專利名稱：控制乙醇產生的方法
技術領域：
本發明涉及控制乙醇產生和乳酸的高產率技術，且更具體地涉及利用酵母的適于產生乳酸的高表達系統。
背景技術：
由于重組DNA技術的進步，通過使外源基因自身在宿主如微生物、霉菌、動物、植物或昆蟲中表達，并使含該基因的轉化體生長以獲得靶基因產物的技術已得到發展。例如，通過培養酵母等，經發酵生產是可能產生大量靶基因產物的。
已進行了多種嘗試來利用酵母產生L-乳酸。也嘗試將牛乳酸脫氫酶(LDH)基因插入釀酒酵母來產生L-乳酸(Eri Adhi等，“通過表達乳酸脫氫酶和缺失丙酮酸基因來修飾釀酒酵母的代謝途徑，用于乳酸在低pH值發酵”，J.Ferment.Bioeng.，86卷，No3，284-289，1988；Danio Porro等，“開發產生乳酸的代謝工程釀酒酵母”，Biotechnol.Prog.，11卷，294-298，1995，Kohyo(特表2001-516584號日本公報))。然而，在這些報告中均未觀察到大量L-乳酸的產生。
已公知釀酒酵母中的丙酮酸脫羧酶有多種同工酶。在常見酵母中，丙酮酸脫羧酶1發揮作用。然而，如果由于破壞了主要基因等，使得該基因得不到表達，丙酮酸脫羧酶5發揮作用，因此，可維持乙醇的產生(“酵母丙酮酸脫羧酶基因表達的自動調節需要該酶，但不需要它的催化活性”，Ines Eberhardt，Hakan Cederberg，Haijuan Li，Stephen Koning，FrankJordan和Stephen Hohmann，Eur.J.Biochem.，Vol.262，191-201，1999)。

發明內容
如上所述，在釀酒酵母內產生大量L-乳酸的技術以前還未得到完善。本發明的目的之一是提供通過控制具有丙酮酸脫羧酶基因如釀酒酵母的宿主生物體內乙醇產生而穩定、大量產生乳酸的技術。
本發明的發明者將研究集中于在釀酒酵母內產生乳酸時得到表達的乳酸脫氫酶(LDH)，并發現這樣的轉化體可有效產生乳酸，該轉化體已導入編碼具有乳酸脫氫酶活性、并且所提供的丙酮酸底物親和力可等于或超過宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力的外源蛋白質的DNA。丙酮酸是導致乙醇產生的丙酮酸脫羧酶的常見底物；乳酸脫氫酶作為乳酸產生的催化劑；等等。現在，與丙酮酸脫羧酶比較，在該轉化體中乳酸脫氫酶對丙酮酸具有更高水平的底物親和力；因此，抑制了通過丙酮酸脫羧酶催化的乙醇產生，并促進了通過外源乳酸脫氫酶催化的乳酸產生。以這種方式，通過該轉化體是可增加乳酸產量的。
基于以上發現，公開下述發明本發明的一個方面是公開了這樣的轉化體，所述轉化體中已導入編碼具有乳酸脫氫酶活性、并且其所提供的丙酮酸底物親和力可等于或超過宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力的外源蛋白質的DNA。本發明也提供這樣的轉化體，該轉化體中導入了在宿主染色體上丙酮酸脫羧酶基因的啟動子調控下的或替代所述啟動子的所述啟動子同源物調控下的編碼外源蛋白質的DNA。
本發明轉化體中的上述外源蛋白質應優選的是牛乳酸脫氫酶或其同源物。如果是由序列號1所示的氨基酸序列或其同源物組成，該蛋白質尤其有效。此外，上述蛋白質優選的由序列號3中所示的DNA序列編碼。該DNA序列優選地為由該轉化體擁有的如序列號4中所示的DNA序列。
宿主染色體上的上述啟動子應優選的是丙酮酸脫羧酶1基因啟動子。此外，該啟動子應優選地使用序列號2中所示的DNA序列或其同源物。
在本轉化體中，上述宿主生物體應優選來自酵母屬，以及更為優選的是釀酒酵母。
本發明的另一方面是公開了乳酸制造方法，提供了培養該轉化體的方法和從上述方法中獲得的培養產物中分離乳酸的方法。該方法可穩定且有效地制造乳酸。
附圖簡述

圖1圖1圖解了釀酒酵母的密碼子使用和使用頻率。
圖2圖2圖解了牛源LDH和經修飾LDH的堿基序列的同源性分析結果。頂行顯示牛源LDH的堿基序列，而底行顯示經修飾的堿基序列，其中與牛源LDH堿基序列不同的堿基以符號(A、T、C或G)表示。
圖3圖3圖解了在實施方案1和合成步驟(步驟1-4)中所使用的用于PCR合成長鏈DNA的引物結構。
圖4圖4圖解了構建的載體pBTrp-PDC1-LDHKCB的質粒圖譜。
圖5圖5圖解了圖5中所示的構建該載體的部分過程。
圖6圖6圖解了pBTrp-PDC1-LDH構建過程的另一部分。
圖7圖7圖解了pBTrp-PDC1-LDH構建過程的另一部分。
圖8圖8圖解了圖5中所示構建該載體的過程(最后步驟)的另一部分。
圖9圖9圖解了在一個實施方案中獲得的轉化體的染色體DNA的目標位點的結構變化。
圖10圖10圖解了在一個實施方案中產生的乳酸和乙醇產量的百分比。
圖11圖11圖解了在一個實施方案中產生的乳酸和乙醇產量百分比的趨勢。
圖12圖12圖解了牛L-乳酸脫氫酶的丙酮酸飽和曲線。
圖13圖13圖解了牛L-乳酸脫氫酶的Lineweaver-Burk曲線。
圖14圖14圖解了構建具有編碼來源于乳酸菌中的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)L-乳酸脫氫酶的DNA片段的載體(pBTrp-PDC1P-LDH；7.11kb)的部分過程。
圖15圖15圖解了構建具有編碼來源于乳酸菌中的長雙歧桿菌L-乳酸脫氫酶的DNA片段的載體(pBTrp-PDC1P-LDH；7.11kb)的另一部分過程；該解了圖14所示過程的后期階段。
圖16圖16圖解了來源于酵母的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸飽和曲線。
圖17圖17圖解了來源于酵母的丙酮酸脫羧酶的Lineweaver-Burk曲線。
本發明優選的實施方案本發明的實施方案詳述如下。
(轉化體)轉化體中表達的外源蛋白質具有乳酸脫氫酶(LDH)活性，并且轉化體所具有的丙酮酸底物親和力可等于或超過欲轉化的宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力。
這里，從生物體如酵母的糖酵解系統的丙酮酸產生乳酸的反應中，LDH作為介導反應的酶已眾所周知。這里，乳酸包括L(+)乳酸和D(-)乳酸，但優選的是L(+)乳酸。L(+)乳酸由L(+)-LDH產生，D(-)乳酸由D(-)-LDH產生。
LDH可作為本發明的外源蛋白質。根據生物體的種類，甚至在一種生物體中，也存在不同的同源物。本發明中，具有LDH活性的蛋白質包括天然LDH和通過化學合成或基因工程合成的人工LDH。
LDH應優選來源于真核微生物如酵母；和更為優選地來源于高等真核生物，如植物、動物或昆蟲；以及甚至更為優選地來源于更高等真核生物，包括哺乳動物如牛。牛源LDH是最為優選的。牛源LDH的一個例子是由序列號1中所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
來源于肌肉、心臟等的牛源LDH可以得到，并可以使用。可以使用酶編號為EC1.1.1.27的酶。
此外，本發明的外源蛋白質包括這些型別LDH的同源物。LDH同源物包括具有LDH活性、在天然來源LDH的氨基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加一個或幾個氨基酸的蛋白質，以及在氨基酸序列上與天然來源的LDH具有至少70％、更為優選地具有至少80％同源性且具有LDH活性的蛋白質。
應當指出，只要起始蛋白質的功能得到維持，氨基酸序列中變異的數量不受到限制，但優選的應在氨基酸總數的70％以內、更為優選的是30％以內、最為優選的是20％以內。
例如，預期的同源物應是在序列號1所示的氨基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加一個或幾個氨基酸、并具有LDH活性的蛋白質；或其氨基酸序列與序列號1中所示的氨基酸序列具有至少70％、更為優選的是具有至少80％同源性并且具有LDH活性的蛋白質。
應當指出，序列同源性可利用如BLAST(http://blast.genome.ad.jp/)或FASTA(http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html)進行同源性檢索而確定。
利用位點特異性移位導入法(Current Protocols I Molecular Biology，Ausubel等編輯(1987)Publish.John Wily & Sons Selection 8.1-8.5)等，根據需要將替換、缺失、插入和/或添加變異導入欲修飾的氨基酸序列，可實現氨基酸序列的修飾。此類修飾不受限于變異的人工導入或合成，并且包括通過人工變異處理產生的修飾和自然界中通過氨基酸變異產生的修飾。
本發明中使用的外源蛋白質應優選對丙酮酸具有高底物親和力。這里，底物親和力是指在如式(1)所示的米氏方程(Michaelis-Menten equation)中的Km值。
數學表達式1V0＝k2E0[S]/([S]+Km).............(1)應當指出，V0是穩態初速度，[S]是底物濃度，[ES]是由酶和底物組成的復合體的濃度，E0是酶的總濃度，k2是ES→E+S的速度常數。
