專利名稱：通過原生質體融合得到的乙醇抗性釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GP-01，其生產 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有乙醇抗性并包含高含量有機生物鍺的酵母和用于生產該酵母的方法。更具體地說，該方法包括通過釀酒酵母(Saccharomy ces cervisiae) (KCTC7904) 和乙醇假絲酵母(Candida ethanolica) (KCTC7181)的原生質體融合生產突變的釀酒酵母 (S. cervisiae)，即酵母GP-Ol，所述的酵母GP-Ol對高濃度乙醇具有抗性；將酵母GP-Ol與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)進行培養，以便通過生物轉化將鍺接種到酵母GP-Ol中；和最終獲得具有乙醇抗性并包含高含量有機生物鍺的突變的酵母(以下稱酵母Ge-3I)。
背景技術：
鍺分類為有機鍺和無機鍺(GeO2)。已知在人類器官內累積較長時間的無機鍺導致強的毒性。有機鍺天然地包含在微生物、礦物質水和醫用草藥中。而且，可以通過在真菌體內生物合成或者化學合成生產有機鍺。有機鍺與細胞中的蛋白質、肽等結合，并且通過許多論文和科學期刊(Kor. J.Microbiol. Biotechnol. ,2007. 35(2) :118-127 J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 2006. 35 (6) :683-689 ;J. Kor. Soc. App 1. Biol. Chem. 2005. 48 (3) 246-251 ；Immune Network. 2006. 6 (2) =86-92)建立了有機鍺用于增強免疫力、抑制腫瘤細胞的產生和擴散(轉移)、治療和預防各種慢性疾病等的療效。此外，眾所周知有機鍺具有以下功能通過向細胞提供氧的抗癌活性(J. Orthomol. Medicin. , 1986. 1 :145-148)； 純化血液(Medicin. Hy-phothesis. , 1988. 26 :207-215)；通過活化NK細胞和巨噬細胞 ±曾強免疫力(Microbiol. Immunol.，1985. 29 :65-74 ；Kor. J. Microbiol. Biotechnol.， 2007. 35(2) :118-127)；誘導干擾素生成(Gantokagakutyoho，9 :1976-1980)、抑制癌細胞產生和擴散(Cancer and Chemotheraphy. 1985. 12(12) :2345-2351)；抑制關節炎 (Autonomic&Autacoid Pharmacol. 2005. 25 :129-134)；預防和治療各種疾病，例如神經痛 (Biotechnol. Appl. Biochem. , 1986. 8 :379-386)、骨質疏松癥(Germanium ；The health and life enhancer. 1988)；降低高的血壓(高血壓)和高脂血癥膽固醇(Pharmacol.，1990. 41 286-291)；緩解肝毒素(J. Kor. Soc. Food. Nutr. , 1994. 23 (4) :581-586)等。由于所述的眾所周知的療效，在美國、日本、歐洲和韓國，在幾十年中，對有機鍺已經廣泛地進行了許多研究，所述的研究試圖將其用于治療各種頑固性疾病，例如癌癥和心臟病等(Anticancer Res.，1985. 5(5) :479-483)。可以通過從藥用草藥，例如人參(ginseng)、靈芝(ganoderma)中提取得到有機鍺，但由于其高成本和低生產率此種方法很難商業化。此外，可以通過利用有機酸化學合成二氧化鍺(GeO2)獲得有機鍺，但從化學合成中得到的產品中包含無機鍺，因此由于未確認的安全性，在食物或藥物供給中的用途受到限制(US FDA的進口警戒，1988)。
