210>12
<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>12aggcgtattg cgtcagcggt actcccacgc ct 32<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13gtgaccactt ctccggcaca20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14gtgtaggcac cct tgtagaa20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>15gactattcct cgtcgtggcc 20<210>16<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>16cgcatggact attcctcgtc gtggcccatg cg 32<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>17ccagcgacta ttcctcgtcg tggccgctgg30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>18tcgcggacta ttcctcgtcg tggcccgcga 30<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19ctgttttggg cgtcgatcca 20<210>20<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20cagttggcgg ggacggctaa 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>21attcccacta ccacgtccgg 20<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>22cgcatgattc ccactaccac gtccggcatg cg 32<210>23<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>23cctgcgattc ccactaccac gtccggcgca gg 32<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>24gcgctattcc cactaccacg tccggagcgc30<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25ggcgtcgatc cactgcggga20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26ggtgggcaag aagaagtcga20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>27gcccgctcca gcacctcctt20<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>28cgcatggccc gctccagcac ctccttcatg cg 32<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>29ccgtcggccc gctccagcac ctccttcgac gg 32<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>30cacgcgcccg ctccagcacc tccttgcgtg 30<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31ctccagcacc tccttggtca 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32ccaggctgat accacgtcta 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>33acttcttctt gcccacccac 20<210>34<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>34cgcatgactt cttcttgccc acccaccatg cg 32<210>35<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>35ccgtcgactt cttcttgccc acccaccgac gg 32<210>36<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針
<400>36cacgcacttc ttcttgccca cccacgcgtg 30<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>37cctccttggt caattcgtta 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38aagtcaaccc tgctccatga 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>39ttgcccaccc accccataga 20<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針
<400>40cgcatgttgc ccacccaccc catagacatg cg32<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>41cgctgttgcc cacccacccc atagacagcg 30<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子標(biāo)燈探針<400>42cgcatttgcc cacccacccc atagaatgcg 30<210>43<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43gatgcaaggt cgcatatgag gaagcggcgg actaccatca40<210>44<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44
aattctaata cgactcacta tagggagaag gctcgattgc cgacgtgtcc a51<210>45<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45gatgcaaggt cgcatatgag accaaggact tccacatcga 40<210>46<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46aattctaata cgactcacta tagggagaag gtaccgacca catcgacctc a 51<210>47<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47gatgcaaggt cgcatatgag gtgaccactt ctccggcaca 40<210>48<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtgtaggca cccttgtaga a 51
<210>49<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49gatgcaaggt cgcatatgag ctgttttggg cgtcgatcca 40<210>50<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50aattctaata cgactcacta tagggagaag gcagttggcg gggacggcta a 51<210>51<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51gatgcaaggt cgcatatgag ggcgtcgatc cactgcggga 40<210>52<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtgggcaa gaagaagtcg a 51
