專利名稱：基因修飾微生物及以此微生物生產衣康酸的方法
技術領域：
本發明系有關于一種基因修飾之大腸桿菌菌株，其衣康酸的產量高于野生型之大 腸桿菌菌株。
背景技術：
衣康酸，為許多產物(如，聚丙烯纖維、橡膠、人工鉆石及鏡片)之必需前體，其廣 泛地使用于化學工業上。傳統上，衣康酸是由土曲霉(Aspergillusterreus)中所分離出 來。然而，土曲霉(A.terreUS)生長緩慢，且在產孢時期并無法形成衣康酸。因此，業界亟 需一種可大量生產衣康酸的方法。

發明內容
在本發明之一范疇中，基因修飾微生物之特征包括⑴突變之內源性icd基 因，其檸檬酸脫氫酶的表達量低于其野生型的表達量，以及(ii)外源性核酸序列，其編 碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，且連接至啟動子(可在微生物中進行基因轉錄)。經修飾 的微生物可為黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、大腸桿 菌(Escherichia coli)、擔子菌類酵母菌(Pseudozyma Antarctica)、解脂耶氏酵母菌 (Yarrowia lipolytica)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此微生物可還包括至 少外源性核酸序列，其編碼下列3種酶其中之一 (a)可將磷酸烯醇丙酮酸轉變為草酰乙酸 的酶(例如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)，(b)可將草酰乙酸轉變 為檸檬酸的酶(例如，檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶以及檸檬酸裂解酶)，以及(c) 可將檸檬酸或異檸檬酸轉變為順式烏頭酸的酶(例如，烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶)。 此3個外源性核酸序列連接至適當的啟動子。在本發明另一實施樣態中，基因修飾微生物之特征包括(i)第一外源性核酸序 列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，(ii)第二外源性核酸序列，其編碼上述酶(a)或酶 (b)，以及選擇性(iii)第三外源性核酸序列，其編碼上述酶(C)。此外，此微生物包括(i) 第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，(ii)第二外源性核酸序列，其編碼 上述酶(a)，(iii)第三外源性核酸序列，其編碼上述酶(b)，以及選擇性(iv)第四外源性 核酸序列，其編碼上述酶(C)。各個外源性核酸序列連接至適當的啟動子，使上述酶于微生 物內表達。在本發明之范疇中，還包括一種以上述任何基因修飾微生物表達衣康酸的方法。 本發明之方法包括將此基因修飾微生物培養于培養基中以產生衣康酸，收集培養基并純化 此衣康酸產物。在一實施例中，培養基包括以葡萄糖作為基質以生產衣康酸，葡萄糖的濃度 介于5-80g/L，較佳約10-40g/L。在另一實施例中，此培養基包括以檸檬酸作為基質以生產 衣康酸，檸檬酸的濃度介于5-80g/L，較佳約10-40g/L。。當以檸檬酸作為基質時，基因修飾 微生物較易經透化(permeabilize)處理。為了讓本發明之上述和其它目的、特征、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合所附圖
示，作詳細說明如下實施方式本發明系提供一種基因修飾之微生物，其可高度表達順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)，此酶可將順式烏頭酸轉變為衣康 酸。微物生包括，但不限于，曲霉(Aspergillus)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、棒 狀桿菌(Corynebacterium)、德克酵母菌(Dekkera)、腸桿菌(Enterobacter)、腸 球菌(Enterococcus)、±矣希氏菌(Escherichia)、歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏 菌(Klebsiella)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌 (Lactococcus)、摩根氏菌(Morganella)(Pantoea) Iflif (Pectobacterium)、 青霉菌(Penicillum)、畢赤酵母菌(Pichia)、變形桿菌(Proteus)、假單胞菌 (Pseudomonas)、二 形性酵母菌(Pseudozyma)、紅酵母菌(Rhodotorula)、沙門氏菌 (Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、志賀氏菌(Shigella)、酵母菌(Saccharomyces)、黑 穗菌(Ustilago)、及耶氏酵母菌(Yarrowia)。本發明所述之“順式烏頭酸脫羧酶”或“CAD”系指任何天然的順式烏頭酸脫羧酶 (例如，土曲霄(A. terreus)之 CAD，相關內容可參照 Dwiarti etal. ， J. Bioscience and Bioengineering，94(l) =29-33,2002 以及 W02009/014437)，以及具相同功能的物質。下列 核酸及氨基酸序列為土曲霉(A. terreus)核酸序列(序列識別號1)及氨基酸序列(序列 識別號2)之一實施例。