專利名稱：Hla分型法的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于醫療診斷的HLA分型技術。
背景技術：
HLA(human leukocyte antigen；人白血球抗原)是人的MHC(majorhistocompatibility complex；主要組織相容性復合體)，存在于整個細胞表面。HLA分子，個體間類型不同，能夠與其結合的抗原肽的差異表現為免疫應答的個體差異。因此，確定存在于編碼HLA分子的HLA區域的基因的類型(HLA分型技術)可用于判定器官移植時供體和受體者的相容性以及個體對某種疾病的的素質等，是非常重要的技術。
HLA分型中存在著血清學分型和DNA分型。以往，作為HLA分型一直進行血清學分型。在血清學HLA分型中，通過HLA單克隆抗體與淋巴細胞的抗原抗體反應對HLA進行鑒定。然而這種方法存在著解析精度低，以及可判定的HLA類型有限的缺點。
而DNA分型是對編碼HLA的第6號染色體上的基因直接進行分型(RFLP法等)的技術。例如如果根據特表2002-503497號公報報道，為了進行DNA分型，事先從生物體材料分離、純化DNA，以該DNA為模板，使用基因位點特異的引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)等，做成測序反應模板。
在以往的方法中存在著生物體樣品保管時的保存性問題以及生物體樣品運輸時簡便性問題。尤其是當生物體樣品是血液材料時，由于存在著病原微生物等感染的可能性，存在著對在檢查等對血液樣品進行處理時的人的危險，安全性上也有問題。另外，血液樣品等液體樣品存在著樣品間交叉感染等、樣品自身污染可能性的問題。另外，從生物體樣品分離、純化DNA時，也存在著花費人力和經費的問題。近年來，DNA的分離、純化由于利用各種各樣的試劑盒而被簡化，即使那樣也需要多階段的操作。因此，在進行多個檢體解析時，不僅存在著樣品的安全性低下，而且也存在著解析時花費增加的問題。

發明內容
本發明的目的在于提供樣品的保存以及運輸簡便而且安全性高、解析花費少、解析精度以及處理效率高的HLA分型技術。
本發明人等進行了努力研究，結果發現通過從生物樣品直接進行DNA擴增反應，確定擴增的DNA的堿基序列，利用確定的堿基序列的信息進行HLA分型，可以達到上述目的，直至完成本發明。
本發明包括以下內容。
(1)一種HLA分型法，從生物樣品直接進行DNA擴增反應，確定上述血液樣品中含有的DNA的堿基序列，利用確定的所述堿基序列確定HLA分型。
(2)根據(1)所述的HLA分型法，上述DNA擴增反應是聚合酶鏈反應。
(3)根據(1)或(2)所述的HLA分型法，上述生物體樣品是血液樣品或口腔粘膜樣品。
(4)根據(3)所述的HLA分型法，上述血液樣品是全血。
(5)根據(3)或(4)所述的HLA分型法，上述血液樣品是干燥血液。
(6)根據(3)～(5)中任一項所述的HLA分型法，上述血液樣品是使濾紙含有血液后干燥的濾紙血。
根據本發明可提供樣品的保存以及運輸簡便而且安全性高、解析花費少、解析精度以及處理效率高的HLA分型技術。另外，根據本發明通過在直接PCR中選擇適當的緩沖液，可以進行全基因位點的HLA分型。


圖1是表示從濾紙血直接進行PCR的結果的電泳圖。
圖2是表示從口腔粘膜直接進行PCR的結果的電泳圖。
具體實施例方式
本發明是以從生物體樣品直接進行DNA擴增反應為特征的HLA分型法。在本發明中所謂直接指的是在進行DNA擴增之前不需要對樣品中含有的DNA進行分離、純化的過程。在本發明的HLA分型法中從生物樣品直接進行DNA擴增反應，由擴增的DNA堿基序列確定上述血液樣品中含有的DNA的堿基序列，利用確定的堿基序列決定HLA的類型。而HLA分型通常進行有關A、B、DR的各個基因位點的確定。
本發明中，作為用于進行HLA分型的生物體樣品沒有特別限定。例如血液樣品或口腔粘膜樣品等，由于樣品採集簡便，所以是優選的。
作為血液樣品，可以使用全血。也可以使用進行了DNA純化的樣品或用EDTA等處理的樣品。作為樣品的形態，只要有DNA殘存，無論是新鮮血、還是保存血以及干燥血都可以。作為保存血液無論冷藏保存、還是冷凍保存都可以。在本發明中，即使是頻繁反復凍融的冷凍血液也可以穩定地得到核酸擴增產物。作為干燥血液，可以使用使濾紙含有血液后干燥的濾紙血。在本發明中使用濾紙血從樣品的保存性和運輸時的簡便性以及安全性的觀點看，是優選的。通過使濾紙含有血液樣品，由于樣品不是液體狀態，因此使樣品灑掉、或飛散的危險性減小。因此，樣品的安全性高，污染的可能性減小。
在本發明中對存在于上述血液樣品中的DNA不進行分離和純化而直接進行DNA擴增反應。在本發明中，通過在擴增反應中的反應溶液中使用下面敘述的溶液，不進行樣品的前處理可以直接進行DNA擴增反應。這樣一來可以節省前處理的人力和花費。例如，當使用濾紙血時，使濾紙含有少量的血液后，進行干燥，可以取出粘著血液部分的一部分直接用于擴增反應。
