專利名稱：一個與精神分裂癥密切相關聯的易感基因位點的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個與精神分裂癥有顯著關聯的易感基因位點。
背景技術：
精神分裂癥是最嚴重的精神疾病之一。在我國，精神分裂癥的終身患病率高達0.7％。這樣大的患病群體，不僅給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔，而且還嚴重威脅社會的安全與穩定。因此，確定精神分裂癥的病因，建立有效地防治方法，已成為醫學界乃至整個社會需迫切解決的問題。精神分裂癥與遺傳因素有密切關系，且歸類于多基因遺傳病。人類基因組系統掃描發現，除19號、21號和Y染色體外，其余染色體上都可能含有精神分裂癥易感基因。利用連鎖和關聯方法定位精神分裂癥的易感基因已成為分子遺傳學研究的熱點。Pulver等最早報道22q區域可能存在精神分裂癥易感基因(Pulver AE，et al.Am J MedGenet，1994，5436-43)。腭-心-面綜合征(velo-cardio-facial syndrome，VCFS)也使研究者們注意到第22號染色體與精神疾病的聯系(Pulver AE，et al.J Nerv MentDis，1994，182476-478)。但至今在該染色體區域內未發現確定特異的與精神分裂癥有關的易感基因。

發明內容
本發明的目的之一是在第22號染色體區域內揭示與精神分裂癥密切相關聯的易感基因位點；目的之二是通過該易感基因位點遺傳特性提出一種判定精神分裂癥的易感人群的方法，以利于指導精神分裂癥的預防和治療。
本研究結果表明UFD1L/CDC45L是精神分裂癥的易感基因位點。是含有三個單核苷酸多態性的序列長度為69987bp的UFD1L/CDC45L位點，由于該位點的單核苷酸多態性rs1547931堿基C突變為G，從而與精神分裂癥的易感性相關聯。UFD1L/CDC45L位點位于22q11.2染色體區域，編碼泛有素融合降解1型蛋白和細胞周期啟動蛋白。泛有素融合降解1型蛋白在胎兒期及產后期大量表達，原位雜交表明其在鼠腦內表達，并與能形成海馬的內側終腦有顯著親和性，泛有素融合降解1型蛋白通常在神經嵴細胞中表達，這些神經嵴細胞可形成心臟、支氣管弓、咽囊、腭面骨、胸腺和甲狀旁腺。細胞周期啟動蛋白在真核細胞中啟動DNA的復制。
本發明在22q11區通過連鎖不平衡分析方法進行單個核苷酸多態性(SNPs)連鎖不平衡制圖分析，通過NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)數據庫，獲得22q11內所有侯選基因，并獲得UFD1L/CDC45L位點序列。通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/數據庫，在UFD1L/CDC45L位點上選擇含有限制性酶切位點的單核苷酸多態性rs1547931、rs2238769和rs2073732。下列所示為這三個單核苷酸多態性的核苷酸序列。三個加黑部分分別為引物序列，三個方框內是發生互換的堿基，劃線處則分別是PstI和RsaI限制性內切酶識別的酶切位點，箭頭所示內切酶的切割部位。具體信息如下。
SNP1rs2238769，Gene bank accession numberAC000087，Base changeC/G8161 acttgagggt gaaagggtga ggctatctag gttcacctcg cttggtcaaa cagctttcca8221 gaaccagagc aactttgtga aaagcgcctt atgtggtgga tgctttcttt gctcccaaat 8341 tcttctctga cttccactgc agcagctgga ggagcagagc cagagccctc aggctgagaa8401 cacgaggcct ctgcaggcag ggcgggctcc ccatatggcc tctgcgtact ctggcacctgSNP2rs1547931，Gene bank accession numberAC000087，Base changeC/G15121 tgagagtagc atggaggtac agtaagggtg ggcactccct cctatcacca agggtgactc 15241 atggagctga catacagctg gtccacagta aactggactg ggctcagcca agggtctgag15301 attgttgcaa gtgaaagaga ctccaatgtc cctcagtcca ctgactctca aactgcattt15361 tgtgacttag aggctcccag tgccctgggg ctcccagtcc ctctgtaccc cctcactttcSNP3rs2073732，Gene bank accession numberAC000088，Base changeC/T21061 catgtcttgt gtgtcagcag cttttttggg agggcgtttg agaaggcagc ggaaagcacc21121 agctcccgga tgctgcacaa ccattttgac ctctcaggtg agagtctcct gccactctgc 21241 tggctggagg agcctggcca gcagccctct tgaccttcca gatctggccc tgggacaggc21301 tactcctggt ggctcaggga gctctggtga acctcaggcc cctgagaggg aaaaagtgtt以中國東北地區226個漢族精神分裂癥患者和他們健康父母雙親組成的核心家系(Trios)為研究對象。患者均于2000-2002年間入院，按國際疾病分類標準第10版(ICD-10)被診斷為精神分裂癥。這種基于家系的研究，系以父母雙親傳遞給患病子女的等位基因為“病例”，以未傳遞的等位基因為“對照”。因病例與對照等位基因均來自同樣的基因池，可避免人群層化問題。