A. terreus順式烏頭酸脫羧酶 atgaccaagcagtctgctgattccaacgcgaagtctggtgtgacctctgagatctgtcacMTKQSADSNAKSGVTSEICHtgggcgtctaatctcgccactgatgatatcccgagcgacgttctggagcgtgcaaaatacWASNLATDDIPSDVLERAKYctgatcctggatggtatcgcgtgcgcgtgggtaggtgctcgtgtcccatggtctgaaaaaLlLDGIACAffVGARVPffSEKtacgttcaagcgaccatgtctttcgaacctccgggtgcgtgtcgtgtcatcggttacggcYVQATMSFEPPGACRVIGYGcagaaactgggtccggtagcggctgccatgacgaactctgcatttattcaggcgaccgaaQKLGPVAAAMTNSAFIQATEctcgatgactatcactctgaagcgccgctgcattccgcgtctatcgttctcccggcagttLDDYHSEAPLHSASIVLPAVttcgcggcgagcgaagtactggccgaacagggtaaaaccatctctggtattgacgtgattFAASEVLAEQGKTISGIDVIctggctgcgatcgttggtttcgagagcggtcctcgcatcggcaaagcgatctacggttctLAAIVGFESGPRIGKAIYGSgacctcctgaacaacggctggcactgcggtgcggtatatggcgcaccggctggtgcgctcDLLNNGffHCGAVYGAPAGALgcaactggtaagctcctgggcctcacgccggacagcatggaagatgcactgggtattgccATGKLLGLTPDSMEDALGIA
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上述之基因修飾微生物可具有突變的內源性icd基因(編碼異檸檬酸脫氫 酶)，使其相對于野生型的微生物，具有較低的異檸檬酸脫氫酶表達量。Icd基因存在于 各種的微生物中，包括土曲霉(Aspergillus terreus)(基因銀行編號XM_001210553及 XP_001210553)、克氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)(基因銀行編號YP_001453397)、 發酵乳酸桿菌(Lactobacillusfermentum)(基因銀行編號NC_009792 及 ΥΡ_001843755)、 釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(基因銀行編號NC_001146 及NP_014361)、解脂 耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)(基因銀行編號XM_503571及XP_503571)以及大腸 桿菌(Escherichia coli)(基因銀行編號NC_000913及NP_415654)。例如，大腸桿菌其中 一編碼區域如下所示大腸桿菌icd基因的核酸及氨基酸序列atggaaagtaaagtagttgttccggcacaaggcaagaagatcaccctgcaaaacggcaaaMESKVVVPAQGKKITLQNGKctcaacgttcctgaaaatccgattatcccttacattgaaggtgatggaatcggtgtagatLNVPENPIIPYIEGDGIGVDgtaaccccagccatgctgaaagtggtcgacgctgcagtcgagaaagcctataaaggcgagVTPAMLKVVDAAVEKAYKGEcgtaaaatctcctggatggaaatttacaccggtgaaaaatccacacaggtttatggtcagRKISWMEIYTGEKSTQVYGQgacgtctggctgcctgctgaaactcttgatctgattcgtgaatatcgcgttgccattaaaDVWLPAETLDLIREYRVAIKggtccgctgaccactccggttggtggcggtattcgctctctgaacgttgccctgcgccagGPLTTPVGGGIRSLNVALRQgaactggatctctacatctgcctgcgtccggtacgttactatcagggcactccaagcccgELDLYICLRPVRYYQGTPSPgttaaacaccctgaactgaccgatatggttatcttccgtgaaaactcggaagacatttatVKHPELTDMVIFRENSEDIYgcgggtatcgaatggaaagcagactctgccgacgccgagaaagtgattaaattcctgcgtAGIEWKADSADAEKVIKFLRgaagagatgggggtgaagaaaattcgcttcccggaacattgtggtatcggtattaagccgEEMGVKKIRFPEHCGIGIKPtgttcggaagaaggcaccaaacgtctggttcgtgcagcgatcgaatacgcaattgctaacCSEEGTKRLVRAAIEYAIANgatcgtgactctgtgactctggtgcacaaaggcaacatcatgaagttcaccgaaggagcgDRDSVTLVHKGNIMKFTEGAtttaaagactggggctaccagctggcgcgtgaagagtttggcggtgaactgatcgacggtFKDWGYQLAREEFGGELIDGggcccgtggctgaaagttaaaaacccgaacactggcaaagagatcgtcattaaagacgtg