米氏方程是基于底物S、酶E、底物-酶復合體ES和產物P之間的關系，如下述的式(2)所示。k1是從底物S和酶E產生復合體ES的平衡常數，k2是從復合體ES產生產物P和酶E的平衡常數，k1是從復合體ES分解成酶E和底物S的平衡常數。
數學表達式2 這里，利用下述式(3)從常數中定義Km。
數學表達式3V0＝k2[ES]k1[E][S]＝(k2+k1)[ES][E][S][ES]=k2+k-1k1=Km......(3)]]>此外，如式(4)所示，Km可用多種濃度代替。
數學表達式4Km＝(E0-[ES])[S]/[ES].........(4)例如利用水平軸顯示底物濃度，垂直軸顯示初速度作圖，底物親和力可通過在固定酶濃度的條件下確定底物濃度[S]和初速度V0之間的關系來確定。底物親和力也可從Lineweaver-Burk曲線確定。
與宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶相比較，本發明中外源蛋白質的丙酮酸底物親和力應優選地等于或超過該酶的丙酮酸底物親和力。底物親和力應優選地在相同溫度和pH條件等之下比較。溫度和pH條件可通過考慮宿主生物體中這些酶進行催化的環境來確定。例如，這些酶的底物親和力應優選地在溫度30-37℃、pH6.0-7.5之間測量。
外源蛋白質的丙酮酸底物親和力應優選地約是1.5mM或更少。因為如果丙酮酸底物親和力超過1.5mM，宿主生物體的丙酮酸脫羧酶傾向于與丙酮酸反應。更為優選的是，該值應為1mM或更少。甚至更為優選的是，該值應為0.5mM或更少，以及最為優選的應是0.1mM或更少。
此外，外源蛋白質的丙酮酸底物親和力應優選地等于或超過宿主生物體的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力。如果外源蛋白質的丙酮酸底物親和力低于宿主生物體的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力，宿主生物體的丙酮酸脫羧酶傾向于與丙酮酸反應。在本說明書中，相等的底物親和力表示相應的底物親和力即Km值是相等的；更高的底物親和力表示一個底物親和力(Km值)低于另一相應的Km值。
已將編碼這種外源蛋白質的DNA導入本發明的轉化體。對該DNA的來源沒有限制，可是cDNA、基因組DNA、合成DNA等等。
此外，本發明的DNA可具有天然來源編碼LDH的堿基序列、或其堿基序列部分或全部得到修飾并編碼具有LDH活性的蛋白質的DNA。它也可以是具有天然來源的編碼或合成LDH同源物的堿基序列的DNA。
本發明所使用DNA可具有的堿基序列為在欲轉化的宿主生物體經常使用的密碼子使用。例如，該DNA可具有酵母屬，尤其是具有釀酒酵母所利用的密碼子使用的遺傳學編碼的堿基序列。
應當指出，DNA可化學合成、或利用Fujimoto等(Hideya Fujimoto，Synthetic Gene Creation Method，Plant Cell Engineering Series 7，PlantPCR Experiment Protocol，1997，Shujunsha Co.Ltd.，p95-100)研制的方法合成，它是合成長鏈DNA所公知的方法。
(DNA構建體)
通過將編碼外源蛋白質氨基酸序列的DNA導入宿主生物體，并讓該DNA編碼的蛋白質表達，可在宿主細胞中產生乳酸。
對于轉化，可使用在宿主細胞內表達包含含有本發明DNA的DNA片段的DNA構建體。轉化中DNA構建體的形式不以任何方式受到限制，并且根據外源基因的導入方式(染色體外或染色體內)或宿主細胞的類型，可選擇和采用質粒(DNA)、噬菌體(DNA)、反轉錄轉座子(DNA)或人工染色體(YAC、PAC、BAC、MAC等)。此外，對DNA構建體無結構限制，如可為線狀或環狀。因此，DNA構建體可具有任一所述載體的片段和本發明的DNA。優選的原核細胞載體、真核細胞載體、動物細胞載體和植物細胞載體在本領域已眾所周知。
應當指出，例如質粒DNA可是YCp型的大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123；YEp型大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pYES32或YEp13；YIp型大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135；來源于大腸桿菌的質粒(ColE型質粒，如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A；pIA型質粒，如pACYC177或pACYC184；pSC101型質粒，如pMW118、pMW119、pMW218、pMW219等等)；或來源于枯草芽孢桿菌的質粒(pUB110、pTP5等)。例如，噬菌體DNA可是λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt100、gt11、或zap)、φX174、M13mp18、或M13mp19。例如反轉錄轉座子可是Ty因子。例如YAC可以是pYACC2。
例如，利用合適的限制性酶將含本發明DNA的片段切割，并將該片段插入所使用載體DNA的限制性酶位點或多克隆位點產生本發明的DNA構建體。
提供的本發明DNA構建體的第一種形式具有與包含本發明DNA的DNA片段連接的啟動子片段，以便所述DNA片段可表達。換句話說，本發明的DNA片段可受啟動子控制地連接于啟動子下游。
優選地使用酵母表達本發明DNA產物，即具有LDH活性的蛋白質，因此，使用在酵母內表達自我的啟動子是優選的。對這種啟動子，優選的是使用，例如丙酮酸脫羧酶基因啟動子、gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克蛋白啟動子、MFα1啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子或AOX1啟動子。尤其是，來源于酵母屬的丙酮酸脫羧酶1基因啟動子是優選的，并且使用來源于釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶1基因啟動子更為優選。這是因為，在酵母屬(釀酒酵母)的乙醇發酵過程中，這些啟動子得到高水平表達。應當指出，利用PCR擴增法，使用酵母屬的酵母丙酮酸脫羧酶1基因的基因組DNA作為模板分離所述啟動子序列。來源于釀酒酵母的所述啟動子的堿基序列如序列號2所示。對于本發明DNA構建體的啟動子片段，可使用包含序列號2所述的堿基序列的DNA、包含其中具有一個或幾個堿基缺失、替換、或添加的序列號2所述堿基序列并具有啟動子活性的DNA、或在嚴謹條件下與來源于序列號2所示的部分或全部堿基序列的DNA雜交、或與其互補鏈雜交并具有啟動子活性(換句話說，為所述啟動子的同源物)的DNA。
提供的本發明DNA構建體的第二種或另一種形式具有本發明DNA和用于宿主染色體同源重組的DNA片段。用于同源重組的DNA片段是與DNA欲導入的宿主染色體目標位點鄰近的DNA序列同源的DNA序列。應提供用于同源重組的至少一個、優選的兩個DNA片段。例如，用于同源重組的兩個DNA片段應優選具有與染色體目標位點上游和下游DNA同源的DNA序列，并且本發明DNA應優選連接在這些DNA片段之間。
當通過同源重組的方法將本發明DNA導入宿主染色體時，可將本發明DNA以受宿主染色體上的啟動子調控的狀態導入。在這種情況下，通過導入本發明DNA，可同時破壞由上述啟動子控制的內源基因，并允許該外源DNA表達，而內源基因不表達。當上述啟動子在宿主細胞中為高表達的啟動子時，這種方法尤為有效。
為在宿主染色體上創建這種表達系統，優選的是以宿主染色體中的高表達基因為目標，并將本發明DNA導入控制該基因的啟動子下游，以便該啟動子可控制本發明DNA。如果將乙醇發酵微生物如酵母作為宿主，可以以丙酮酸脫羧酶基因(尤其是丙酮酸脫羧酶1基因)作為目標，并導入在內源丙酮酸脫羧酶基因啟動子控制下的編碼LDH活性蛋白質的DNA。在這種情況下，可用于同源重組的DNA片段與丙酮酸脫羧酶1基因的LDH結構基因區序列或其鄰近區(包括起始密碼子附近的序列、起始密碼子上游區的序列、和結構基因內部的序列)同源。優選地，以酵母屬(尤其是釀酒酵母)作為宿主，并使用靶向所述宿主丙酮酸脫羧酶1基因的DNA構建體。利用這種DNA構建體，僅使用單一載體破壞丙酮酸脫羧酶1基因和用LDH替換該結構基因就可實現。因為丙酮酸脫羧酶1基因是介導丙酮酸到乙醛的不可逆反應的酶，其基因的破壞預期可抑制由乙醛產生乙醇，并且同時促進LDH使用丙酮酸作為底物產生乳酸。
通過提供用于宿主染色體同源重組的DNA片段，甚至第一種DNA構建體也可變成用于同源重組的DNA構建體。在第一種DNA構建體中，該DNA構建體內的啟動子片段也可作為同源重組的DNA片段。例如，對宿主釀酒酵母，具有以釀酒酵母宿主染色體啟動子如丙酮酸脫羧酶1基因啟動子作為啟動子片段的DNA構建體構成了以上述基因1作為靶向位點的靶向載體。在這種情況下，第一種DNA構建體優選地提供具有與丙酮酸脫羧酶1基因的結構基因區同源的序列。
