專利名稱：復合擴增引物設計方法
技術領域：
本發明涉及一種體外一次性擴增多個DNA目的片段的引物設計方法。
背景技術：
復合擴增(multiplex PCR)又稱為多重PCR，是在一個反應體系中同時擴增兩個或兩個以上的基因座。具有高效、快速、節約檢材、減少成本的特點，特別是在法醫學鑒定中可以用極少量的檢材同時擴增出多個遺傳標志而更顯其優越性。自1988年Chambercian等首次提出這一概念，該技術在基因組結構與功能、病原體診斷、性別篩選、連鎖分析、遺傳疾病診斷、法醫學鑒定等許多領域得到廣泛應用。
復合擴增的最初幾個循環對PCR的靈敏度和特異性有實質性的影響。在DNA模板充分變性的情況下，高效且特異性擴增的實現直接取決于引物與目標片段的結合速率和延伸速率。因此引物設計是復合擴增成功的的首要決定因素。
根據引物設計的不同可以將復合擴增分為以下幾類1、傳統方法傳統的復合擴增是將多對原始引物混合于一個擴增體系，按照一個折衷的擴增條件擴增。由于人類基因組高度的復雜性，多重PCR反應中隨著使用引物對數的增加，在擴增體系中存在有大量各種序列的背景模板，為非特異性擴增提供了機會，得到錯誤擴增產物的機會就增大，需經過調換產生不需要產物的引物，調整引物之間的比例才能產生高度特異性的目的片段。同時還需經過一系列的試驗，優化復合擴增條件。因此，當復合擴增體系中的引物對達到一定數量時，PCR條件的優化會變得非常困難。
2、巢式PCR巢式PCR是通過采用兩套引物進行兩次獨立的擴增過程來達到提高靈敏度和特異性的目的。這種方法先將包含有目的序列的片段擴增，將擴增出的片段作為模板進行第二次擴增，可在一定程度上降低基因組DNA的影響，在大多數情況下，這種方法對于提高擴增的靈敏度和特異性無疑很有效，但其操作和應用較為復雜，不利于自動化操作，而且增加了交叉污染的機會。
3、GC鉗復合擴增GC鉗的方法是將一段40個富含GC堿基的序列連在一對引物的一條上，通過PCR的方法引入擴增的片段，這段富含GC的序列稱之為GC鉗(GC-clamp)。這個方法雖然靈敏度高，但是復合的引物對數量比較多，操作要求兩步擴增，且擴增的片段需在同一個基因內，最大的缺點是，擴增產物的檢測必須用變性梯度凝膠電泳，對檢測設備依賴性大。
4、同源加尾去二聚體系統這種方法是在復合擴增的每一條引物5′端連接一條相同的序列，在反應體系中同時加入同這一序列相同的引物，并且其退火溫度設計得高于特異引物，如果系統的特異引物之間可形成引物二聚體，在擴增反應的最初幾個循環產生的引物二聚體的產物，在擴增反應體系轉換為高的退火溫度時會形成“平鍋柄”結構，這種結構由于在每一個循環都不能進行擴增反應，可以有效地抑制引物二聚體，從而消除了對擴增系統的影響。在復合擴增引物對3′端有互補序列的情況下，這種方法無疑是最佳選擇，但是對于非3′端的引物間相互作用，由于不能形成單鏈“平鍋柄”結構，將起不到抑制二聚體的作用，所以這種方法的應用非常局限。
5、PCR抑制法這種方法只用一條基因座特異性引物，另一條為公共引物。其做法是先將包含有目的片段的序列從整個基因組用限制性內切酶切下，在兩端連上一段40個堿基長的富GC接頭序列，這一序列與公共引物互補。擴增時，帶有接頭的單鏈片段首先形成發卡結構，退火后，與接頭退火的引物延伸被抑制，只有特異引物可以延伸。此法的優點是具有極高的特異性，另外也可節省引物的費用，降低試驗成本；缺點是效率低，操作繁瑣，而且需要目的片段的側翼序列存在酶切位點。
6、嵌合引物法該方法每條引物的3′端序列是與基因組互補的特異序列，5′端是一段20個堿基的基因組無關序列，擴增體系中還加有一對公共引物，其序列與與嵌合引物的5′端序列一致。這種方法由于特異引物濃度低，引物間的相互作用減少，引物濃度比例容易調節，擴增條件易于優化，可提高擴增產物的特異性和靈敏度；缺點是原始引物和特異序列相加后長度過長，擴增目的片段的產物較原始片段增加了40個堿基，且操作較為煩瑣。
根據分離檢測系統的不同，可以將復合擴增分為聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染顯色法和毛細管電泳激光熒光檢測法兩大類。