GPWLKVKNPNTGKEIVIKDVattgctgatgcattcctgcaacagatcctgctgcgtccggctgaatatgatgttatcgccIADAFLQQILLRPAEYDVIAtgtatgaacctgaacggtgactacatttctgacgccctggcagcgcaggttggcggtatcCMNLNGDYISDALAAQVGGIggtatcgcccctggtgcaaacatcggtgacgaatgcgccctgtttgaagccacccacggtGIAPGANIGDECALFEATHGactgcgccgaaatatgccggtcaggacaaagtaaatcctggctctattattctctccgctTAPKYAGQDKVNPGSI ILSAgagatgatgctgcgccacatgggttggaccgaagcggctgacttaattgttaaaggtatgEMMLRHMGffTEAADLIVKGMgaaggcgcaatcaacgcgaaaaccgtaacctatgacttcgagcgtctgatggatggcgctEGAINAKTVTYDFERLMDGAAaactgctgaaatgttcagagtttggtgacgcgatcatcgaaaacatgtaa (SEQ ID NO 3)KLLKCSEFGDAI IENM- (SEQ ID NO 4)制備經內源性icd基因突變之微生物的方法已為此技術領域人士所習知。例如， 以同源性重組造成icd基因的突變(如，插入、刪除、位置突變(sitemutation))。此外，基因修飾之微生物也可過度表達下列一個或多個酶(a)可將磷酸烯醇 丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶(例如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶，其包括3種亞型 EC4. 1. 1. 32，EC4. 1. 1. 38及EC4. 1. 1. 49)，(b)可將草酰乙酸轉變為檸檬酸的酶(例如，檸 檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶以及檸檬酸裂解酶)，以及(c)可將檸檬酸或異檸檬酸轉 變為順式烏頭酸的酶(例如，烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶)。本發明所述之“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶”、“檸檬酸合成酶”、“2-甲基檸 檬酸合成酶”、“檸檬酸裂解酶”、“烏頭酸酶”、以及“2-甲基檸檬酸脫氫酶”系指具有上述酶 活性的酶，包括天然的酶及具相同功能的物質。大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC基 因)、檸檬酸合成酶(gltA基因)、烏頭酸酶A(acnA基因)、以及烏頭酸酶B (acnB基因)如 下所示大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶atgaacgaacaatattccgcattgcgtagtaatgtcagtatgctcggcaaagtgctgggaMNEQYSALRSNVSMLGKVLGgaaaccatcaaggatgcgttgggagaacacattcttgaacgcgtagaaactatccgtaagETIKDALGEHILERVETIRKttgtcgaaatcttcacgcgctggcaatgatgctaaccgccaggagttgctcaccaccttaLSKSSRAGNDANRQELLTTLcaaaatttgtcgaacgacgagctgctgcccgttgcgcgtgcgtttagtcagttcctgaacQNLSNDELLPVARAFSQFLNctggccaacaccgccgagcaataccacagcatttcgccgaaaggcgaagctgccagcaacLANTAEQYHSISPKGEAASNccggaagtgatcgcccgcaccctgcgtaaactgaaaaaccagccggaactgagcgaagac
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NTG- (SEQ ID NO 6)大腸桿菌的檸檬酸合成酶atggctgatacaaaagcaaaactcaccctcaacggggatacagctgttgaactggatgtgMADTKAKLTLNGDTAVELDVctgaaaggcacgctgggtcaagatgttattgatatccgtactctcggttcaaaaggtgtgLKGTLGQDVIDIRTLGSKGV
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Tttaaaagcgatatcaagcgttaa(SEQ ID NO 7)FKSDIKR-(SEQ ID NO 8)大腸桿菌的烏頭酸酶AatgtcgtcaaccctacgagaagccagtaaggacacgttgcaggccaaagataaaacttacMSSTLREASKDTLQAKDKTYcactactacagcctgccgcttgctgctaaatcactgggcgatatcacccgtctacccaagHYYSLPLAAKSLGDITRLPKtcactcaaagttttgctcgaaaacctgctgcgctggcaggatggtaactcggttaccgaaSLKVLLENLLRWQDGNSVTEgaggatatccacgcgctggcaggatggctgaaaaatgcccatgctgaccgtgaaattgccEDIHALAGWLKNAHADREIAtaccgcccggcaagggtgctgatgcaggactttaccggcgtacctgccgttgttgatctgYRPARVLMQDFTGVPAVVDLgcggcaatgcgcgaagcggttaaacgcctcggcggcgatactgcaaaggttaacccgctcAAMREAVKRLGGDTAKVNPLtcaccggtcgacctggtcattgaccactcggtgaccgtcgatcgttttggtgatgatgagSPVDLVIDHSVTVDRFGDDEgcatttgaagaaaacgtacgcctggaaatggagcgcaaccacgaacgttatgtgttcctgAFEENVRLEMERNHERYVFLaaatggggaaagcaagcgttcagtcggtttagcgtcgtgccgccaggcacaggcatttgcKWGKQAFSRFSVVPPGTGICcatcaggttaacctcgaatatctcggcaaagcagtgtggagtgaattgcaggacggtgaaHQVNLEYLGKAVWSELQDGEtggattgcttatccggatacactcgttggtactgactcgcacaccaccatgatcaacggcWIAYPDTLVGTDSHTTMINGcttggcgtgctggggtggggcgttggtgggatcgaagcagaagccgcaatgttaggccagLGVLGWGVGGIEAEAAMLGQccggtttccatgettatcccggatgtagtgggcttcaaacttaccggaaaattacgtgaaPVSMLIPDVVGFKLTGKLREggtattaccgccacagacctggttctcactgttacccaaatgctgcgcaaacatggcgtgGITATDLVLTVTQMLRKHGVgtggggaaattcgtcgaattttatggtgatggtctggattcactaccgttggcggatcgcVGKFVEFYGDGLDSLPLADRgccaccattgccaatatgtcgccagaatatggtgccacctgtggcttcttcccaatcgat