<210>53<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53gatgcaaggt cgcatatgag ctccagcacc tccttggtca 40<210>54<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54aattctaata cgactcacta tagggagaag gccaggctga taccacgtct a 51<210>55<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55gatgcaaggt cgcatatgag cctccttggt caattcgtta 40<210>56<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56aattctaata cgactcacta tagggagaag gaagtcaacc ctgctccatg a 51
<210>57<211>1321<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<220>
<221>CDS<222>(542)..(1165)<223>
<400>57gcttagt tggtgagattgcg aaagccgagg gtcgatcccc ggaggtgctc gacgcggccg60ctgatcgctt cggtcggcgg gttgaccgtg gtcactgttt tgggcgtcga tccactgcgg120gaattcccac taccacgtcc ggccggatca ccggcgactc gcggtgcacg gcccgctcca180gcacctcctt ggtcaattcg ttagccgtcc ccgccaactg cccagccgtc gacttcttct240tgcccaccca ccccatagac cttcgccaca cagcgccttc cgtccaccca acagcggtcc300gatgacggac ccccgacggg gacttcagcg accaggaacg cgcccataga cgtggtatca360gcctgggggc gtcctggtag cctatgccgt ccgccctggg gcatcgaccc caaggtcgtt420gttgcgacgc gagcggtcat ggagcagggt tgacttgtca agctagagcc agcccatcgc480gtgggaggca cccgcgcgaa aagaaacatc ggacgatcat ttcatcgaag gaaggaatgc540c gtg gcc gaa tac acc ttg cca gac ctg gac tgg gac tac gga gca ctg589Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu1 5 10 15gaa ccg cac atc tcg ggt cag atc aac gag ctt cac cac agc aag cac 637Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30cac gcc acc tac gta aag ggc gcc aat gac gcc gtc gcc aaa ctc gaa 685His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu35 40 45gag gcg cgc gcc aag gaa gat cac tca gcg atc ttg ctg aac gaa aag 733Glu Ala Arg Ala Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys50 55 60aat cta gct ttc aac ctc gcc ggc cac gtc aat cac acc atc tgg tgg 781Asn Leu Ala Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp65 70 75 80
aag aac ctg tcg cct aac ggt ggt gac aag ccc acc ggc gaa ctc gcc829Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95gca gcc atc gcc gac gcg ttc ggt tcg ttc gac aag ttc cgt gcg cag877Ala Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110ttc cac gcg gcc gct acc acc gtg cag ggg tcg ggc tgg gcg gca ctg925Phe His Ala Ala Ala Thr Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp Ala Ala Leu115 120 125ggc tgg gac aca ctc ggc aac aag ctg ctg ata ttc cag gtt tac gac973Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp130 135 140cac cag acg aac ttc ccg cta ggc att gtt ccg ctg ctg ctg ctc gac1021His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp145 150 155 160atg tgg gaa cac gcc ttc tac ctg cag tac aag aac gtc aaa gtc gac1069Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp165 170 175ttt gcc aag gcg ttt tgg aac gtc gtg aac tgg gcc gat gtg cag tca1117Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Ser180 185 190cgg tat gcg gcc gcg acc tcg cag acc aag ggg ttg ata ttc ggc tga1165Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Gln Thr Lys Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205ccccgctgcc gcaagcgtcg ggctcagtat tccggagtcg cgcatcacca tcgcccttat 1225cctggcctta tattgcagct ttgtgaacac ggccgcggtg gccgtgtcga gttgcagggc 1285gcgtaaacca cgcgcatgct tggttactcg agctac1321<210>58<211>207<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>58Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu1 5 10 15
Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu35 40 45Glu Ala Arg Ala Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys50 55 60Asn Leu Ala Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp65 70 75 80Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95Ala Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110Phe His Ala Ala Ala Thr Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp Ala Ala Leu115 120 125Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp130 135 140His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp145 150 155 160Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp165 170 175Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Ser180 185 190Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Gln Thr Lys Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205
<210>59<211>900<212>DNA<213>鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種<220>
<221>CDS<222>(260)..(883)<223>