家系成員均由外周靜脈抽取抗凝血5ml，用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl，加入到1.5ml離心管中，然后加入100ul的1×TE緩沖液，搖勻；②一邊振蕩，一邊加入200μl的B1試劑，充分混勻；③在振蕩中加入200μl的B2試劑，充分混勻；④將混合溶液移入旋轉離心柱中離心(14000rpm，分鐘)；⑤向旋轉離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm，1分鐘)；⑥重復上述步驟；⑦空柱離心(14000rpm，2分鐘)，將旋轉離心柱移入干凈的1.5ml離心管中，加入100μl的B4試劑離心(14000rpm，1分鐘)；此時離心管中的溶液體積為100μl，含有已經提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產的型號為Du640紫外分光光度儀，分別取波長260nm、280nm兩個波段，測得其相應DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通過公式，計算出DNA含量，公式為DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數，另外通過公式計算出DNA純度，公式為DNA純度＝OD260nm/OD280nm。
依據相應的堿基序列合成三對引物。rs2238769為TATCTAGGTTCACCTCGCTTGG和TCGTGTTCTCAGCCTGAGGG。rs1547931為GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC。rs2073732為AAGGCAGCGGAAAGCACCAG和GTTCACCAGAGCTCCCTGAG。PCR反應體系為20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of each dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR擴增條件為①94℃ 5min②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2個循環；③95℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 35s 6個循環；④94℃ 55s，56℃～58℃ 60s，72℃ 35s 28個循環；⑤72℃ 10min。取PCR產物5μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA marker DL2000為分子量標準品。所擴增的片段長度分別為222bp(8184～8405)、250bp(15134～15381)和230bp(21103～21332)。
在PCR擴增后的反應體系中，加入適量相對應的限制性內切酶及其酶切緩沖液，置37℃溫箱5小時。經2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型，其中有完全切開的純合基因型，未切開的純合基因型，既有切開又有未切開的雜合基因型。
建立Pedigree和SPSS SNP基因分型數據庫(參見表1和表2)，應用擬合優度卡方檢驗和傳遞不平衡檢驗，應用UNPHASED分析軟件進行單倍體傳遞卡方檢驗，利用SPSS軟件管理數據。
表1 Pedigree數據庫格式Number 病人 父親 母親 性別 狀態 PstI RsaIABC41 2 312 1/12/2ABC42 0 011 1/22/2ABC43 0 021 1/11/2ABC91 2 322 1/11/2ABC92 0 011 1/21/2ABC93 0 021 1/11/2ABC11 1 2 322 1/22/2ABC11 2 0 011 2/22/2ABC11 3 0 021 1/12/2
表2 SPSS數據庫格式 傳遞不平衡檢驗(Transmitted disequilibrium test，TDT)顯示在所有被檢測的SNPs當中，只有rs1547931與精神分裂癥顯著關聯(x2＝11.072，P＝0.001)。在226個家系452個父母中，167個為雜合子，而這些雜合父母分別將62個C等位基因和105個G等位基因傳遞給患病子女(見表3)。由于G等位基因傳遞過多，說明含G等位基因的單倍體或染色體可能攜帶決定精神分裂癥易感性的突變位點。
表3 UFD1L/CDC45L位點與精神分裂癥的關系等位基因 傳遞等位基因限制性SNPs主等位 次等位主等位次等位P內切酶基因基因 基因 基因Rs2238769 RsaIC G 108 870.133Rs1547931 PstIG C 105 620.001Rs2073732 PstIC T 107 850.112單倍體傳遞卡方檢驗(Haplotype transmission chi-square test)顯示有兩種單倍體系統與精神分裂癥密切相關聯，它們分別是rs2238769-rs1547931和rs1547931-rs2073732單倍體系統(見表4)。單倍體可以是一條染色體或一段染色體。故此結果進一步說明UFD1L/CDC45L位點rs2238769和rs2073732之間的染色體區域存在決定精神分裂癥易感性的突變位點。
表4 單倍體傳遞卡方檢驗結果單倍體 x2dfPRs2238769-rs1547931 19.8 30.00018Rs1547931-rs2073732 23.0 30.00004
根據本發明由UFD1L/CDC45L基因位點堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法，可對未表現精神分裂癥臨床癥狀的人群進行如下所示方法的篩查，rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。rs1547931堿基為C的個體不易發生精神分裂癥。對精神分裂癥易感人群在日常生活中應盡量減少誘發因素，如環境因素的刺激，可降低精神分裂癥的發病率。這是本發明的一個重要用途。
根據本發明，對精神分裂癥的患者可采用如基因敲除等基因工程方法針對性進行基因治療。另外，疾病基因的存在有可能導致蛋白質產物結構與功能的缺損或改變，阻礙或干擾特定生化通路中生物大分子的相互作用。正因為UFD1L/CDC45L位點的堿基突變，可能造成蛋白質表達及功能異常。本發明為進一步檢測蛋白功能，開發新型治療藥物，開展基于遺傳學背景的個體化藥物治療奠定了十分重要的基礎，并將帶來十分可觀的社會與經濟效益。