ATIANMSPEYGATCGFFPIDgctgtaaccctcgattacatgcgtttaagcgggcgcagcgaagatcaggtcgagttggtcAVTLDYMRLSGRSEDQVELVgaaaaatatgccaaagcgcagggcatgtggcgtaacccgggcgatgaaccaatttttaccEKYAKAQGMffRNPGDEPIFTagtacgttagaactggatatgaatgacgttgaagcgagcctggcagggcctaaacgcccaSTLELDMNDVEASLAGPKRPcaggatcgcgttgcactgcccgatgtaccaaaagcatttgccgccagtaacgaactggaaQDRVALPDVPKAFAASNELEgtgaatgccacgcataaagatcgccagccggtcgattatgttatgaacggacatcagtatVNATHKDRQPVDYVMNGHQYcagttacctgatggcgctgtggtcattgctgcgataacctcgtgcaccaacacctctaacQLPDGAVVIAAITSCTNTSNccaagtgtgctgatggccgcaggcttgctggcgaaaaaagccgtaactctgggcctcaagPSVLMAAGLLAKKAVTLGLKcggcaaccatgggtcaaagcgtcgctggcaccgggttcgaaagtcgtttctgattatctgRQPWVKASLAPGSKVVSDYLgcaaaagcgaaactgacaccgtatctcgacgaactggggtttaaccttgtgggatacggtAKAKLTPYLDELGFNLVGYGtgtaccacctgtattggtaactctgggccgctgcccgatcctatcgaaacggcaatcaaaCTTCIGNSGPLPDPIETAIKaaaagcgatttaaccgtcggtgcggtgctgtccggcaaccgtaactttgaaggccgtatcKSDLTVGAVLSGNRNFEGRIcatccgctggttaaaactaactggctggcctcgccgccgctggtggttgcctatgcgctgHPLVKTNWLASPPLVVAYALgcgggaaatatgaatatcaacctggcttctgagcctatcggccatgatcgcaaaggcgatAGNMNINLASEPIGHDRKGDccggtttatctgaaagatatctggccatcggcacaagaaattgcccgtgcggtagaacaaPVYLKDIffPSAQEIARAVEQgtctccacagaaatgttccgcaaagagtacgcagaagtttttgaaggcacagcagagtggVSTEMFRKEYAEVFEGTAEffaagggaattaacgtcacacgatccgatacctacggttggcaggaggactcaacctatattKGINVTRSDTYGffQEDSTYI
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HTLLMFDNFYDVEEKAKAGNgaatatgcgaagcaggttatgcagtcctgggcggatgccgaatggttcctgaatcgcccgEYAKQVMQSWADAEWFLNRPgcgctggctgaaaaactgaccgttactgtcttcaaagtcactggcgaaactaacaccga tALAEKLTVTVFKVTGETNTD
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GLLTVEKKGKKNIFSGRILEattgaaggtctgccggatctgaaagttgagcaggcctttgagctaaccgatgcgtccgccIEGLPDLKVEQAFELTDASAgagcgttctgccgctggttgtaccatcaagctgaacaaagaaccgatcatcgaatacctgERSAAGCTIKLNKEPIIEYLaactctaacatcgtcctgctgaagtggatgatcgcggaaggttacggcgatcgtcgtaccNSNIVLLKffMIAEGYGDRRT ctggaacgtcgtattcagggcatggaaaaatggctggcgaatcctgagctgctggaagccLERRIQGMEKffLANPELLEAgatgcagatgcggaatacgcggcagtgatcgacatcgatctggcggatattaaagagccaDADAEYAAVIDIDLADIKEPatcctgtgtgctccgaacgacccggatgacgcgcgtccgctgtctgcggtacagggtgagILCAPNDPDDARPLSAVQGEaagatcgacgaagtgtttatcggttcctgcatgaccaacatcggtcacttccgtgctgcgKIDEVFIGSCMTNIGHFRAAggtaaactgctggatgcgcataaaggtcagttgccgacccgcctgtgggtggcaccgccaGKLLDAHKGQLPTRLffVAPPacccgtatggacgccgcacagttgaccgaagaaggctactacagcgtcttcggtaagagtTRMDAAQLTEEGYYSVFGKSggtgcgcgtatcgagatccctggctgttccctgtgtatgggtaaccaggcgcgtgtggcgGARIEIPGCSLCMGNQARVAgacggtgcaacggtggtttccacctctacccgtaacttcccgaaccgtctgggtactggcDGATVVSTSTRNFPNRLGTGgcgaatgtcttcctggcttctgcggaactggcggctgttgcggcgctgattggcaaactgANVFLASAELAAVAALIGKLccgacgccggaagagtaccagacctacgtggcgcaggtagataaaacagccgttgatactPTPEEYQTYVAQVDKTAVDTtaccgttatctgaacttcaaccagctttctcagtacaccgagaaagccgatggggtgattYRYLNFNQLSQYTEKADGVIttccagactgcggtttaa (SEQ ID NO 11)FQTAV- (SEQ ID NO : 12)下列表一顯示磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶的其它 例子，以及2-甲基檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶與2-甲基檸檬酸脫氫酶的例子。
上述之基因修飾微生物可以習知重組方法構筑完成，可參照，例如Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press。特別是，基因修飾微生物可過度表達上述一或多個酶。可利用聚合酶鏈鎖反應 (PCR)由其天然來源(可來自基因銀行)獲得編碼上述一或多個酶的DNA片段。此DNA片 段接著連接至適當的啟動子以形成表達框架(expression cassette)。在一實施例中，表達 框架包括連接啟動子的編碼序列。在另一實施例中，表達框架包括多個編碼序列，其皆連接 至啟動子。在此例子中，各編碼序列的5’端較佳具有核糖體結合位。若有需要，此編碼序 列為宿主微生物的最佳化編碼序列。本發明中所述之“啟動子”系指核酸序列，在宿主微生物中，此核酸序列的一部分 可開啟連接核酸序列的轉錄。啟動子至少包括RNA聚合酶結合位。啟動子可還包括一或 多個調控部分，其可控制啟動子的開啟/停止狀態。當以大腸桿菌作為宿主微生物時，代 表性的大腸桿菌啟動子包括，但不限于，β-內酰胺酶及乳糖啟動子系統(Chang et al., Nature 275 :615_624，1978)，SP6、T3、T5 及 T7RNAs 聚合酶啟動子(Studier et al. ,Meth. Enzymol. 185 :60_89，1990)，lambda 啟動子(Elvin et al.，Gene 87 123-126，1990)，trp 啟動子(Nichols and Yanofsky,Meth. In Enzymology 101 155-164，1983)以及Tac及Trc 啟動子(Russell et al. ,Gene 20 :231_243，1982)。當以酵母菌作為宿主微生物時，代表性 的酵母菌啟動子包括，但不限于，3-磷酸甘油酸激酶啟動子、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 啟動子、半乳糖激酶(GALl)啟動子、半乳糖表異構酶(galacto印imerase)啟動子、以及醇 脫氫酶(ADH)啟動子。在其它微生物中，適合用于表達基因的啟動子亦為熟悉此技術領域 人士所習知。接著，將上述之表達框架轉染至適合的微生物中，以獲得上述之基因修飾微生物， 篩選轉殖微生物，并證明一或多個酶過度表達的方法為熟悉此技術領域人士所習知，例如， 免疫墨點或酶活性分析。將此基因修飾微生物培養于適當的培養基中以產生衣康酸。此培 養基較佳具有葡萄糖或檸檬酸，其為產生衣康酸的前體。在充分的培養后，收集此培養基， 并分離分泌于培養基中的衣康酸。
實施例1.質粒及基因修飾大腸桿菌菌株本實施例中使用大腸桿菌BW25113 (rrnBT14 Δ lacZwl6hsdR514 Δ BraBADffl33 ArhaBA Dld78)及BL21 (dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal),請參照 Datsehko et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 97 =6640-6645,2000,以重組技術進行基因修飾。簡言之，將BW25113的內源性icd基因 以FLP-FRT重組技術破壞，以獲得BW25113突變株(即PCI400)。相較于BW25113，BW25113
突變株的異檸檬酸脫氫酶表達量較低。將一些質粒轉染至母菌株及PCI400中，此質粒如表二所述，其以重組技術構筑完 成。表二、質粒的表達 *luc(VF) :V. fischeri 螢光素酶(Iuciferase)。*cad (AT) :A. terreus順式烏頭酸脫羧酶基因。^acnA(EC)大腸桿菌烏頭酸酶A基因。*acnB(EC)大腸桿菌烏頭酸酶B基因。*gltA(EC)大腸桿菌檸檬酸合成酶基因。*ppc(EC)大腸桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因。將表二中所述之一或多個質粒轉染至BW25113、PCI400、或BL21以獲得各種修飾 的大腸桿菌菌株，如表三所示。表三、基因修飾之大腸桿菌菌株 此外，關于質粒和修飾菌株的構建參考(I)Atsumi, S. , Hanai,T. ,Liao,J.C. ,2008. Engineering syntheticnon-ferment ative pathways for production of branched—chain higheralcohols as biofuels. Nature 451,86-89 ；(2)C. R. Shen, J. C. Liao. 2008. Metabolic engineering of Esche richiacoli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acidpathways. Metabolic Engineering 10(2008)312—320。