<400>59tcgcccgcgt ggaaccacag ctacagcgtc gcggcactgc gcgccggatt gatcgcactg60gcgctgctgg cggtattggc cctcatcgtc ttgtcttgaa gtcctgtctt gaaacaccgc120tgagcgggta tccgccttcc ggctcagcgg ggtcgttctt gcggtgcgcg cggtcatgga180gcagggttga taacgcccgg ccgccgcgag gtggcccgcg cgactgagcg tcaagacgac240aatcgaagaa aggaatgcc gtg gct gaa tac acc ctg ccc gac ctg gac tgg 292Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp1 5 10gac tat gca gcg ttg gaa ccg cac atc tcg ggg cag atc aac gag atc 340Asp Tyr Ala Ala Leu Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile15 20 25cac cac acc aag cac cac gcc acc tac gtc aaa ggc gtg aac gac gct 388His His Thr Lys His His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Val Asn Asp Ala30 35 40ctt gcc aag ctc gaa gag gcc cgc gcc aac gag gac cac gct gcg atc 436Leu Ala Lys Leu Glu Glu Ala Arg Ala Asn Glu Asp His Ala Ala Ile45 50 55ttc ctg aac gaa aag aac ctc gcc ttc cac ctg ggc ggc cac gtc aac 484Phe Leu Asn Glu Lys Asn Leu Ala Phe His Leu Gly Gly His Val Asn60 65 70 75cac tcg atc tgg tgg aag aac ctg tcg ccg gac ggc ggt gac aag ccc 532His Ser Ile Trp Trp Lys Asn Leu Ser Pro Asp Gly Gly Asp Lys Pro80 85 90acc ggc gag ctg gcc gcc gcg atc gac gac gcg ttc ggc tcc ttc gac 580Thr Gly Glu Leu Ala Ala Ala Ile Asp Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp95 100 105aag ttc cgg gcg caa ttc agc gcc gcc gcc aac ggc ctg cag ggc tcc 628Lys Phe Arg Ala Gln Phe Ser Ala Ala Ala Asn Gly Leu Gln Gly Ser
110 115 120ggc tgg gcg gtg ctg ggt tat gac acc gtg ggc agc cgg ttg ctg acc676Gly Trp Ala Val Leu Gly Tyr Asp Thr Val Gly Ser Arg Leu Leu Thr125 130 135ttc cag ctc tac gac cag cag gcc aac gtc ccg ctg ggc atc atc ccg724Phe Gln Leu Tyr Asp Gln Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ile Ile Pro140 145 150 155ctg ctg cag gtc gac atg tgg gag cac gcg ttc tac ctg cag tac aag772Leu Leu Gln Val Asp Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys160 165 170aac gtc aag gcg gat tac gtc aag gcg ttc tgg aac gtg gtc aac tgg820Asn Val Lys Ala Asp Tyr Val Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp175 180 185gcg gac gtg cag aag cgg tac gcc gcc gcc act tcc aag gcc caa ggc868Ala Asp Val Gln Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Lys Ala Gln Gly190 195 200ctg atc ttc ggc tga ctttcctctc gatcggc 900Leu Ile Phe Gly205<210>60<211>207<212>PRT<213>鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種<400>60Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Leu1 5 10 15Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile His His Thr Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Val Asn Asp Ala Leu Ala Lys Leu Glu35 40 45Glu Ala Arg Ala Asn Glu Asp His Ala Ala Ile Phe Leu Asn Glu Lys50 55 60
Asn Leu Ala Phe His Leu Gly Gly His Val Asn His Ser Ile Trp Trp65 70 75 80Lys Asn Leu Ser Pro Asp Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95Ala Ala Ile Asp Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110Phe Ser Ala Ala Ala Asn Gly Leu Gln Gly Ser Gly Trp Ala Val Leu115 120 125Gly Tyr Asp Thr Val Gly Ser Arg Leu Leu Thr Phe Gln Leu Tyr Asp130 135 140Gln Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ile Ile Pro Leu Leu Gln Val Asp145 150 155 160Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Ala Asp165 170 175Tyr Val Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Lys180 185 190Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Lys Ala Gln Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>61gccgaataca ccttgccaga 20
<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>62cgtggtgctt gctgtggtga 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>63caattcagcg ccgccgccaa20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>64acctggactg ggactacgga20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>65tcattggcgc cctttacgta20<210>66