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染顯色法是對復合擴增后的產物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀顯色。其中因分離目的不同，又分為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。前者是由于在凝膠中使用了變性劑，DNA以單鏈的形式在凝膠中運動，因此片段的分離是根據各自的長度和堿基的組成不同而彼此分開的；后者由于DNA是以雙鏈的形式運動，片段的分離是根據長度和DNA二級結構的不同而分離的。兩種方法各具特色，用途也不相同。總之此方法操作相對簡單，易于掌握，試劑、設備成本都不高。但是分析檢測無法自動化，通量不高，增加了人為因素，對復合擴增位點的片段大小限制多，對操作人員和環境也有一定污染，準確性、重復性也難以保證。
毛細管電泳激光熒光檢測法是在普通的復合擴增每個引物對中一條引物的5′端加上熒光標記物，PCR擴增產物使用毛細管電泳自動激光熒光檢測儀進行檢測。PCR擴增產物在毛細管電泳的分離過程中是以單鏈形式運動的，因此運動的速度同片段的長度和堿基組成相關。由于毛細管電泳的快速分離效果，堿基組成相差一個的兩個片段，也可以得到完全分離。加上不同熒光標記物的使用，可以使大小相近的片段由于熒光顏色的不同而彼此分開，增加了復合擴增基因座的選擇范圍和數量，充分發揮了復合擴增的優點。熒光檢測法雖然對實驗設備及附屬耗材的要求較高，但是由于實現了全部操作自動化，包括自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析，數據更為客觀、可靠，通量高；采用毛細管電泳技術，快速高效，分型準確、重復性好，系統靈敏度成倍提高，復合擴增的基因座的選擇余地較大；大多數實驗室進行熒光檢測復合擴增都使用商品化試劑盒，結果易于比較和參考；總體成本同前者相差不多。因此應用復合擴增技術進行熒光檢測分型是今后的發展方向。
目前在法醫學應用實踐中常用的商品化的試劑盒主要由AppliedBiosystems公司和Promega公司的生產。但這些試劑盒存在以下問題(1)商品化試劑盒涵蓋的基因座數量有限，以復合最多基因座的STRAmpFLSTRIdentifilerTMPCR Amplification Kit(Applied Biosystems生產)為例，它包含了CSF1PO，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D2S1338和D19S433等15個STR基因座，采用它進行親子鑒定時，在需要增加遺傳標記時則遇到困難。其它公司的情況也相似。(2)這些STR基因座都是針對中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發的，其中有些基因座，比如TPOX，在中國群體的基因頻率分布較差，個人識別能力較低。(3)國外商品化試劑盒價格昂貴，不符合實際應用的需求。
綜上所述，以上不同種類的復合擴增方式，各有不同的優缺點。傳統的復合擴增方法，由于操作簡便，容易實現，適用范圍廣泛，仍為大多數的實驗室所使用。
但是在實際應用中，DNA聚合酶，特別是Taq聚合酶在PCR反應過程中，除了依據堿基互補原則，將引物由5′端向3′端沿單鏈模板DNA向前延伸外，常常在PCR產物的3′末端加一個額外的堿基，這種非模板延伸的堿基通常是腺苷酸(腺苷酸簡寫為A)，我們把這種現象稱為“加A”。非模板延伸的結果是PCR產物的雙鏈DNA比目標序列長一個堿基或堿基對。但是這種“加A”現象并不是百分之百完成。對于銀染檢測方法，相同片段相差一個堿基(或堿基對)會表現為異常電泳行為，造成分型錯誤；而基于熒光檢測平臺，PCR擴增產物的檢測靈敏度大大提高，“加A”不全而導致的“雙尖峰”會造成分型的混亂。只有清晰尖銳的帶型或峰型才能準確進行分型。因此，要使PCR產物要么全部“加A”，或者全部不加。
有兩個途徑可促進完全“加A”在PCR循環后加一個步驟，60℃或72℃孵育30-45分鐘，可以改善“加A”情況。