應當指出，可在DNA構建體中連接終止子并根據需要連接順式元件如增強子、剪接信號、polyA信號、選擇性標志物或核糖體結合序列(SD序列)。對選擇性標志物沒有特別的限制，可使用多種公知的標志，如藥物抗性基因或營養缺陷型基因。例如，可使用二氫葉酸還原酶基因、氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等等。
(通過DNA構建體轉化)DNA構建體一旦形成，可通過合適的方法將其導入合適的宿主細胞，如轉化法、轉染法、結合法、原生質體融合、電穿孔法、脂質體法、醋酸鋰法、粒子槍法、磷酸鈣沉淀法、農桿菌法、PEG法、或直接顯微注射法。導入DNA構建體后，在選擇培養基中培養經轉化細胞。
對宿主細胞，可使用細菌如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌；酵母如釀酒酵母、裂變酵母(Saccharmyces pombe)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)；昆蟲細胞如sf9或sf21；哺乳動物細胞如COS細胞或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)；來自甘薯、煙草等的植物細胞。宿主細胞優選導致乙醇發酵的微生物如酵母、或耐酸微生物，其實例包括以酵母屬為代表的酵母，如釀酒酵母。特別的實例包括釀酒酵母IFO2260株和YPH株。
在通過DNA構建體創建的轉化體中，DNA構建體的結構組分出現在染色體上或染色體外元件(包括人工染色體)上。如果DNA構建體維持在染色體外或基于隨機整合插入染色體時，以LDH的底物丙酮酸作為底物的其它酶如丙酮酸脫羧酶基因(在為酵母屬中酵母的情況下所述其它酶為丙酮酸脫羧酶1基因)優選通過靶向載體敲除。
當導入如上所述并可實現同源重組的DNA構建體后，則存在位于宿主染色體目標啟動子或置換所述啟動子的所述啟動子同源物下游并與之可調控地連接的作為本發明DNA的DNA片段。在酵母屬酵母的轉化體中，優選提供位于宿主染色體丙酮酸脫羧酶1基因啟動子下游或替換所述啟動子的所述啟動子同源物下游的本發明DNA，以便可通過所述啟動子調控本發明的DNA。
此外，選擇性標志基因和部分破壞的結構基因(在對應于DNA構建體同源序列的位置處)通常位于同源重組的本發明DNA下游。
本發明DNA是否插入目標啟動子的下游可利用PCR法或Southern雜交法驗證。例如，可通過從轉化體中提取DNA、利用導入位點特異引物進行PCR和在電泳中從PCR產物檢測預期條帶。備選地，也可使用熒光染料標記的引物進行PCR。這些方法是本領域技術人員所公知的。
(乳酸的生產)培養通過導入DNA構建體獲得的轉化體可在培養物中產生乳酸，它是外源基因的表達產物。然后通過從培養物中分離獲得乳酸。在本發明中，“培養物”包括培養上清、和培養細胞或微生物、和細胞或微生物的破碎物。
對于培養本發明的轉化體，培養條件可根據轉化體的類型選擇。這些培養條件是本領域工作人員所公知的。
對培養使用微生物如大腸桿菌或酵母作為宿主獲得的轉化體的培養基，可使用任何天然或合成的培養基，只要所述培養基含有微生物可利用的碳源、氮源和無機鹽等，并可有效培養轉化體。對碳源，可使用碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉或纖維素；有機酸如醋酸或丙酸；醇類如乙醇或丙醇。對氮源，可使用無機銨鹽或有機銨鹽，如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨或磷酸銨；其它含氮化合物；蛋白胨；肉膏；或玉米漿。對無機物，可使用磷酸鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅或碳酸鈣等。
培養通常在充氣條件下進行，如在30℃搖動培養或好氧攪拌培養6-24小時。在培養時，pH值應優選維持在2.0-6.0之間。pH值水平可利用無機或有機鹽、堿溶液等調節。在培養時，如果需要，可向培養基中加入抗生素如氨芐青霉素或四環素。
對培養使用動物細胞作為宿主獲得的轉化體，可使用通常使用的RPMI1640培養基或DMEM培養基，或加入胎牛血清等的上述任何一種培養基。通常在5％CO2、37℃培養1-30天。在培養時，根據需要，可向培養基中加入抗生素如卡那霉素或青霉素。
可利用分批法或連續法進行培養。對培養方法，可使用以乳酸鹽形式獲得乳酸的方法，當用堿如銨鹽或鈣鹽中和乳酸時形成如乳酸銨或乳酸鈣。也可使用以游離乳酸形式獲得乳酸的方法。
培養完成后，從培養物中分離作為基因產物的乳酸時，可使用多種常規純化方法的組合。例如，如果乳酸產生于轉化細胞內部，可使用常規方法從細胞中分離基因產物，如超聲破碎、研磨、或壓力破碎以破壞細菌細胞。在該個例中，需要的話，應加入蛋白酶。如果乳酸產生于培養上清，通過過濾、離心分離等從溶液中除去固體。
例如，培養過程完成后，培養液通過至少一步固體-液體分離過程分離成為固體和液體，如皮帶推進、離心分離或過濾推進。優選應用純化過程分離濾液。在純化過程中，例如，可使用電透析從含乳酸的濾液中移去有機酸和糖，而不移去乳酸，并獲得乳酸溶液或乳酸銨溶液。如果獲得乳酸銨溶液，可使用雙極性膜等分解銨以產生乳酸水溶液和氨水。如果上述濾液中除乳酸外的有機酸和糖的量很少，可不進行電透析、需要的話通過蒸發水份濃縮、然后使用雙極性膜。
應當指出，對培養液和粗提取級分，除上述純化乳酸或其鹽的方法之外，可使用多種純化和分離方法，如利用有機溶劑和蒸餾分離和提取。此外，需要的話，對培養液、粗提取級分或其純化產物通過酯化、丙交酯轉化、低聚合或預聚合，可獲得多種類型的乳酸衍生物。需要的話，可從乳酸發酵液中收集乳酸、其鹽、和一種或多種乳酸衍生物。
(實施方案)雖然本發明的實施方案如下所述，但不專門用于限制本發明的范圍。
(實施方案1設計L-乳酸脫氫酶基因的DNA序列)為在高等真核生物酵母屬的釀酒酵母中有效產生來源于牛的L-乳酸脫氫酶，我們設計了新的非天然存在的、用于編碼牛來源L-乳酸脫氫酶的氨基酸序列的DNA基因序列。
1)使用釀酒酵母經常使用的密碼子。
2)在跨越起始密碼子處，加入Kozaks序列(ANNATGG)。
3)盡可能除去mRNA中不穩定序列和重復序列。
4)使GC含量對整個序列的偏離一致。
5)采取措施保證在設計序列內部不產生不適合于基因克隆的限制性酶位點。
6)加入用于插入染色體的插入型載體兩端的限制性酶EcoR I、XhoI和Afl III。
對于酵母中的密碼子使用頻率，從密碼子使用數據庫(http://www.kazusa.or.jp/codon/)獲得的釀酒酵母密碼子使用如圖2所示，確定了頻繁用于特定氨基酸的密碼子(下劃線處的密碼子)。
編碼具有LDH活性的蛋白質的新DNA序列(999bp)(此后稱為LDHKCB基因)如序列號3所示，該序列基于上述設計方針2-5而獲得，并應用圖1所示密碼子使用中頻繁使用的密碼子。另外，包括序列號3所示DNA序列和其起始密碼子上游和其終止密碼子下游的DNA序列(1052bp)(此后稱為LDHKCB序列)如序列號4所示。
在序列號3所示的DNA序列中，與原始DNA序列使用的密碼子不同的密碼子在除甲硫氨酸之外的所有氨基酸中得到使用。應當指出，新采用的密碼子都是圖1所示中經常使用的密碼子。此外，圖2顯示原始牛源LDH基因和LDHKCB基因基于計算機的同源分析結果。如圖2所表明的那樣，發現在幾乎全部DNA序列上需要大量的替換。
(實施方案2LDHKCB序列的全合成)在本實施方案中，使用Fujimoto等的方法，該方法是合成長鏈DNA所公知的方法(Hideya Fujimoto，Synthetic Gene Creation Method，PlantCell Engineering Series 7，Plant PCR Experiment Protocol.1997，Shujunsha Co.Ltd.，p95-100)。該方法的原理如下合成約100mer的多條寡核苷酸引物以在3’端含有10-12mer之間的重疊。然后，缺失區域利用寡核苷酸引物之間的重疊區進行延伸、通過使用兩端引物進行PCR擴增。依次重復該操作以合成長鏈靶DNA。對PCR擴增儀，使用Gene AmpPCR system9700(PE Applied Biosystems Inc.)。
具體地，首先混合兩種欲連接的寡核苷酸引物，在KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)存在下，進行DNA延伸反應，條件為96℃ 2分鐘、68℃ 2分鐘、54℃ 2分鐘和72℃ 30分鐘。下一步，使用1/10的樣品作為模板進行PCR(聚合酶鏈反應)。在該反應中，樣品首先在96℃維持2分鐘，然后在兩端引物存在下完成25循環(每循環由96℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 90秒組成)，最后在4℃維持。對該反應，使用與DNA聚合酶一起供給的緩沖液和dNTP混合物等。