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>66aattcagcgc cgccgccaac 20<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67tggactggga ctacggagca 20<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68cgagtttggc gacggcgtca 20<210>69<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>69aagttccggg cgcaattcag 20<210>70<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>70gatgcaaggt cgcatatgag gccgaataca ccttgccaga40<210>71<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>71aattctaata cgactcacta tagggagaag gcgtggtgct tgctgtggtg a51<210>72<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>72gatgcaaggt cgcatatgag tggactggga ctacggagca 40<210>73<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>73aattctaata cgactcacta tagggagaag gcgagtttgg cgacggcgtc a51<210>74<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>74gcgccaagga agatcactca 20<210>75<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>75ggcgacaggt tcttccacca20<210>76<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>76gaatctagct ttcaacctcg20<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>77caaggaagat cactcagcga20<210>78<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>78gtcaccaccg ttaggcgaca 20<210>79<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>79atctagcttt caacctcgcc 20<210>80<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>80agcgatcttg ctgaacgaaa 20<210>81<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>81tgggcttgtc accaccgtta 20<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探針<400>82ggccacgtca atcacaccat 20<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>83ttccagctct acgaccagca 20<210>84<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>84ttggaagtgg cggcggcgta 20<210>85<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>85aaggcggatt acgtcaaggc 20<210>86<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>86ctctacgacc agcaggccaa 20<210>87<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>87ctgcacgtcc gcccagttga 20<210>88<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>88aagaacgtca aggcggatta 20<210>89<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>89tacgaccagc aggccaacgt 20<210>90<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針
<400>90cacgtccgcc cagttgacca 20<210>91<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>91gtacaagaac gtcaaggcgg 20<210>92<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>92tcgagctgcc agtgtggtca 20<210>93<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>93acgagaatgg aagggggaca 20<210>94<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針
<400>94aacagggtcg gatcggccta 20<210>95<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>95ccagtgtggt catttccata 20<210>96<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>96agggcaccac gagaatggaa 20<210>97<211> 20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>97gcgcggaggt cgaaatggaa 20<210>98<211>561<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(561)
<223>
<400>98atg cgg gcg ttg atc atc gtc gac gtg cag aac gac ttc tgc gag ggt 48Met Arg Ala Leu Ile Ile Val Asp Val Gln Asn Asp Phe Cys Glu Gly1 5 10 15ggc tcg ctg gcg gta acc ggt ggc gcc gcg ctg gcc cgc gcc atc agc 96Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ser20 25 30gac tac ctg gcc gaa gcg gcg gac tac cat cac gtc gtg gca acc aag 144Asp Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asp Tyr His His Val Val Ala Thr Lys35 40 45gac ttc cac atc gac ccg ggt gac cac ttc tcc ggc aca ccg gac tat 192Asp Phe His Ile Asp Pro Gly Asp His Phe Ser Gly Thr Pro Asp Tyr50 55 60tcc tcg tcg tgg cca ccg cat tgc gtc agc ggt act ccc ggc gcg gac 240Ser Ser Ser Trp Pro Pro His Cys Val Ser Gly Thr Pro Gly Ala Asp65 70 75 80ttc cat ccc agt ctg gac acg tcg gca atc gag gcg gtg ttc tac aag 288Phe His Pro Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ile Glu Ala Val Phe Tyr Lys85 90 95ggt gcc tac acc gga gcg tac agc ggc ttc gaa gga gtc gac gag aac 336Gly Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Phe Glu Gly Val Asp Glu Asn100 105 110ggc acg cca ctg ctg aat tgg ctg cgg caa cgc ggc gtc gat gag gtc 384Gly Thr Pro Leu Leu Asn Trp Leu Arg Gln Arg Gly Val Asp Glu Val115 120 125gat gtg gtc ggt att gcc acc gat cat tgt gtg cgc cag acg gcc gag 432Asp Val Val Gly Ile Ala Thr Asp His Cys Val Arg Gln Thr Ala Glu130 135 140gac gcg gta cgc aat ggc ttg gcc acc agg gtg ctg gtg gac ctg aca 480Asp Ala Val Arg Asn Gly Leu Ala Thr Arg Val Leu Val Asp Leu Thr145 150 155 160gcg ggt gtg tcg gcc gat acc acc gtc gcc gcg ctg gag gag atg cgc 528Ala Gly Val Ser Ala Asp Thr Thr Val Ala Ala Leu Glu Glu Met Arg165 170 175acc gcc agc gtc gag ttg gtt tgc agc tcc tga 561Thr Ala Ser Val Glu Leu Val Cys Ser Ser