事實上，酵母在烘焙業、糖果業和釀酒業中大量地使用了數千年。而且，酵母自身作為人類食物的來源是有用的，并且作為下一代蛋白質的來源作為單細胞蛋白(SCP)是有吸引力的，，所述的單細胞蛋白理想地由蛋白質、維生素、礦物質等組成，其特征在于高蛋白和低脂肪。此外，在單細胞中，酵母是維生素B的最好來源，并包含許多酶類等，這些酶主要服務于體內的代謝。在這方面，酵母用作保健產品。最近，對保健產品進行了大量的研究和開發，從而通過得到的酵母實現生理和藥用效果。為了實現所述目的，非常需要開發包含高含量有機生物鍺的酵母。在傳統方法中，通過在包含無機鍺(GeO2)的培養基中培養酵母來生產包含有機生物鍺的酵母。由于酵母在包含高含量無機鍺的培養基條件下生長受到限制這一缺點，因此在傳統方法中難以有成本效益并且大規模地生產包含適量有機生物鍺的酵母。為了彌補上述缺點，嘗試了將生產球團(pellet)形式的酵母的過程和將二氧化鍺(GeO2)接種到所得到的酵母中的過程獨立地進行的方法。然而，在以上方法中，由于在酵母培養過程中產生的乙醇和接種到酵母中的二氧化鍺0 )的含量極低，球團狀 (palletized)酵母的產率太低以致不能商業化。而且，已知的是在上述方法中使用的二氧化鍺(GeO2)在25°C下的溶解度為 5. 2g/L，該溶解度對于酵母生長是抑制劑(J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，1989. 4(4) 299-306)。因此，非常地需要發明出通過使用具有較高溶解度但毒性遠低于二氧化鍺(GeO2) 的無機鍺，來生產包含高含量有機鍺的乙醇抗性酵母的方法。發明公開內容技術問題本發明的目的是提供具有乙醇抗性的酵母GP-Ol (&iccharomyces cervisiae GP-OLKCTCl 1399BP)以增加酵母產率，和用于生產酵母GP-Ol的方法。本發明的另一個目的是提供用于生產酵母Ge_3^(的方法，所述的酵母含有高含量有機生物鍺，通過突變的釀酒酵母(乙醇抗性酵母GP-01)和偏鍺酸鈉(Na2GeO3)的生物合成獲得的。本發明的再一個目的是提供用于生產通過突變的釀酒酵母(酵母GP-01， KCTC-11399BP)的生物合成和偏鍺酸鈉(Na2GeO3)獲得的、包含高含量有機生物鍺的酵母 Ge-32K的方法。技術方案本發明涉及具有乙醇抗性并具有有機鍺生產能力的突變的釀酒酵母(酵母 GP-OLKCTC 11399BP)和用于生產包含高含量有機生物鍺的酵母Ge_3^(的方法，所述方法包括用偏鍺酸鈉(Na2GeO3)培養所述的酵母GP-Ol。有益效果根據本發明，通過釀酒酵母(KCTC-7904)和乙醇假絲酵母(KCTC7181)的原生質體融合可以生產多種的酵母GP-01。所得到的酵母GP-Ol具有乙醇抗性，這使得能夠在高乙醇條件下培養。本發明的乙醇抗性酵母GP-Ol可以克服現有技術中由于在酵母培養過程中產生乙醇而導致酵母生長產率降低的缺點。
此外，由于培養的酵母GP-Ol的生產率與最初酵母(KCTC-7904)的生產率相比，增加了超過3倍，因此可以通過利用本發明的酵母GP-Ol實現包含高含量有機生物鍺的酵母 Ge-32K的大規模生產。在將鍺接種到球團狀酵母GP-Ol的過程中，本發明使用溶解度為500g/L的偏鍺酸鈉(Na2GeO3)代替現有技術中通常使用的二氧化鍺(GeO2)，由于鍺的更高溶解度和離子可傳送性，同時鍺的毒性低于二氧化鍺從而增加了酵母中鍺的生物轉化速率。因此，獲得包含的有機生物鍺的含量比使用二氧化鍺(GeO2)的現有技術的含量高2或3倍的酵母Ge-3^( 對于本發明來說是可能的。同時，在用偏鍺酸鈉(Na2GeO3)培養酵母GP-01 (KCTC 11399BP)的過程中，為了使有機生物鍺更有效地通過生物轉化接種到球團狀酵母中，本發明添加了表面活性劑。附圖簡述