在DNA擴增中，可以利用PCR。PCR中使用PCR反應溶液含有緩沖液、引物試劑盒、各種dNTP(脫氧核苷三磷酸)、以及DNA聚合酶。
在不進行分離、純化等前處理的樣品中含有阻礙DNA擴增反應的物質。所謂阻礙DNA擴增反應的物質是存在于生物體液中的正電荷物質(某種蛋白質等)或負電荷物質(某種糖、色素等)等。蛋白質等正電荷物質通過吸附于DNA而阻礙擴增反應。另外，糖、色素等負電荷物質通過吸附于DNA聚合酶而阻礙擴增反應。在本發明中，使用具有抑制阻礙DNA擴增反應物質的作用的溶液作為緩沖液。
作為這樣的緩沖液，如可以舉出AmpdirectR-A、AmpdirectR-G/C(都是(株)島津制作所制造)。另外根據需要，為了提高擴增效率，也可以將在AmpdirectR-A或AmpdirectR-G/C中加入了Amp Addition-1或AmpAddition-4(都是(株)島津制作所制造)的溶液用作緩沖液。在本發明中優選使用AmpdirectR-G/C。另外，更有優選在AmpdirectR-G/C中加入了Amp Addition-4后使用。AmpdirectR-A或AmpdirectR-G/C由于對存在于上述DNA擴增反應溶液中的上述阻礙物質具有中和的作用，所以即使是未純化的樣品也可以進行PCR。這樣一來，就可以從生物體樣品直接進行核酸擴增。此外，作為具有上述作用的緩沖液，如可以舉出AmpdirectR-B、AmpdirectR-D，作為根據需要使緩沖液中含有的AmpAddition，如可以舉出Amp Addition-2、Amp Addition-3。
在本發明中，并不限定于上述緩沖液，可以根據分型的基因位點適當選擇具有合適組成的緩沖液。
作為引物，使用對HLA區域特異的擴增引物試劑盒。作為DNA聚合酶優選TaqDNA，更優選TaKaRaZ-TaqTM、ExTaq(都是寶酒造(株)制造)。
本發明的PCR反應溶液的上述成分可以使用例如下面那樣的配比量(以PCR反應溶液的總體積為基準)。即，緩沖液10～40體積％，例如20體積％，各個引物為0.1～2μM，例如0.5μM，各個dNTP為100～300μM，例如200μM，DNA聚合酶為0.5～1.25U/μl，例如1.25U/μl。另外，使用在AmpdirectR-A和AmpdirectR-G/C等中加入了Amp Addition后的溶液作為緩沖液時，Amp Addition的量的上限沒有特別限定，例如相對于AmpdirectR-A和AmpdirectR-G/C等的量可以加到150體積％程度，例如可以使用100體積％。例如作為樣品的血液可以用0.5μl～2μl，對于1μl血液樣品可以使用10～200μl的上述PCR反應溶液，優選使用20～100μl。這些條件本技術領域的普通技術人員可適當選擇。另外有關PCR反應的條件本技術領域的普通技術人員也可適當確定。
被擴增的DNA優選進行純化。在純化中可以使用例如核酸外切酶和堿性磷酸酶。這些酶由于具有使未反應的引物核苷酸失活的作用，因此擴增的DNA可被純化。
純化的DNA可確定其堿基序列。就是說，本發明作為DNA分型法可以通過確定HLA區域的堿基序列進行與以往的血清學相比更高精度的分型。
堿基序列的確定可以使用Sanger法、Maxam-Gilbert法等方法。例如在Sanger法中，通過按照通常的操作進行反應，可以得到鏈長不同的部分復制DNA的混合物。得到的部分復制DNA的序列可以通過使用電泳法的毛細管型或平板(平板凝膠)型DNA測序儀進行解析。在本發明中優選使用毛細管型DNA測序儀(RISA-384)((株)島津制作所制造)、ABI-3730×1(Applyed Biosystems公司制造)。測序數據可以通過計算機程序進行解析，對來自異接合體的二重峰進行自動檢測，確定共有序列。已確定的堿基序列通過從HLA型數據庫進行檢索，自動進行HLA型的判定。
就象以上敘述的那樣，利用本發明由于不僅可以保持DNA分型的高解析精度，而且與以往相比可以大幅度削減DNA解析的人力和花費，所以可以更有效地處理更多的樣品。
實施例以下通過實施例對本發明進行更詳細地說明，但本發明并不限定于這些實施例。
通過將針刺入指尖從40個被檢驗者分別採集少量血液(大約1μl)，然后使採集的血液吸附于濾紙上。用打孔器沖下濾紙中吸附血液部分的一部分(直徑2mm)，插入到96孔PCR板中。將下述所示的PCR反應溶液20μl加入到板中各個血液濾紙上，將防止蒸發的片材貼在板上。
(PCR反應溶液(20μl中))引物
TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC(序列表中的序列號1) 0.5μMTGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC(序列表中的序列號2) 0.5μMAmpdirectR-G/C((株)島津制作所制造) 4μldATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μMExTaq(寶酒造(株)制造) 0.5UPCR反應使用thermal cycler(Applied Biosystems公司制造)，在進行96℃下的3分鐘預熱后，于96℃-30秒鐘、63℃-1分鐘、72℃-3分鐘的條件下進行40循環。最后進行72℃-5分鐘的聚合。
回收各個反應溶液10μl，通過添加核酸外切酶和堿性磷酸酶的混合物(Amersham公司生產，ExoSAP-IT)1μl，進行純化。
使用下述所示的測序反應液5μl，用下述的4種引物分別對上述純化得到的PCR產物進行測序。
(測序反應液(5μl中))上述純化得到的PCR產物 0.25μl引物 1μMBigDye Terminator Ver3.1(Applied Biosystems公司制造)1μl(引物)1.CACTCCATGAGGTATTTC(序列表中的序列號3)2.TCTGGTTGTAGTAGC(序列表中的序列號4)3.GGCCAGGGTCTCACA(序列表中的序列號5)4.CAATTGTCTCCCCTC(序列表中的序列號6)對上述測序反應中得到的部分復制DNA用乙醇沉淀法進行純化，使溶解于水，通過毛細管DNA測序儀(RISA-384)((株)島津制作所制造)對部分復制DNA的序列數據進行解析。對來自異接合體的二重峰進行檢測，確定共有序列，已確定的共有序列數據從http//square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.html公開的HLA型數據中進行檢索，列舉出進行了定位的類型。
對利用上述分型方法得到的HLA類型與通過血清學分型方法得到的HLA類型進行比較，40個樣品都一致。
另外由濾紙血能否直接進行PCR，可以通過將得到的擴增產物的一部分進行電泳來確認。圖1給出了電泳圖。圖1中帶1是將實施例1進行PCR使用的4μl緩沖液AmpdirectR-G/C換成2μl添加了ExTaq(寶酒造(株)制造)的PCR緩沖液的結果。帶2是實施例1進行PCR的結果。帶3是將實施例1進行PCR使用的緩沖液AmpdirectR-G/C 4μl換成8μl AmpdirectR-G/CAmpAddition-4＝1∶1(體積比)混合液的結果。就象圖1所表示的那樣，雖然用以往類型的PCR緩沖液不能確認DNA的擴增(帶1)，如果使用AmpdirectR-G/C或AmpdirectR-G/C與AmpAddition-4的混合物作為緩沖液可以明確確認DNA的擴增(帶2和帶3)。
5個被檢驗者口中含少量水，輕輕漱漱口。然后用市售的牙刷刷牙，每一邊10次(兩邊共20次)，然后將牙刷放入到加入了10ml的1重量％NaCl水溶液的離心管中，振蕩幾次，使採集的口腔粘膜懸浮于1重量％NaCl水溶液中，做成樣品懸浮液。
向加入了下面給出的PCR反應溶液45μl的試管中加入上述樣品懸浮液5μl。
(PCR反應溶液(50μl中))引物正向引物ACCCACCCGGACTCAGAATCTCCT(序列表中的序列號7)0.5μm反向引物(用以下2種引物的混合引物。)GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT(序列表中的序列號8) 0.25μMGGAGGCCATCCCCGGCGATCTAT(序列表中的序列號9) 0.25μMAmpdirectR-G/C((株)島津制作所制造)10μlAmpAddition-4 10μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μMZ-Taq(寶酒造(株)制造) 1.25UPCR反應使用thermal cycler(Applied Biosystems公司制造，GeneAmp9700)，在進行80℃-15分鐘預處理，接著進行96-3分鐘的預熱后，于96℃-30秒鐘、63℃-1分鐘、72℃-3分鐘的條件下進行40循環。最后進行72℃-5分鐘的聚合。
回收各個反應溶液10μl，通過添加核酸外切酶和堿性磷酸酶的混合物(Amersham公司生產，ExoSAp-IT)1μl，進行純化。
使用下述所示的測序反應液5μl，用下述的4種引物分別對上述純化得到的PCR產物進行測序。
(測序反應液(5μl中))上述純化得到的PCR產物 0.25μl引物 1μMBigDye Terminator Ver3.1(Applied Biosystems公司生產) 1μl(引物)1.CACTCCATGAGGTATTTC(序列表中的序列號3)2.TCTGGTTGTAGTAGC(序列表中的序列號4)3.GGCCAGGGTCTCACA(序列表中的序列號5)4.下述2種引物的混合引物CCCCGGCGACCTAT(序列表中的序列號10)GGAAGGCTCCCCACT(序列表中的序列號11)對上述測序反應中得到的部分復制DNA用乙醇沉淀法進行純化，使溶解于水，通過毛細管DNA測序儀(RISA-384)((株)島津制作所制造)對部分復制DNA的序列數據進行解析。對來自異接合體的二重峰進行檢測，確定共有序列，已確定的共有序列從http//square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.html公開的HLA型數據中進行檢索，列舉出進行了定位的類型。