180 185<210>99<211>186<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>99Met Arg Ala Leu Ile Ile Val Asp Val Gln Asn Asp Phe Cys Glu Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ser20 25 30Asp Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asp Tyr His His Val Val Ala Thr Lys35 40 45Asp Phe His Ile Asp Pro Gly Asp His Phe Ser Gly Thr Pro Asp Tyr50 55 60Ser Ser Ser Trp Pro Pro His Cys Val Ser Gly Thr Pro Gly Ala Asp65 70 75 80Phe His Pro Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ile Glu Ala Val Phe Tyr Lys85 90 95Gly Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Phe Glu Gly Val Asp Glu Asn100 105 110Gly Thr Pro Leu Leu Asn Trp Leu Arg Gln Arg Gly Val Asp Glu Val115 120 125Asp Val Val Gly Ile Ala Thr Asp Hi s Cys Val Arg Gln Thr Ala Glu130 135 140Asp Ala Val Arg Asn Gly Leu Ala Thr Arg Val Leu Val Asp Leu Thr145 150 155 160
Ala Gly Val Ser Ala Asp Thr Thr Val Ala Ala Leu Glu Glu Met Arg165 170 175Thr Ala Ser Val Glu Leu Val Cys Ser Ser180 18權(quán)利要求
1.一種檢測待測樣本中微生物存在的方法，該方法包括將待測樣本暴露于能誘導(dǎo)所述微生物中至少一個基因表達的誘導(dǎo)物下并檢測從暴露于所述誘導(dǎo)物而被誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的微生物是生長緩慢的細(xì)菌。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生長緩慢的細(xì)菌選自疏螺旋體屬片球菌屬、枝原體屬或分枝桿菌屬。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中檢測從暴露于所述誘導(dǎo)物而被誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA存在的步驟包括進行擴增反應(yīng)以擴增全長或部分mRNA并檢測擴增反應(yīng)的特異性產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的擴增反應(yīng)是RT-PCR或依賴核酸序列的擴增。
6.如權(quán)利要求3至5任一項所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)物是氧或過氧化氫，并且由于暴露于所述誘導(dǎo)物而被誘導(dǎo)的基因是編碼過氧化物歧化酶的基因。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中檢測從編碼過氧化物歧化酶的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA存在的步驟包括(a)組裝反應(yīng)混合物，該混合物包含適用于通過NASBA擴增所述mRNA一段區(qū)域的NASBA P1和NASBA P2引物對、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體的RNA鏈而不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識別NASBA P1引物中存在的啟動子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸；(b)在允許NASBA擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)介質(zhì)與從懷疑含有微生物的待測樣本中分離的核酸制備物一起溫育；并且(c)檢測和/或定量測定NASBA擴增反應(yīng)的任何特異性產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，該方法用于檢測分枝桿菌屬，其中所述NASBA P1和NASBA P2引物對是下列中的一種包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO25的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO61的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO62的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO64的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO65的NASBA P2引物；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-85；引物4-92和包含SEQ ID NO64的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-91；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-103；或引物4-122和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-115。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中檢測從編碼過氧化物歧化酶的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA存在的步驟包括通過RT-PCR擴增部分mRNA。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，該方法用于檢測分枝桿菌屬，其中使用一種下列引物對實施，通過RT-PCR擴增部分mRNA包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物；包含SEQ ID NO61的PCR引物和包含SEQ ID NO62的PCR引物；或包含SEQ ID NO64的PCR引物和包含SEQ ID NO65的PCR引物。