圖1是顯示根據pH的變化，本發明的酵母GP-Ol中生物鍺含量的圖形。圖2是顯示根據溫度的改變，本發明的酵母GP-Ol中生物鍺含量的圖形。圖3是顯示根據表面活性劑按計的濃度的變化，本發明的酵母GP-Ol中生物鍺含量的圖形。發明的方式本發明涉及突變的釀酒酵母，即具有生產有機鍺能力的酵母GP-01(KCTC 11399BP)。所述的突變的釀酒酵母，即酵母GP-Ol適當地保存在韓國生命科學與生物技術研 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)白勺禾中
保藏中心(Korea Collection for Type Culture)，保藏編號為 KCTC 11399BP。更具體地說，本發明提供了具有乙醇抗性的突變釀酒酵母GP-Ol (酵母GP-01， KCTC 11399BP)，其中所述方法包括將釀酒酵母(KCTC7904)與有效利用乙醇的乙醇假絲酵母(KCTC 7904)的原生質體融合。此外，本發明提供了包含高含量有機生物鍺的酵母Ge-3I，所述酵母可以通過將酵母GP-01與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液培養，從而通過生物轉化將鍺接種到酵母中進行制備。所述的突變酵母可以通過釀酒酵母(KCTC7904)和乙醇假絲酵母(KCTC7181)的原生質體融合獲得，所述的原生質體融合使用混合了 IM山梨醇作為滲透壓穩定劑，0. 5M的 2-巰基乙醇作為還原劑的溶液。而且，原生質體可以通過將球團狀的酵母懸浮在添加細胞壁水解酶使細胞壁分解的山梨醇溶液中獲得。在這種情況下，IM山梨醇與2-巰基乙醇優選的體積比為1 2-4， 更優選地為1 2-3。同時，所述的原生質體融合通過將釀酒酵母(KCTC7904)和乙醇假絲酵母 (KCTC7181)的兩種原生質體加入到混合溶液中實現，該混合溶液由分子量為4000的聚乙二醇、IOmM氯化鈣(CaCl2)和選自IM山梨醇、蔗糖和甘露醇的溶液之一組成。在這種情況下，選擇的一種溶液(1M山梨醇)、聚乙二醇和氯化鈣(CaCl2)的優選體積比為1 2-4 2-5，更優選地為1 2-3 2-4。本發明提供了用于生產包含高含量有機生物鍺的酵母Ge-3I的方法。該方法包括將酵母GP-Ol與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)培養。酵母GP-Ol (KCTC 11399BP)與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)的優選體積比為1 0.5-2，更優選地為1:1。此外，為了通過生物轉化將鍺接種到酵母中，優選地在pH 9-10和30_40°C溫度下將酵母GP-Ol與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)培養。以上培養步驟可以通過培養酵母的普通方法實現。通過本發明所述方法，可以獲得包含相對高含量的有機生物鍺的酵母Ge-3I。在下文中，提供了用于生產乙醇抗性酵母GP-Ol和用于生產包含高含量有機生物鍺的酵母Ge_3^(的本發明的更加詳細的方法。第一個過程生產乙醇抗性的原生質體融合酵母通過融合和培養釀酒酵母(KCTC7904)和乙醇假絲酵母(KCTC7181)的兩種原生質體獲得原生質體融合的酵母，其中釀酒酵母和乙醇假絲酵母保藏在韓國生命科學與生物技術研究院的韓國典型菌種保藏中心(KCTC)。更詳細地說，分別培養釀酒酵母(KCTC7904)和乙醇假絲酵母(KCTC7181)。離心所得到的培養基以獲得球團狀的酵母。優選的是，在對數生長早期當培養基的光密度值(0. D.)為0. 45-0. 50時進行培養基的離心。