根據圖3進行一系列的重疊PCR以合成最終的目標基因片段。如圖3所示的所有28條引物(BA、B01、BB、B02、BC、B03、BD、B04、BE、B05、BF、B06、BG、B07、BH、B08、BI、B09、BJ、B10、BK、B11、BL、B12、BM、B13、BN和B14)的DNA序列分別如序列號5-32所示。確證合成的LDHKCB基因的堿基序列后，使用EcoR I限制性酶處理。然后使用標準方法，將該序列連接至pCR2.1 TOPO載體(Invitrogen)，其中該載體以同樣的方式使用EcoR I限制性酶處理。所得到的載體稱為pBTOPO-LDHKCB載體。
(實施方案3構建用于酵母染色體導入的載體)利用實施方案2中全合成的LDHKCB序列，構建酵母染色體插入型載體。該載體稱為pBTRP-PDC1-LDHKCB，并且其質粒圖譜如圖4所示。
1.為構建pBTRP-PDC1-LDHKCB分離PDC1P片段通過使用釀酒酵母YPH株(Stratagene Corp.)基因組DNA作為模板進行PCR擴增分離PDC1P片段。
利用快速DNA試劑盒(Bio101 Inc)、并根據附錄中所述的詳細方法，制備釀酒酵母YPH株的基因組DNA，其中該試劑盒是基因組制備試劑盒。利用分光光度計Ultro spec 3000(Amersham Pharmacia Biotech Inc)測量DNA濃度。
對PCR，使用據說可產生高精確擴增片段的Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.Ltd.)作為擴增酶。制備總體積為50μl的反應液，該溶液包含利用上述方法制備的釀酒酵母YPH株的基因組DNA 50ng、50pmol引物DNA和0.2U單位Pyrobest DNA聚合酶。利用PCR擴增儀系統(Gene Amp PCR system 9700，PE Applied Biosystems Inc.制造)，使反應液經過DNA擴增。PCR擴增儀的反應條件如下首先溶液在96℃維持2分鐘，然后經過25個循環(每循環由96℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 90秒組成)，最后維持在4℃。通過在1％ TBE瓊脂糖凝膠中電泳的方法，證明PCR擴增片段是所擴增的基因片段。應當指出，合成的DNA(Sawaday Technology Co.)作為反應的引物DNA，并且該引物的DNA序列如下所述。
將限制性酶BamH I位點加至PDC1P-LDH-U(31mer，Tm值為58.3℃)末端
ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C(序列號33)將限制性酶EcoR I位點加至PDC1P-LDH-D(31mer，Tm值為54.4℃)末端ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(序列號34)2.構建包含啟動子和靶基因的重組載體在來源于釀酒酵母丙酮酸脫羧酶1基因(PDC1)的啟動子序列控制下的牛源乳酸脫氫酶基因(LDH基因)用作靶基因。
用于構建本發明重組載體而構建的染色體插入型的新載體命名為pBTrp-PDC1-LDHKCB。構建本發明載體的實例詳述如下。該實施方案的概述圖解于圖5-8。應當指出，構建載體的方法不受限于這里所述的方法。
如上所述，當構建載體時，使用釀酒酵母YPH株基因組DNA作為模板進行PCR擴增，分離PDC1基因啟動子片段(PDC1P)971bp和PDC1基因下游區片段(PDC1D)518bp。雖然將上述方法用于PCR擴增，將下述引物作為擴增PDC1基因下游區片段的引物將限制性酶Xho I位點加至PDC1D-LDH-U(34mer，Tm值為55.3℃)末端ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C(序列號35)將限制性酶Apa I位點加至PDC1D-LDH-D(31mer，Tm值為54.4℃)末端ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(序列號36)通過上述反應獲得的PDC1P和PDC1D擴增基因片段各自經過乙醇沉淀過程純化后，將PDC1P擴增片段和PDC1D擴增片段分別與限制性酶BamH I/EcoR I和Xho I/Apa I反應。應當指出，下面所使用的全部酶由Takara Shuzo Co.Ltd.制造。另外，一系列詳細的乙醇沉淀過程的操作和限制性酶處理基于“分子克隆-實驗室手冊，第二版”(Maniatis等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)進行。
構建該載體的一系列反應操作根據普遍公知的DNA亞克隆方法進行。簡而言之，將通過上述PCR方法擴增的、并應用限制性酶處理的PDC1P片段連接至用限制性酶BamH I/EcoR I(Takara Shuzo)和去磷酸化酶堿性磷酸酶(BAP，Takara Shuzo)處理過的pBluescript II SK+載體(Toyobo)進行T4 DNA連接酶反應。對T4 DNA連接酶反應，使用LigaFast快速DNA連接系統(Promega Corporation)，下面是所包括的詳細方法。
下一步，使用其中連接反應已發生的溶液進行感受態細胞的轉化。對感受態細胞，使用大腸桿菌JM109株(Toyobo)，下面是所包括的詳細方法。將獲得的溶液涂布于含100μg/ml抗生素氨芐青霉素的LB平板上，并過夜孵育。使用插入片段的引物DNA、采用菌落PCR法和對通過miniprep制備的質粒DNA溶液進行限制性酶切來確證生長的菌落。然后分離目標載體(pBPDC1P載體)(圖5中間)。
下一步，如圖5中間所示，利用上述同樣的方法，將LDHKCB基因片段亞克隆至pPDC1P載體中，以創建pBPDC1P-LDHKCB載體(圖5下部)，其中LDHKCB基因片段通過限制性酶EcoR I和末端修飾酶T4DNA聚合酶加工由Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho構建的pBTOPO-LDHKCB載體而獲得，pBPDC1P載體同樣通過限制性酶EcoRI和末端修飾酶T4 DNA聚合酶加工。
另一方面，如圖6所示，利用上述同樣的方法，將LDH基因(來源于長雙歧桿菌)片段亞克隆至pBPDC1P載體以創建pBPDC1P-LDH1載體(圖6)，其中LDH基因片段通過限制性酶EcoR I/Aat II和末端修飾酶T4 DNA聚合酶加工由Toyata Jidosha Kabushiki Kaisha構建的pYLD1載體而獲得，pBPDC1P載體同樣通過限制性酶EcoR I和末端修飾酶T4DNA聚合酶加工。應當指出，上述pYLD1載體已導入大腸桿菌(名稱大腸桿菌pYLD1)，并根據布達佩斯條約(最初保藏日期1999年10月26日)進行了國際保藏，保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵政編碼305-8566日本茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)，保藏號為FERM BP-7423。
下一步，如圖7所示，用Xho I/Apa I處理該載體，并連接至經擴增的PDC1D片段以創建pBPDC1P-LDH載體(如圖7上部所示)，其中PDC1D片段以同樣的方式用限制性酶處理。最后，將用EcoRV加工的pBPDC1P-LDH II載體連接至Trp標記片段以構建pBTrp-PDC1-LDH載體，其中Trp標記片段通過對pRS404載體(Stratagene Inc.)應用AatII/Ssp I和T4 DNA聚合酶加工獲得。
下一步，如圖8所示，用限制性酶Apa I/EcoR I加工pBPDC1P-LDHKCB載體；另外，用限制性酶Apa I和Stu I將pBTrp-PDC1-LDH載體加工成含有Trp標記的片段。將擴增片段連接以構建為最終構建體的染色體插入型pBTrp-PDC1-LDHKCB載體。
為確證構建的染色體插入型pBTrp-PDC1-LDHKCB載體，實施堿基序列測定。將ABI PRISM310基因分析儀(PE Applied Biosystems Inc)用于分析堿基序列，并且如制備樣品和使用儀器的方法的細節按照分析儀附帶的說明書進行。作為樣品使用的載體DNA用堿提取法制備。使用樣品前，首先利用GFX DNA純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech Inc)進行柱純化，然后采用Ultro spec 3000分光光度儀(Amersham PharmaciaBiotech Inc)測量其DNA濃度。
(實施方案4酵母的轉化)根據Ito等研發的方法(Ito H，Y Fukuda，K Murata和A Kimura，轉化堿處理的完整酵母細胞，J Bacteriol，Vol.153，p163-168)，將基因導入酵母。簡而言之，酵母IFO2260株(發酵研究所注冊的酵母株，Osaka)在10mlYPD培養基中于30℃培養至其達到對數生長期，其中所述酵母株已除去色氨酸合成功能。然后收集酵母，并用TE緩沖液洗滌。下一步，加入0.5ml TE緩沖液和0.5ml 0.2M醋酸鋰，并將該混合物在30℃振動培養1小時。然后，用限制性酶Apa I和Sac I(均由Takara Shuzo制造)對染色體插入型pBTrp-PDC1-LDHKCB載體進行加工，并加至培養物中，其中所述載體利用實施方案3的方法構建。