11.如權(quán)利要求3至5任一項所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)物是異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或吡嗪酰胺，并且由于暴露于所述誘導(dǎo)物而被誘導(dǎo)的基因是pncA基因。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中檢測從pncA基因轉(zhuǎn)錄的mRNA存在的步驟包括(a)組裝反應(yīng)混合物，該混合物包含適用于通過NASBA擴增所述mRNA一段區(qū)域的NASBA P1和NASBA P2引物對、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體的RNA鏈而不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識別NASBA P1引物中存在的啟動子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸；(b)在允許NASBA擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件下將所述反應(yīng)介質(zhì)與從懷疑含有微生物的待測樣本中分離的核酸制備物一起溫育；并且(c)檢測和/或定量測定NASBA擴增反應(yīng)的任何特異性產(chǎn)物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，該方法用于檢測結(jié)核分枝桿菌，其中所述NASBA P1和NASBAP2引物對是下列中的一種包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物；引物4-2和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-1；引物4-8和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-7；或引物4-14和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-15。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中檢測從pncA基因轉(zhuǎn)錄的mRNA存在的步驟包括通過RT-PCR擴增部分mRNA。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，該方法用于檢測結(jié)核分枝桿菌，其中使用一種下列引物對實施，通過RT-PCR擴增部分mRNA包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；或包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物。
16.一種用于檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的寡核苷酸引物，其中從可誘導(dǎo)型基因轉(zhuǎn)錄mRNA，所述寡核苷酸引物選自(i)包含SEQ ID NOs2、8、14、20、26、32、38、62、65、68、75、78、81、84、87、90、93或96中一條的NASBA P1引物；(ii)引物號為4-2、4-8、4-14、4-86、4-98、4-104、4-110、4-116或4-122的NASBA P1引物；(iii)包含SEQ ID NOs1、7、13、19、25、31、37、61、64、67、74、77、80、83、86、89、92或95中一條的NASBA P2引物；(iv)引物號為4-1、4-7、4-13、4-85、4-97、4-103、4-109、4-115或4-121的NASBA P2引物；(v)包含SEQ ID NOs1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、61、62、64、65、67、68、74、75、77、78、80、81、83、84、87、88、89、90、92、93、95或96中一條的PCR引物。
17.一種用于檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的寡核苷酸探針，其中從可誘導(dǎo)型基因轉(zhuǎn)錄mRNA，所述寡核苷酸分子選自(i)包含SEQ ID NOs3、9、15、21、27、33、39、63、66、69、76、79、82、85、88、91、94或97中一條的探針寡核苷酸；(ii)SEQ ID NO4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41或42的分子標(biāo)燈探針寡核苷酸。
18.一種用于通過NASBA檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的引物/探針組合，其中從可誘導(dǎo)型基因轉(zhuǎn)錄mRNA，所述引物/探針組合選自包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO3的探針或者選自SEQ ID NOs4、5或6的至少一個分子標(biāo)燈探針；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO9的探針或者選自SEQ ID NOs10、11或12的至少一個分子標(biāo)燈探針；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO15的探針或者選自SEQ IDNOs16、17或18的至少一個分子標(biāo)燈探針；引物4-2，包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-1，和或者包含SEQ ID NO3的探針或者選自SEQ ID NOs4、5或6的至少一個分子標(biāo)燈探針；引物4-8，包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-7，和或者包含SEQ ID NO9的探針或者選自SEQ ID NOs10、11或12的至少一個分子標(biāo)燈探針；引物4-14，包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-15，和或者包含SEQ ID NO15的探針或者選自SEQ ID NOs16、17或18的至少一個分子標(biāo)燈探針；包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO21的探針或者選自SEQ IDNOs22、23或24的至少一個分子標(biāo)燈探針；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO25的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO27的探針或者選自SEQ IDNOs28、29或30的至少一個分子標(biāo)燈探針；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO33的探針或者選自SEQ IDNOs34、35或36的至少一個分子標(biāo)燈探針；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO39的探針或者選自SEQ IDNOs40、41或42的至少一個分子標(biāo)燈探針；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-85；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，優(yōu)選引物4-103。
19.一種用于通過RT-PCR檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的引物組合，其中從可誘導(dǎo)型基因轉(zhuǎn)錄mRNA，所述引物組合選自包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物；包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物；包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物。
20.一種用于通過RT-PCR檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的引物/探針組合，其中從可誘導(dǎo)型基因轉(zhuǎn)錄mRNA，所述引物/探針組合選自包含SEQ ID NO2的PCR引物、包含SEQ ID NO1的PCR引物和包含SEQ ID NO3的探針；包含SEQ ID NO8的PCR引物、包含SEQ ID NO7的PCR引物和包含SEQ ID NO9的探針；包含SEQ ID NO14的PCR引物、包含SEQ ID NO13的PCR引物和包含SEQ ID NO15的探針；包含SEQ ID NO20的PCR引物、包含SEQ ID NO19的PCR引物和包含SEQ ID NO21的探針；包含SEQ ID NO26的PCR引物、包含SEQ ID NO25的PCR引物和包含SEQ ID NO27的探針；包含SEQ ID NO32的PCR引物、包含SEQ ID NO31的PCR引物和包含SEQ ID NO33的探針；或包含SEQ ID NO38的PCR引物、包含SEQ ID NO37的PCR引物和包含SEQ ID NO39的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過誘導(dǎo)mRNA表達并檢測誘導(dǎo)的mRNA，來檢測微生物，特別是生長緩慢的細(xì)菌如分枝桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌存在的方法。本發(fā)明還提供了用于檢測分枝桿菌屬的寡核苷酸引物和探針。
文檔編號C12Q1/68GK1514882SQ02809940
公開日2004年7月21日 申請日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月20日
發(fā)明者弗蘭克·卡爾森, 弗蘭克 卡爾森 申請人:挪其普公司