可以從菌株的每個培養基或者兩個菌株一起培養的一個培養基中獲得球團狀酵母。以1 1的比例將兩種球團狀酵母加入到混合了 IM山梨醇和0. 5M 2_巰基乙醇的溶液中以清洗酵母兩次。將經清洗的酵母靜置預定的時間，然后將包含細胞壁水解酶的溶液以1 1的比例加入到肉湯(包含球團狀的酵母、IM山梨醇和0.5M 2-巰基乙醇)中。 使酵母懸浮在肉湯中以生成原生質體。將IM山梨醇、聚乙二醇(分子量4000)和IOmM的氯化鈣(CaCl2)加入到肉湯中， 以便原生質體融合。最后，離心肉湯以得到原生質體融合的酵母。將所述的原生質體融合的酵母在瓊脂培養基中培養6-8天，并對其染色以檢查是否要鑒定原生質體融合的酵母。之后，收集原生質體融合的酵母，所述的酵母通過染色確認。優選地，使用的瓊脂培養基由3-5wt%的酵母提取物、7-9%的蛋白胨、7-9wt%的葡萄糖、0. 1-0. 6wt%的氯化鈣、72-75wt%的山梨醇和5_8wt %的瓊脂組成，但不限于上述組成。也可以應用本領域中通常使用的瓊脂。第二個過程生產對高濃度鍺具有高適應性的乙醇抗性酵母(酵母GP-01，(KCTC 11399BP))，和配制偏鍺酸鈉溶液(Na2GeO3)。在包含偏鍺酸鈉(Na2GeO3)的培養基中培養在第一個過程中得到的原生質體融合的酵母以增強酵母對高濃度鍺的適應性。 為了生產酵母GP-Ol (KCTC 11399BP)，由于對鍺的適應性，使用偏鍺酸鈉 (Na2GeO3)。將從第一個過程中得到的原生質體融合的酵母在液體培養基中培養10-13小時，從而使鍺的濃度達到3，000-20, OOOppm0 優選地，液體培養基由6_10襯％的乙醇、0. 1-0. 5wt%的蛋白胨、0. 1-0. 的酵母提取物、2-5wt%的葡萄糖、0. 1-0. 的麥芽提取物和84-90Wt%的水組成，但不限于
6上述組成。優選地，在液體培養基中乙醇的最佳濃度為8-10wt%，偏鍺酸鈉(Na2GeO3)中鍺的含量為 3，000-10，OOOppm0在乙醇的濃度低于6wt%或者超過10wt%的情況下，其可以導致難以獲得酵母的最佳量或者難以有效地收集乙醇抗性酵母。而且，在偏鍺酸鈉(Na2GeO3)中鍺的含量小于 3，OOOppm的情況下，難以有效地收集包含高含量鍺的酵母并且在偏鍺酸鈉(Na2GeO3)中鍺的含量超過20，OOOppm的情況下，也很難得到有成本效益的產率。在液體培養基中，收集了生長活躍并且在培養物的上清液中具有較低含量鍺的酵母。在平板培養基中繼代培養收集到的酵母以分離并獲得突變的釀酒酵母，即酵母 GP-OKKCTC 11399BP)。由于所獲得的酵母GP-Ol對乙醇具有高度抗性，因此酵母的產率增加是可能的。優選地，以上使用的平板培養基由3-5wt%的瓊脂、10-12wt%的酵母提取物、 20-23wt%的蛋白胨、20-23wt%的葡萄糖和39_42wt%的乙醇組成，但不限于以上組成其中在平板凝固之前加入乙醇。在酵母的繼代培養之后，在室溫下對制備的平板進行雙重密封以防止乙醇揮發。通過向碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸鈣(CaCO3)、碳酸鉀(K2CO3)或者碳酸氫鉀(KHCO3) 之一中加入相等比例的二氧化鍺并進行滅菌來合成本發明中用作無機鍺的偏鍺酸鈉 (Na2GeO3)。所得到的偏鍺酸鈉(Na2GeO3)為高溶解度的鍺溶液并且應在生物轉化過程中的使用之前立即配制。在本發明的第二個過程中，為了使酵母發生突變，可以在將酵母在包含偏鍺酸鈉 (Na2GeO3)的培養基中培養之前，額外地將該原生質體融合的酵母在2. 0_2. 5KGy(D1(l值)的 Y射線(Co6°)下輻射，持續2-4小時。如果Y射線(CcT)輻射小于2. OKGy，則由于在平板上形成了突變菌株的太多菌落，因此很難獲得需要的突變酵母。并且，如果Y射線(Co6°)輻射大于2.5KGy，則由于酵母的消失率極高，也很難獲得需要的突變酵母。