本發明的酵母懸液于30℃搖動培養30分鐘后，加入150μl 70％聚乙二醇4000(Wako Pure Chemical Industries)，并將混合物充分攪拌。然后，混合物于30℃再振動培養1小時后，在42℃熱休克5分鐘。然后洗滌細菌，并懸于200μl水中，并將該溶液涂布于色氨酸選擇性培養基。
將獲得的菌落涂布于新的色氨酸劃線培養基，并且對顯示為穩定的經選擇菌株利用PCR分析檢查基因導入。通過在2ml YPHD培養基中過夜振動培養單克隆、收集菌體、加入500μl 50mM Tris-HCl和玻璃珠(425-600μm，酸洗滌，SIGMA)、并使混合物于4℃旋渦15分鐘，制備用于PCR的酵母基因組DNA。使該溶液的上清經過乙醇沉淀，并溶于50μl無菌水中。使用5μl制備的基因組DNA作為模板，在50μl反應液中實施PCR。將Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)用作DNA擴增的酶，并使用PCRamplifier Gene Amp PCR system 9700(PE Applied Biosystems Inc)。PCR擴增儀的反應條件如下將溶液首先于96℃維持2分鐘；然后使之經過30個循環(每個循環由96℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 90秒組成)；最后使之維持于4℃。使用的引物序列如下LDH-KCB-UTGG TTG ATG TTA TGG AAG AT(20mer)(序列號37)LDH-KCB-DGAC AAG GTA CAT AAA ACC CAG(21mer)(序號38)PDC1P-U3GTA ATA AAC ACA CCC CGC G(19mer)(序列號39)具有穩定色氨酸合成功能和利用這些引物通過PCR確證的菌株判定為已適當導入LDHKCB基因的轉化體。在本實施方案中，將獲得的命名為KCB-27、KCB-210和KCB211的三株菌株作為這樣的轉化體。圖9顯示這些釀酒酵母轉化體的基因組染色體結構。
(實施方案5測量轉化體中乳酸的產生量)對構建的三種轉化體實施發酵實驗。作為預培養，將轉化體在含有2％葡萄糖的YPD液體培養基中過夜培養。收集菌體并洗滌后，將其接種于含有15％葡萄糖的YPD液體培養基，以便使酵母菌濃度為1％(0.5g/50ml)，并使其于30℃發酵幾天。每24小時對該發酵液取樣，并估計L-乳酸的含量。對測量產量，使用生物傳感器BF-4(Oji ScientificInstruments)按照該儀器的使用者手冊所述的詳細測量方法進行。
圖10和表1顯示在含有15％葡萄糖的發酵第三天培養液中L-乳酸量和乙醇量的測量結果。至于KCB-27株，圖11和表2顯示在第0和5天之間的L-乳酸量和乙醇量的趨勢。



即使每個轉化體僅導入單一拷貝的LDHKCB基因，在每1升培養液中可證實乳酸有4.5-5.0％(45.0-50.0g)之間的產量，其中所述轉化體(KCB-27、KCB-210和KCB-211菌株)中已導入LDHKCB基因。同時，乙醇產量是5％，大約比親本菌株預期產量少2.5％。
本結果清楚地顯示，與過去報告的例子比，釀酒酵母中L-乳酸的產量有極為顯著的增加。此外，產量的增加推定是由于導入LDH，其中LDH具有等于或高于來源于酵母的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力。也同樣推定導入的在染色體丙酮酸脫羧酶1基因啟動子控制下的LDH在起作用。
上述結果顯示甚至單一拷貝可使產量產生顯著的增加。因此，推測導入2個或更多拷貝甚至將進一步增加產量。
(實施方案6測量來源于不同真核生物的L-乳酸脫氫酶的丙酮酸底物親和力(米氏常數和Km值))使用下述方法測量來源于牛的L-乳酸脫氫酶的丙酮酸底物親和力(米氏常數和Km值))。將結果與來源于乳酸菌的L-乳酸脫氫酶的丙酮酸底物親和力比較。
為測量丙酮酸底物親和力(Km值)，首先將丙酮酸、NADH和FBP加入至純化的L-乳酸脫氫酶使發生酶反應。然后，利用分光光度計(JASCO制造的Ubest-55)在ABS為340nm處測定NADH的減少率，并測定每種L-乳酸脫氫酶的活性。
下一步，基于在不同丙酮酸濃度水平下L-乳酸脫氫酶活性值，繪制丙酮酸飽和曲線并由計算出的各自倒數來繪制Lineweaver-Burk曲線。然后確定L-乳酸脫氫酶的丙酮酸底物親和力(米氏常數和Km值)。
通過將pH調整為7.0的50mM MOPS緩沖液(Narakai制造)、0.15mMNADH(SIGMA制造)、1mM FBP(SIGMA)加入0.05μg純化的牛肌肉來源的L-乳酸脫氫酶(SIGMA)制備溶液，將溶液于37℃維持2-3分鐘。
下一步，加入不同濃度(0.01-100mM)的丙酮酸(Wako Pure ChemicalIndustries)。快速混合后，將溶液放置于分光光度儀，并確定在ABS340nm處吸光值在1分鐘內的變化。
應當指出，利用下述公式(數學表達式5)確定LDH活性。
LDH活性值(U/mg蛋白質)＝(1分鐘內的吸光值變化/0.0063)×(1000μg/0.05μg)×(200μl/1000μl)×(1/1000)應當指出，根據1)Minowa T，Iwata S，Sakai H和Ohta T.，編碼L-乳酸脫氫酶的長雙歧桿菌基因的序列和特征以及該酶的一級結構；變構部位的新特征，Gene，1989，85卷，161-168和2)SIGMA乳酸脫氫酶(LDH/LD)附帶的使用者手冊中所述，實施上述操作。
基于獲得的LDH活性，以垂直軸為[V]＝LDH酶活性(U/mg)、水平軸為[S]＝丙酮酸濃度(mM)，創建丙酮酸飽和曲線。該圖如圖12所示。
此外，分別以1/[V]和1/[S]為垂直軸和水平軸，創建由所述各自倒數計算的Lineweaver-Burk曲線。圖13顯示該酶的曲線。
利用Lineweaver-Burk曲線和1/[V]軸的交點是1/Vmax，該曲線與1/[S]軸的交點是-1/Km，計算丙酮酸濃度底物親和力(Km值)。
每條Lineweaver-Burk曲線顯示，來源于牛肌肉的L-乳酸脫氫酶的丙酮酸底物親和力是0.1mM。本發明的發明者認為來源于乳酸菌長雙歧桿菌的L-乳酸脫氫酶的丙酮酸底物親和力是1.0mM。
通過將編碼來源于乳酸長雙岐桿菌的L-乳酸脫氫酶的DNA導入并使其高水平表達的重組酵母產生的L-乳酸和乙醇的量如下所述。(發酵條件是在含有15％葡萄糖的YPD培養基中于30℃培養3天)。圖14和15顯示了用于重組酵母中的所述乳酸菌來源LDH的載體(pBTrp-PDC1P-LDH；7.11kb)和構建該載體的過程。在所述的經轉化酵母中，通過PDC1啟動子將所述基因經敲入宿主染色體上的PDC基因座而可控導入。已證實，該經轉化酵母有2個拷貝，其中所述的L-乳酸脫氫酶基因已導入宿主染色體上的一對PDC基因座中。應當指出，除圖14和15所述的步驟以外，構建所述載體和轉化酵母的操作與實施方案3和4中的一致。
如表3所示，當將該結果與實施方案5中測試的、從牛肌肉來源的L-乳酸脫氫酶所獲得的結果比較，導入牛肌肉來源LDH的酵母產生的L-乳酸的量大約是導入乳酸菌來源LDH的酵母的2倍。


(實施方案7測量來源于酵母的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力(米氏常數和Km值))為測量酵母來源的丙酮酸脫羧酶活性和丙酮酸底物親和力(Km值)，首先將丙酮酸、NADH和維生素B1加入純化的丙酮酸脫羧酶進行酶反應。然后，利用分光光度儀確定NADH在ABS340nm處的減少率，并確定酵母來源的丙酮酸脫羧酶的活性。
下一步，基于在不同丙酮酸濃度下丙酮酸脫羧酶活性值，繪制丙酮酸飽和曲線并由計算出的各自倒數來繪制Lineweaver-Burk曲線。然后確定丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力(Michaelis常數和Km值)。
將下述溶液在4℃維持2-3分鐘，其中溶液的制備為向0.05μg純化的酵母來源丙酮酸脫羧酶(SIGMA)中加入pH調整為7.0的34mM咪唑HCl緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries制造)、0.15mM NADH(SIGMA制造)和0.2mM焦磷酸維生素B1(SIGMA)。
下一步，加入不同濃度水平(0.01-100mM)的丙酮酸(Wako PureChemical Industries)。快速混合后，將溶液放置于分光光度儀(JASCO制造的Ubest-55)，并確定于ABS340nm處，吸光值在1分鐘內的變化。
應當指出，利用下述公式(數學表達式6)確定PDC活性。
PDC活性值(U/mg蛋白質)＝(1分鐘內的吸光值變化/0.0063)×(1000μg/0.05μg)×(200μl/1000μl)×(1/1000)應當指出，根據Pronk JT，Steensma HY和Dijken JP.，釀酒酵母中丙酮酸的代謝，Yeast，1996，12卷，1607-1633所述的方法實施本操作。