2.以PCI 213表達衣康酸PCI 213菌株(BL21過度表達土曲霉(A. terreus)之CAD)于37 °C下培養于 LB(Luria-Bertani)培養基隔夜，再接種(1%)至基礎培養基，其包括80g/L的葡萄糖、氯 化鈉、及磷酸鹽緩沖液，并于30°C下培養適當的期間，直到0D_達0. 2-0. 6。接著，添加異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，0.5mM)至培養基中以誘導CAD的表達。24小時后，收集 此培養基。培養基中衣康酸的濃度為約100mg/l。3.以PCI010表達衣康酸PCI010菌株(BW25133過度表達土曲霉(A. terreus)之CAD)于37°C下培養于基 礎培養基隔夜，基礎培養基包括40g/L的葡萄糖、氯化鈉、及磷酸鹽緩沖液。將此隔夜培養 基接種至M9培養基中，其包括20或40g/L的葡萄糖、氯化鈉、及磷酸鹽緩沖液，另含有或 不含有ImM的麩氨酸(Vetsin)，于30°C下培養。當OD6tltl達0. 2-0. 4時，加入0. 5mM的異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養基中以誘導土曲霉(A. terreus)之CAD的表達。培 養24小時后，測定衣康酸的含量。此結果如表四所示。表四、PCI010的衣康酸表達 4.以葡萄糖為基質，于各種修飾的大腸桿菌菌株表達衣康酸將表五所述之修飾大腸桿菌菌株在37°C下，于旋轉震蕩器(250rpm)中，培養于LB (Luria-Bertani)培養基隔夜，再接種至M9培養基中，其包括20g/L的葡萄糖、lg/L的酵 母萃取物、氯化鈉、及磷酸鹽緩沖液，于37°C下培養。當OD6tltl達0. 2-0. 4時，加入0. 5mM的 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養基中以誘導外源性基因表達。分別于不同的時 間點收集培養基，并測定培養基中衣康酸的含量，如表五所示。表五、基因修飾大腸桿菌菌株中衣康酸的表達 如表五所示，PCI519 (BW25133 ； Δ icd, gltA, ppc, cad 及 acnA)及 PCI516 ( Δ icd, gltA，ppc，cad及acnB)菌株在培養72小時后，培養基中具有超過4g/L的衣康酸。PCI 519 與PCI 516的葡萄糖-衣康酸轉換率分別為，每公克的葡萄糖可轉換0. 52g衣康酸及0. 68g 衣康酸。5.以檸檬酸為基質，于各種修飾的大腸桿菌菌株表達衣康酸將PCI 513(BW25133 ； Δ icd，cad 及 acnB)、PCI 516 及 PCI 519 于 37°C下培養于LB培養基16小時。接著，將此大腸桿菌菌株接種至含0. 5mMIPTG的新鮮LB培養基中培養 16小時。將上述細胞以Triton X_100處理后，并重新懸浮于含50mg/ml檸檬酸的磷酸緩沖 液中。于48或72小時后，檢測培養基的衣康酸含量。PCI 513在培養48小時后可產生1.27g/L的衣康酸。此菌株的葡萄糖-衣康酸轉 換率為每公克的檸檬酸轉換0. 24g衣康酸。PCI 519及PCI 516在培養72小時后可分別產生6g/L及5g/L的衣康酸。PCI 519及PCI 516菌株的葡萄糖-衣康酸轉換率分別為，每公克的檸檬酸轉換0. 61g衣康酸及 0. 34g衣康酸。6.以甘油為基質，于各種修飾的大腸桿菌菌株表達衣康酸將PCI 519及PCI 543的E. coli菌株在37°C下，于旋轉震蕩器(250rpm)中，培養 于LB(Luria-Bertani)培養基隔夜，再接種至TB培養基中，其包括20_50g/L的甘油、24g/ L的酵母萃取物、12g/L胰蛋白胨(tryptone)、及磷酸鹽緩沖液，于37°C下培養。當0D_達 0. 2-0.4時，加入0. 5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養基中以誘導外源性基 因表達。于24小時后收集培養基，并測定培養基中衣康酸的含量，如表六所示。表六、基因修飾大腸桿菌菌株中衣康酸的表達 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發明，任何熟習此技 藝者，在不脫離本發明之精神和范圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護范圍 當視后附之中請專利范圍所界定者為準。
權利要求
一種基因修飾微生物，包括第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，該第一外源性核酸序列連接至啟動子，以及突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶，該突變之內源性icd基因的檸檬酸脫氫酶表達量低于其野生型的表達量。
2.根據權利要求1所述之基因修飾微生物，其中該微生物選自下組曲霉 (Aspergillus)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、德克酵母菌 (Dekkera)、腸桿菌(Enterobacter)、腸球菌(Enterococcus)、埃希氏菌(Escherichia) > 歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、乳 桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、摩根氏菌(Morganella)、團泛菌 (Pantoea)、果膠桿菌(Pectobacterium)、青霉菌(Penicillum)、畢赤酵母菌(Pichia)、 變形桿菌(Proteus)、假單胞菌(Pseudomonas)、二形性酵母菌(Pseudozyma)、紅酵母菌 (Rhodotorula)、沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、志賀氏菌(Shigella)、酵 母菌(Saccharomyces)、黑穗菌(Ustilago)及耶氏酵母菌(Yarrowia)。