通過如上所述的Y射線(Co6°)輻射的突變酵母，在YM肉湯中培養1小時并穩定之后，可以用于繼代培養。第三個過程無機鍺離子流入酵母GP-Ol中為了生產包含高含量有機生物鍺的酵母，將第二個過程中所獲得的酵母GP-Ol與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液進行培養。為了生產包含高含量的有機生物鍺的酵母(酵母Ge-3I)，將第二個過程中制備的培養基離心，從而僅收集酵母。并且，通過將收集到的酵母加入到鍺的含量為 3，000-10，OOOppm的包含偏鍺酸鈉(Na2GeO3)的溶液中制備包含鍺的培養基。加入的酵母與偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液的體積比為1 0.5-2.0。在加入0. 01-0. 04%的表面活性劑之后，將所獲得的包含鍺的培養基在pH 9-10 和30-40°C下培養19-21小時。從而生產本發明的包含高含量的有機生物鍺的酵母(酵母 Ge-32K)。加入的表面活性劑可以通過增加的細胞膜通透性，引起細胞中鍺的含量增加。因此，對于將無機鍺接種到突變酵母，即酵母GP-Ol (KCTC11399BP)中是可能的。
優選地，本發明中使用的表面活性劑為Twin-80，但不限于此。如果酵母與偏鍺酸鈉(Na2(^eO3)溶液的混合比例小于1 0. 5或者大于1 2，由于包含酵母的懸浮液的高粘度和鍺與酵母細胞壁之間的較低的擴散速度，可以引起酵母中生物鍺的含量降低。而且，如果pH小于9或者大于10，或者溫度低于30°C或高于40°C，可以引起酵母中生物鍺的含量降低。此外，如果加入到包含鍺的培養基中的表面活性劑的量低于0. lwt%，則細胞壁的通透性差。而且，如果加入到培養基中的表面活性劑的量超過0.#t%，則由于酵母細胞壁的結構遭到破壞，因此膜的通透性受到抑制。因此，所述的情況可以導致酵母與未加入表面活性劑的情況具有相同的有機鍺含量。在通過利用突變的釀酒酵母，即酵母GP-Ol生產包含高含量的有機生物鍺的酵母，即酵母Ge-3I之后，剩余的包含鍺的培養基可以通過采用0. 2 μ m的膜過濾器進行過濾而再利用。為了幫助你理解本發明，以下將更加詳細地描述本發明的示例性實施方案。然而， 以下的實施例用于解釋說明的目的，并且本領域的技術人員能夠理解，在不脫離本發明的范圍和精神的情況下有可能進行各種修改、添加和/或替換，本發明的范圍和精神由所附權利要求書和它們的等同替代形式限定。制備實施例1 偏鍺酸鈉(Na2GeOJ溶液的配制通過將碳酸鈉(Na2CO3, Kanto, Japan)溶解在水中，以與所述碳酸鈉的相同比例 (1 1)加入二氧化鍺(GeO2, PPM GmbH, Germany)來配制偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液，并對所得到的溶液進行滅菌。按照前文配制的偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液的溶解度非常高，為500g/L(25°C )。^^77 ι 牛 JiH本融合的酵母的牛產，Pi JkΜ m . ic Φ. jir^i^ a^i 母的乙醇抗件酵母的牛產。在30°C下，將韓國典型菌種保藏中心提供的釀酒酵母(KCTC7904)和乙醇假絲酵母(KCTC7181)在含有YPD培養基的錐形燒瓶(Erlenmeyer flask)中培養10小時。在酵母的UV分光光度計為0. 5的對數早期，離心制備的培養基以收集酵母。用滅菌生理鹽水清洗收集的酵母兩次。在30°C下，將經過清洗的酵母懸浮在IM山梨醇和0. 5M巰基乙醇以1 2的體積比混合的溶液中30分鐘。之后，通過離心，清洗包含酵母的溶液。