基于獲得的PDC活性，以垂直軸為[V]＝PDC酶活性(U/mg)、水平軸為[S]＝丙酮酸濃度(mM)，創建丙酮酸飽和曲線。該圖如圖16所示。
此外，分別以1/[V]和1/[S]為垂直軸和水平軸，創建由所述各自倒數計算的Lineweaver-Burk曲線。圖17顯示該酶的曲線。利用Lineweaver-Burk曲線和1/[V]軸的交點是1/Vmax，該曲線與1/[S]軸的交點是-1/Km，計算丙酮酸濃度底物親和力(Km值)。
Lineweaver-Burk曲線顯示酵母來源丙酮酸脫羧酶的丙酮酸Km值是0.346mM。
0.346mM的數值是牛來源L-乳酸脫氫酶的丙酮酸Km值的3.46倍，其中后者在實施方案6中是0.1mM。換句話說，牛來源L-乳酸脫氫酶具有的底物親和力是酵母來源丙酮酸脫羧酶的3.46倍。
此外，0.346mM的數值是長雙歧桿菌來源L-乳酸脫氫酶的丙酮酸Km值的0.346倍，其中后者是1.0mM。換言之，所述乳酸菌來源L-乳酸脫氫酶的底物親和力僅為酵母來源的丙酮酸脫羧酶的0.346倍。
在本說明書中所有引用的出版物包括專利和專利申請說明書，它們構成了本說明書的一部分，如每一種出版物各自清楚地描述的那樣對它們全部引用。在引述中，日本專利申請號2001-286637、2002-128323、2001-287159、2002-128286、2002-65880和2002-65879中的專利申請說明書如每一說明書各自清楚地描述的那樣對它們全部引用，也構成了本說明書的一部分。
本申請的工業利用領域本發明也提供在具有丙酮酸脫羧酶基因的宿主生物體內控制產生乙醇和穩定大規模產生乳酸的技術。
序列號3編碼乳酸脫氫酶的經修飾DNA序列號4編碼乳酸脫氫酶的經修飾DNA序列號5-39引物序列表序列表<110>豐田自動車株式會社<120>控制乙醇產生的方法<130>PCTJP20007(TSN2002-299-WO-00)<140>
<141>
<160>39<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>332<212>PRT<213>牛的<400>1Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu1 5 10 15His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly20 25 30Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val35 40 45Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp50 55 60Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly65 70 75 80Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala85 90 95Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg100 105 110Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser
115 120 125Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr130 135 140Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly145 150 155 160Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu165 170 175Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu180 185 190His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly195 200 205Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys210 215 220Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu225 230 235 240Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val245 250 255Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro260 265 270Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe275 280 285Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val290 295 300Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala305 310 315 320Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe325 330<210>2<211>971
<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>2aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg 60aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca 120aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct 180ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa 240taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa 300tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt 360tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg 420gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc 480gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg 540ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga 600atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg 660tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta 720actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac 780ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatatta acaaggctct ttcactctcc 840ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc 900aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc 960ccccaattct c 971<210>3<211>999<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼乳酸脫氫酶的經修飾DNA<400>3atggctactt tgaaagatca attgattcaa aatttgttga aagaagaaca tgttccacaa 60aataaaatta ctattgttgg tgttggtgct gttggtatgg cttgtgctat ttctattttg 120atgaaagatt tggctgatga agttgctttg gttgatgtta tggaagataa attgaaaggt 180gaaatgatgg atttgcaaca tggttctttg tttttgagaa ctccaaaaat tgtttctggt 240aaagattata atgttactgc taattctaga ttggttatta ttactgctgg tgctagacaa 300caagaaggtg aatctagatt gaatttggtt caaagaaatg ttaatatttt taaatttatt 360attccaaata ttgttaaata ttctccaaat tgtaaattgt tggttgtttc taatccagtt 420gatattttga cttatgttgc ttggaaaatt tctggttttc caaaaaatag agttattggt 480tctggttgta atttggattc tgctagattt agatatttga tgggtgaaag attgggtgtt 540catccattgt cttgtcatgg ttggattttg ggtgaacatg gtgattcttc tgttccagtt 600tggtctggtg ttaatgttgc tggtgtttct ttgaaaaatt tgcatccaga attgggtact 660gatgctgata aagaacaatg gaaagctgtt cataaacaag ttgttgattc tgcttatgaa 720