對利用上述分型方法得到的HLA類型與通過血清學分型方法得到的HLA類型進行比較，5個樣品都一致。
另外由口腔粘膜能否直接進行PCR，可以通過將得到的擴增產物的一部分進行電泳來確認。圖2給出了電泳圖。圖2中帶1是將實施例2進行PCR使用的4μl緩沖液AmpdirectR-G/C換成2μl添加了ExTaq(寶酒造(株)制造)的PCR緩沖液的結果。帶3是實施例2進行PCR的結果。。就象圖2所表示的那樣，雖然用以往類型的PCR緩沖液不能確認DNA的擴增(帶1)，如果使用AmpdirectR-G/C和AmpAddition-4的混合物作為緩沖液可以明確確認DNA的擴增(帶3)。
在上述實施例中，雖然給出了本發明范圍內的具體的兩個形式，但本發明并不限定于這些實施例，可以以各種各樣的形式實施。因此，上述實施例只不過是整個內容的簡單的例子，不能解釋為限定的意思。另外，屬于等同本發明要求保護范圍的變更都在本發明的范圍內。
序列表<110>株式會社島津制作所<120>HLA分型法<130>G16-02-CN<150>JP2003-57287<151>2003-03-04<160>11<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1ttctccccag acgccgagga tggcc<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2tgttggtccc aattgtctcc cctc<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3cactccatga ggtatttc
<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4tctggttgta gtagc<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5ggccagggtc tcaca<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6caattgtctc ccctc<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7acccacccgg actcagaatc tcct<210>8
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ggaggccatc cccggcgacc tat<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ggaggccatc cccggcgatc tat<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10ccccggcgac ctat<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11ggaaggctcc ccact
權利要求
1.一種HLA分型法，從生物體樣品直接進行DNA擴增反應，確定上述生物體樣品中含有的DNA堿基序列，利用確定的堿基序列確定HLA的類型。
2.根據權利要求1所述的HLA分型法，上述DNA擴增反應是聚合酶鏈反應。
3.根據權利要求1所述的HLA分型法，上述生物體樣品是血液樣品或口腔粘膜樣品。
4.根據權利要求3所述的HLA分型法，上述血液樣品是全血。
5.根據權利要求3所述的HLA分型法，上述血液樣品是干燥血液。
6.根據權利要求3所述的HLA分型法，上述血液樣品是使濾紙含有血液后干燥的濾紙血。
全文摘要
一種HLA分型法，從生物體樣品直接進行DNA擴增反應，確定上述生物體樣品中含有的DNA堿基序列，利用確定的堿基序列確定HLA的類型。作為DNA擴增反應優選利用聚合酶鏈反應，作為生物樣品使用使濾紙含有血液后干燥的濾紙血。根據本發明的方法，可以提供樣品的保存以及運輸簡便而且安全性高、解析花費少、解析精度以及處理效率高的HLA分型技術。
文檔編號C12P19/34GK1526832SQ200410008210
公開日2004年9月8日 申請日期2004年3月1日 優先權日2003年3月4日
發明者四方正光, 稻垣知子, 子 申請人:株式會社島津制作所