然后，將200個單位的細胞壁降解酶，酵母裂解酶(L4025，sigma，USA)以1 1的比例加入到離心清洗的溶液(包含酵母、IM山梨醇和巰基乙醇)中。在30°C下，將所得到的溶液放置1小時以產生酵母的原生質體。將由IM山梨醇、聚乙二醇(麗4000)禾Π IOmL的氯化鈣(CaCl2)以1 3 2的體積比組成的溶液以相等的比例加入到上述包含原生質體融合的酵母中。在30°C下，將該混合的溶液融合30分鐘以生產本發明的原生質體融合的酵母。為了分離原生質體融合的酵母，在SOS固體培養基中培養原生質體融合的酵母1 周，所述的SOS固體培養基包含4. Iwt %的酵母提取物、8. 的蛋白胨、8. 的葡萄糖、0. 的氯化鈉、73. 2wt%的山梨醇和6. 的瓊脂。在培養1周之后，通過采用苯酚品紅(carbol fuchin)對其染色分離酵母。在添加30wt%的含有10，OOOppm鍺的偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液之后，在YM液體培養基中培養分離的酵母10小時，所述的YM培養基包含10wt%的乙醇、0. 的蛋白胨、 0. 2wt%的酵母提取物、#t%的葡萄糖、0. 2wt%的麥芽提取物和85. 2wt%的水。在液體培養基中，從培養物的上清液中收集生長活躍并且鍺的含量較低的酵母。 在包含4. lwt%的瓊脂(Difco)Ul. lwt%酵母提取物(Genico, Korea),22. 的蛋白胨 (Difco),22. 0襯％的葡萄糖(Daesang，Korea)和40. 8wt%的乙醇的平板培養基中繼代培養收集的酵母從而分離并獲得突變的釀酒酵母，即酵母GP-Ol (KCTC 11399BP)。為了研究所得到的酵母GP-Ol的乙醇抗性，按照各濃度加入生長抑制劑乙醇，并檢查了酵母的生長狀態。下文的表1通過乙醇濃度顯示了酵母的生長狀態，為了準確性，對濃度的每個值檢查三次。表 1
乙醇濃度(％, ν/ν)KCTC 7904酵母GP-Ol的生長狀態(第一次觀察)GP-Ol (第二 次)GP-Ol (第二 次)OD(660nm, 1/20)OD(660nm, 1/20)OD(660nm, 1/20)OD(660nm, 1/20)00.100.100.130.126.00.070.150.140.208.00.060.140.200.2310.00.050.160.190.2415.0-0.120.080.15當培養微生物時產生乙醇，但乙醇抑制它們的生長。如以上表1所示，與缺乏乙醇的情況相比，在乙醇存在的情況下釀酒酵母，酵母 GP-OKKCTC 1139BP)的生長速率增加。在乙醇濃度為6-10%的情況下，獲得酵母GP-Ol的
最好生長率。根據本發明，在這種情況下，可以獲得在乙醇存在下其生長率增加的乙醇抗性酵母，即酵母 GP-Ol (KCTC 11399BP)。此外，通過將本發明的酵母GP-Ol的產率與最初的酵母(釀酒酵母，KCTC 7904)的產率進行比較，本發明的酵母GP-Ol (KCTC-11399BP)的產率增加了超過3倍。實施方案2 通過偏鍺酸鈉(Na2GeOJ溶液的濃度改變酵母GP-Ol中鍺的含量將包含突變的釀酒酵母，酵母GP-Ol (KCTC 11399BP)的肉湯培養基進行離心以收集球團狀酵母。將收集到的球團狀酵母以1 1的體積比加入到偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液中。由于制備了就包含的鍺濃度而言的多種偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液，配制了在其中加入球