gttattaaat tgaaaggtta tacttcttgg gctattggtt tgtctgttgc tgatttggct 780gaatctatta tgaaaaattt gagaagagtt catccaattt ctactatgat taaaggtttg 840tatggtatta aagaagatgt ttttttgtct gttccatgta ttttgggtca aaatggtatt 900tctgatgttg ttaaagttac tttgactcat gaagaagaag cttgtttgaa aaaatctgct 960gatactttgt ggggtattca aaaagaattg caattttaa999<210>4<211>1052<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼乳酸脫氫酶的經修飾DNA<400>4acagaattca caatggctac tttgaaagat caattgattc aaaatttgtt gaaagaagaa 60catgttccac aaaataaaat tactattgtt ggtgttggtg ctgttggtat ggcttgtgct 120atttctattt tgatgaaaga tttggctgat gaagttgctt tggttgatgt tatggaagat 180aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt tgtttttgag aactccaaaa 240attgtttctg gtaaagatta taatgttact gctaattcta gattggttat tattactgct 300ggtgctagac aacaagaagg tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt 360tttaaattta ttattccaaa tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 420tctaatccag ttgatatttt gacttatgtt gcttggaaaa tttctggttt tccaaaaaat 480agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 540agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt tgggtgaaca tggtgattct 600tctgttccag tttggtctgg tgttaatgtt gctggtgttt ctttgaaaaa tttgcatcca 660gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg ttcataaaca agttgttgat 720tctgcttatg aagttattaa attgaaaggt tatacttctt gggctattgg tttgtctgtt 780gctgatttgg ctgaatctat tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg 840attaaaggtt tgtatggtat taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 900caaaatggta tttctgatgt tgttaaagtt actttgactc atgaagaaga agcttgtttg 960aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 1020cttggttgaa cacgttgcca aggcttaagt ga 1052<210>5<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>5acagaattca caatggctac tttgaaagat caattgattc aaaatttgtt gaaagaagaa 60catgttccac aaaataaaat tactattgtt ggtgttggtg 100<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6acagaattca caatggctac20<210>7<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7atgataacaa ccacaaccac gacaaccata ccgaacacga taaagataaa actactttct 60aaaccgacta cttcaacgaa accaactaca ataccttcta 100<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8atgataacaa ccacaaccac20<210>9<211>100
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9tggttgatgt tatggaagat aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt 60tgtttttgag aactccaaaa attgtttctg gtaaagatta 100<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10tggttgatgt tatggaagat20<210>11<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11taacaaagac catttctaat attacaatga cgattaagat ctaaccaata ataatgacga 60ccacgatctg ttgttcttcc acttagatct aacttaaacc 100<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>12taacaaagac catttctaat a 21<210>13<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt tttaaattta ttattccaaa 60tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 100<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14tgaatctaga ttgaatttgg t 21<210>15<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15taacatttaa caaccaacaa agattaggtc aactataaaa ctgaatacaa cgaacctttt 60aaagaccaaa aggtttttta tctcaataac caagaccaac 100<210>16<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16taacatttaa caaccaacaa a 21<210>17<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>17agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 60agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt 100<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>18agagttattg gttctggttg t 21<210>19<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>19