3.根據權利要求2所述之基因修飾微生物，其中該微生物包括黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、擔子菌類酵 母菌(Pseudozyma Antarctica)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)或釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
4.根據權利要求1所述之基因修飾微生物，還包括第二外源性核酸序列，其編碼選自 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶、烏頭酸酶及 2-甲基檸檬酸脫氫酶中的至少一種多肽，且該第二外源性核酸序列連接至啟動子。
5.根據權利要求4所述之基因修飾微生物，其中該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶或烏頭酸酶，且 該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
6.根據權利要求4所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇 丙酮酸羧化酶，且該微生物還包括第三外源性核酸序列，其編碼選自檸檬酸合成酶、2-甲基 檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶、烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶中的至少一種多肽，該第 三外源性核酸序列連接至啟動子。
7.根據權利要求6所述之基因修飾微生物，其中該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶或烏頭酸酶，且該烏頭酸酶為烏頭酸酶A 或烏頭酸酶B。
8.根據權利要求4所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸合 成酶、2-甲基檸檬酸合成酶或檸檬酸裂解酶，且該微生物還包括第三外源性核酸序列，其編 碼烏頭酸酶或2-甲基檸檬酸脫氫酶，該第三外源性核酸序列連接至啟動子。
9.根據權利要求8所述之基因修飾微生物，其中該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，該第三外源性核酸序列編碼烏頭酸酶， 且該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
10.根據權利要求6所述之基因修飾微生物，其中該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸 合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶或檸檬酸裂解酶，且該微生物還包括第四外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶或2-甲基檸檬酸脫氫酶，該第四外源性核酸序列連接至啟動子。
11.根據權利要求10所述之基因修飾微生物，其中該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，該第四外源性核酸序列編碼烏頭酸酶， 且該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
12.—種基因修飾微生物，包括第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶，以及第二外源性核酸序列，其編碼選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬 酸合成酶及檸檬酸裂解酶中的至少一種多肽，其中該第一及第二外源性核酸序列分別連接至啟動子。
13.根據權利要求12所述之基因修飾微生物，其中該微生物選自下組曲霉 (Aspergillus)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、德克酵母菌 (Dekkera)、腸桿菌(Enterobacter)、腸球菌(Enterococcus)、埃希氏菌(Escherichia) > 歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、乳 桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、摩根氏菌(Morganella)、團泛菌 (Pantoea)、果膠桿菌(Pectobacterium)、青霉菌(Penicillum)、畢赤酵母菌(Pichia)、 變形桿菌(Proteus)、假單胞菌(Pseudomonas)、二形性酵母菌(Pseudozyma)、紅酵母菌 (Rhodotorula)、沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、志賀氏菌(Shigella)、酵 母菌(Saccharomyces)、黑穗菌(Ustilago)及耶氏酵母菌(Yarrowia)。
14.根據權利要求13所述之基因修飾微生物，其中該微生物為黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、擔子菌類酵 母菌(Pseudozyma Antarctica)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)或釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
15.根據權利要求12所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶，且該微生物還包括第三外源性核酸序列，其編碼選自檸檬酸合成酶、2-甲 基檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶、烏頭酸酶、及2-甲基檸檬酸脫氫酶中的至少一種多肽，且 該第三外源性核酸序列連接至啟動子。