9團狀酵母的多種溶液。將配制的溶液在PH 10和40°C下培養20小時。為了確定酵母GP-Ol中生物鍺的含量，將Ig經過培養和干燥的酵母GP-Ol加入到 30ml的硝酸中。加熱所得到的樣品以使其分解。在將PH值調節至6之后，將Iml樣品與 Iml苯基熒光酮和Iml環狀核酸混合。所得到的樣品在30°C下靜置30小時，然后利用UV 分光光度計在525nm處測定酵母GP-Ol中鍺的含量。同時，作為對照，進行了與實施方案2中描述的相同的過程，除了采用二氧化鍺 (GeO2)溶液代替偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液之外。下表2顯示了根據偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液與二氧化鍺(GeO2)溶液中鍺的含量， 接種到酵母GP-Ol和最初的釀酒酵母(KCTC 7904)的生物鍺的含量的比較。表 權利要求
1.具有生產有機生物鍺能力的酵母GP-Ol(突變的釀酒酵母，KCTCl 1399BP)。
2.一種用于生產具有乙醇抗性的酵母GP-Ol的方法，所述方法包括將釀酒酵母 (Saccharom cervisiae) (KCTC 7904)和乙醇假絲酵母(Candida ethanolica) (KCTC 7181) 進行原生質體融合的步驟。
3.根據權利要求2所述的方法，所述方法還包括加入由球團狀的釀酒酵母(KCTC 7904)和乙醇假絲酵母(KCTC 7181) UM的山梨醇和0. 5M的2-巰基乙醇的所得到的原生質體的步驟。
4.根據權利要求2所述的方法，其中，所述原生質體融合通過采用IM的山梨醇和聚乙二醇(分子量4000)融合原生質體進行。
5.一種用于包含高含量有機生物鍺的酵母Ge-3I的方法，所述方法包括在使用之前將酵母GP-Ol加入到偏鍺酸鈉(Na2GeO3)溶液中的步驟。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述偏鍺酸鈉(Na2GeO3)通過以下方法制備將選自碳酸鈉(Nei2CO3)、cardium carbonate (CaCO3)和碳酸氫鉀(KHCO3)其中之一溶解在水中并將二氧化鍺(GeO2)以相等的體積比加入到以上所制備的溶液中。
7.根據權利要求5所述的方法，其中，酵母GP-01(KCTC11399BP)與偏鍺酸鈉 (Na2GeO3)溶液的混合比例為1 0. 5-2. 0 (按體積)。
8.根據權利要求6所述的方法，所述方法還包括將包含酵母GP-Ol(KCTC 11399BP)和偏鍺酸鈉(Na2GeO3)的肉湯在pH 9_10和30_40°C溫度下培養19-21小時。
9.一種根據權利要求5-8中任一項所述生產的包含高含量有機生物鍺的酵母(酵母 Ge-32K)。
全文摘要
本發明涉及一種通過使用乙醇抗性酵母和偏鍺酸鈉(Na2GeO3)，通過原生質體融合，生產包含高含量有機生物鍺的酵母的方法。為了增強對抑制酵母生長的乙醇的抗性，本發明提供了用于生產突變的釀酒酵母(ye，d&tGP-01，KCTC 11399BP)的方法，該酵母GP-01具有乙醇抗性并通過將釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)(KCTC7904)和乙醇假絲酵母(Candidaethanolica)(KCTC7181)的原生質體融合得到。此外，本發明提供了包含高含量有機生物鍺的酵母(酵母Ge-32K)和用于生產酵母Ge-32K的方法，該方法包括以下步驟將酵母GP-01以1∶0.5-2的體積比加入到偏鍺酸鈉(Na2GeO3)中；加入0.1-0.4wt％的表面活性劑，代替現有技術中使用的二氧化鍺；和培養所得到的肉湯。與通過利用二氧化鍺生產的常規酵母相比，獲得的酵母Ge-32K包含較高含量的生物有機鍺。
文檔編號C12N1/16GK102239246SQ200880132218
公開日2011年11月9日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月4日
發明者孫昌旭 申請人:得瑞制藥有限公司