cagaacagta ccaacctaaa acccacttgt accactaaga agacaaggtc aaaccagacc 60acaattacaa cgaccacaaa gaaacttttt aaacgtaggt 100<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>20cagaacagta ccaacctaaa a 21<210>21<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>21ctttgaaaaa tttgcatcca gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg 60ttcataaaca agttgttgat tctgcttatg aagttattaa 100<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>22ctttgaaaaa tttgcatcca g 21<210>23<211>100<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>23agacgaatac ttcaataatt taactttcca atatgaagaa cccgataacc aaacagacaa 60cgactaaacc gacttagata atacttttta aactcttctc 100<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>24agacgaatac ttcaataatt t 21<210>25<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>25tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg attaaaggtt tgtatggtat 60taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 100<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>26
atgaaaaatt tgagaagagt 20<210>27<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>27gacaaggtac ataaaaccca gttttaccat aaagactaca acaatttcaa tgaaactgag 60tacttcttct tcgaacaaac ttttttagac gactatgaaa 100<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>28gacaaggtac ataaaaccca g 21<210>29<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>29aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 60<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>30aaaaaatctg ctgatacttt g 21<210>31<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>31acgttaaaat tattgagctc gaaccaactt gtgcaacggt tccgaattca ct 52<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>32acgttaaaat tattgagctc g 21<210>33<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>33atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c31
<210>34<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>34atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31<210>35<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>35atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34<210>36<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>36atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>37tggttgatgt tatggaagat 20<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>38gacaaggtac ataaaaccca g 21<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>39gtaataaaca caccccgcg 19
權利要求
1.一種轉化體，其中已導入編碼具有乳酸脫氫酶活性、并且其所提供的丙酮酸底物親和力等于或超過宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力的外源蛋白質的DNA。
2.根據權利要求1的轉化體，其中上述外源蛋白質是牛來源的乳酸脫氫酶或其同源物。
3.根據權利要求1的轉化體，其中上述外源蛋白質為包含序列號1所示的氨基酸序列的蛋白質或其同源物。
4.根據權利要求3的轉化體，其中上述外源蛋白質由序列號3所示的DNA序列編碼。
5.根據權利要求4的轉化體，該轉化體具有序列號4所示的DNA序列，用作編碼上述外源蛋白質的DNA序列。
6.根據權利要求1的轉化體，其中上述宿主生物體屬于酵母屬。
7.根據權利要求2的轉化體，其中上述宿主生物體是釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。
8.根據權利要求1的轉化體，其中編碼上述外源蛋白質的DNA以可受到宿主染色體上丙酮酸脫羧酶基因的啟動子調控或替代所述啟動子的所述啟動子同源物調控的方式導入。
9.根據權利要求8的轉化體，其中所述外源蛋白質是牛來源乳酸脫氫酶或其同源物。
10.根據權利要求8的轉化體，其中上述宿主生物體屬于酵母屬。
11.根據權利要求9的轉化體，其中上述宿主生物體是釀酒酵母。
12.根據權利要求8的轉化體，其中上述啟動子是丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子。
13.根據權利要求8的轉化體，其中包含序列號2所述堿基序列或其同源物的DNA用作上述啟動子。
14.一種轉化體，其中已導入編碼具有乳酸脫氫酶活性、并且其所提供的丙酮酸底物親和力等于或超過宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力的外源蛋白質的DNA，其中宿主生物體為釀酒酵母，且其中編碼上述外源蛋白質的DNA以可受到宿主染色體上丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子調控或替代所述啟動子的所述啟動子同源物調控的方式導入。
15.根據權利要求14的轉化體，其中所述外源蛋白質是牛來源的乳酸脫氫酶或其同源物。
16.一種轉化體，其中編碼牛來源的乳酸脫氫酶或其同源物的DNA以可受到酵母屬宿主染色體上丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子調控或替代所述啟動子的所述啟動子同源物調控的方式導入，且其中宿主染色體上丙酮酸脫羧酶1的結構基因已受到破壞。
17.根據權利要求16的轉化體，其中上述宿主是釀酒酵母。
18.乳酸生產方法，該方法包括培養權利要求1所述轉化體的步驟和從上述步驟獲得的培養物中分離乳酸的步驟。
19.乳酸制造方法，該方法包括培養權利要求14所述轉化體的步驟和從上述步驟獲得的培養物中分離乳酸的步驟。
全文摘要
本發明提供了這樣的轉化體，所述轉化體已導入編碼具有乳酸脫氫酶活性且其所提供的丙酮酸底物親和力可等于或甚至超過宿主生物體所固有的丙酮酸脫羧酶的丙酮酸底物親和力的外源蛋白質的DNA。所述轉化體可在具有丙酮酸脫羧酶基因的宿主生物體內穩定地大規模產生乳酸。
文檔編號C12P7/56GK1639340SQ0380562
公開日2005年7月13日 申請日期2003年3月11日 優先權日2002年3月11日
發明者齋藤聰志, 早乙女理, 保谷典子, 松尾康生, 石田亙廣, 平井正名, 今枝孝夫, 宮崎力, 德弘健郎 申請人:豐田自動車株式會社