具體實施例方式
通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態性rs1547931的基因型分析，其rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。
1.基因組DNA提取受試者均由外周靜脈抽取抗凝血5ml，用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl，加入到1.5ml離心管中，然后加入100ul的1×TE緩沖液，搖勻；②一邊振蕩，一邊加入200μl的B1試劑，充分混勻；③在振蕩中加入200μl的B2試劑，充分混勻；④將混合溶液移入旋轉離心柱中離心(14000rpm，分鐘)；⑤向旋轉離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm，1分鐘)；⑥重復上述步驟；⑦空柱離心(14000rpm，2分鐘)，將旋轉離心柱移入干凈的1.5ml離心管中，加入100μl的B4試劑離心(14000rpm，1分鐘)；此時離心管中的溶液體積為100μl，含有已經提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產的型號為Du640紫外分光光度儀，分別取波長260nm、280nm兩個波段，測得其相應DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通過公式，計算出DNA含量，公式為DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數，另外通過公式計算出DNA純度，公式為DNA純度＝OD260nm/OD280nm。
2.PCR擴增目的片段應用以下引物序列GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC進行PCR擴增。PCR反應體系為20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR擴增條件為①94℃ 5min②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2個循環；③95℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 35s 6個循環；④94℃ 55s，56℃～58℃ 60s，72℃ 35s 28個循環；⑤72℃ 10min。取PCR產物5μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA marker DL2000為分子量標準品。所擴增的片段長度為250bp(15134～15381)
3.限制性內切酶酶切鑒定基因型酶切的反應體系為20μl，其中，10μl PCR產物，限制性內切酶PstI 0.8μl，酶切緩沖液2μl，BSA 0.2μl。置37℃溫箱5小時。經2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型，其中有完全切開的純合基因型(G/G)，未切開的純合基因型(C/C)，既有切開又有未切開的雜合基因型(C/G)。
4.結果判定rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。rs1547931堿基為C的個體不易發生精神分裂癥。
權利要求
1.一個與精神分裂癥密切相關聯的易感基因位點，是含有三個單核苷酸多態性的序列長度為69987bp的UFD1L/CDC45L位點，由于該位點的單核苷酸多態性rs1547931堿基C突變為G，從而與精神分裂癥的易感性相關聯。
2.一種根據權利要求1所述的UFD1L/CDC45L基因位點堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法，其特征是通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態性rs1547931的基因型分析，其rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群，具體作法是(1)基因組DNA提取，用微量DNA提取試劑盒提取基因組DNA，(2)PCR擴增目的片段，引物序列為GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC，(3)限制性內切酶酶切鑒定基因型，酶切的反應體系為20μl，其中，10μl PCR產物，限制性內切酶PstI 0.8μl，酶切緩沖液2μl，BSA 0.2μl，置37℃溫箱5小時，經2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據酶切圖譜判斷基因型，(4)結果判定，rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群，rs1547931堿基為C的個體不易發生精神分裂癥。
全文摘要
本發明提供一個與精神分裂癥的發生密切相關的易感基因位點，即含有三個單核苷酸多態性的序列長度為69987bp的UFD1L/CDC45L位點。由于該位點的單核苷酸多態性rs1547931堿基C突變為G，從而與精神分裂癥的易感性相關聯。rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。UFD1L/CDC45L位點及其編碼蛋白對闡明精神分裂癥遺傳學機制及建立基因診斷方法，指導精神分裂癥預防、開發新型治療藥物具有重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1603421SQ200410010790
公開日2005年4月6日 申請日期2004年4月5日 優先權日2004年4月5日
發明者尉軍, 鞠桂芝, 謝林, 劉樹錚, 于雅琴, 史杰萍, 沈巖, 許琪 申請人:吉林大學