16.根據權利要求12所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸 合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶或檸檬酸裂解酶，且該微生物還包括第三外源性核酸序列，其 編碼烏頭酸酶或2-甲基檸檬酸脫氫酶，且該第三外源性核酸序列連接至啟動子。
17.根據權利要求15所述之基因修飾微生物，其中該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸 合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶或檸檬酸裂解酶，且該微生物還包括第四外源性核酸序列，其 編碼烏頭酸酶或2-甲基檸檬酸脫氫酶，該第四外源性核酸序列連接至啟動子。
18.根據權利要求14所述之基因修飾微生物，其中該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，該第二外源性核酸序列連接至大腸桿菌啟動子，且編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或檸 檬酸合成酶。
19.根據權利要求18所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶，且該微生物還包括第三外源性核酸序列，其編碼檸檬酸合成酶或烏頭酸 酶，該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B，且該第三外源性核酸序列連接至大腸桿菌啟動 子。
20.根據權利要求18所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸 合成酶，且該微生物還包括第三外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該烏頭酸酶為烏頭酸酶 A或烏頭酸酶B，且該第三外源性核酸序列連接至大腸桿菌啟動子。
21.根據權利要求19所述之基因修飾微生物，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶，該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，該微生物還包括第四外源性 核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B，且該第四外源性核酸 序列連接至大腸桿菌啟動子。
22.—種生產衣康酸的方法，包括提供基因修飾微生物，其包括編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)之外源性核酸序列，該外 源性核酸序列連接至啟動子，以及突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶，其中該 突變之內源性icd基因的檸檬酸脫氫酶表達量低于其野生型的表達量；于培養基中培養該基因修飾微生物；以及由該培養基中分離衣康酸。
23.根據權利要求22所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的葡萄糖。
24.根據權利要求22所述之生產衣康酸的方法，其中該基因修飾微生物被透化，且該 培養基包括5-80g/L的檸檬酸。
25.根據權利要求22所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的甘油。
26.根據權利要求22所述之生產衣康酸的方法，其中該基因修飾微生物還包括第二外 源性核酸序列，其編碼選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶、 檸檬酸裂解酶、烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶中的至少一種多肽，且該第二外源性核酸 序列連接至啟動子。
27.根據權利要求26所述之生產衣康酸的方法，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶，且該基因修飾微生物還包括第三外源性核酸序列，其編碼選自檸檬酸 合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶、烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶中的至少 一種多肽，該第三外源性核酸序列連接至啟動子。
28.一種生產衣康酸的方法，包括提供基因修飾微生物，其包括第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶，以及第 二外源性核酸序列，其編碼選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成 酶及檸檬酸裂解酶中的至少一種多肽，其中該第一及第二外源性核酸序列分別連接至啟動 子；于培養基中培養該基因修飾微生物；以及由該培養基中分離衣康酸。
29.根據權利要求28所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的葡萄糖。
30.根據權利要求28所述之生產衣康酸的方法，其中該基因修飾微生物被透化，且該 培養基包括5-80g/L的檸檬酸。
31.根據權利要求28所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的甘油。
全文摘要
本發明系提供一種基因修飾微生物，其可大量生產衣康酸(itaconicacid)，以及此微生物的使用。
文檔編號C12R1/22GK101886045SQ201010178010
公開日2010年11月17日 申請日期2010年5月11日 優先權日2009年5月11日
發明者張珮菁, 詹姆士·C·廖 申請人:財團法人工業技術研究院