Magnuson等人(Substrate nucleotide-determined non-templated addition ofadenine by Taq DNA polymeraseimplications for PCR-based genotyping and cloning，Biotechniques，1996年21期700-709頁)研究發現PCR產物“加A”程度依賴于模板序列，也就是反向引物序列。這樣每一個基因座由于反向引物序列的不同“加A”程度也不同。ABI310檢測PCR產物時，實際檢測的是由熒光標記引物延伸的PCR產物的單鏈，5′端標記熒光分子，3′末端延伸的模板就是反向引物序列。Brownstein等人(Modulation of non-templated nucleotideaddition by Taq DNA polymeraseprimer modifications that facilitate genotyping，Biotechniques，1996年20期1004-1010頁)發現，在反向引物5′端加一個鳥苷酸(簡寫為T)可有效增加“加A”程度；Butler等人(The development of reducedsize STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA，Journal of ForensicScience，2003年48期1054-1064頁)采用在反向引物5′端加GTTTCTT的方法來促進PCR產物的完全“加A”；Hanson等人(A highly discriminating 21 locusY-STR“Megaplex”system designed to augment the minimal haplotype loci forforensic casework，Journal of Forensic Science，2004年49期40-51頁)在循環完成后使用72℃孵育120分鐘的方法促進“加A”。上述Brownstein和Butler等人的方法雖然可以促進單鏈PCR產物的“加A”，但是由于僅僅是在一對引物中的一條上增加特殊序列，兩條引物的長度相差增大，引物與目標片段的結合速率和延伸速率不匹配，結果造成擴增效率的下降。

發明內容
鑒于TaqDNA聚合酶在PCR過程中的非模板擴增會引起PCR產物長短不一(一些加A而一些沒有加A)，造成分型判斷的錯誤，本發明特別地提出一種新的復合擴增引物設計方法。
本發明的復合擴增引物設計方法是在各個待擴增基因座的原始引物對中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，構成待擴增基因座的復合擴增引物對。
在本發明中，上述待擴增基因座的原始引物對是指可以通過互聯網從GDB(The Genome Database)數據庫(http//www.gdb.org)中檢索到的待擴增基因座寡核苷酸引物對，該原始引物對能夠與人類基因組序列特異性結合，它們被現有的常規擴增方法所采用。同時，該原始引物對的序列由待擴增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴增基因座序列的不同而不同。
在本發明中，無論是在一個反應體系中同時擴增兩個還是兩個以上的基因座，都應該在各個待擴增基因座的原始引物對中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，以構成各個待擴增基因座的復合擴增引物對。由于每個待擴增基因座都具有一個原始引物對，即兩個原始引物，因此，就每個待擴增基因座來說，都應該在其兩個原始引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，從而構成用于該待擴增基因座的兩個新的復合擴增引物，即復合擴增引物對。
若將本發明的引物設計方法應用于二個基因座的復合擴增體系中，而由互聯網上得到的該二基因座的原始引物對假定為Fl-R1和F2-R2，則應當以上述特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)與該二基因座的原始引物對Fl-R1、F2-R2構成新的復合擴增引物對，即第一個基因座的復合擴增引物對為5′-GTTCTT-F1-3′5′-GTTCTT-R1-3′第二個基因座的復合擴增引物對為5′-GTTCTT-F2-3′5′-GTTCTT-R2-3′將上述新的復合擴增引物對用于復合擴增體系中，所得到的PCR產物可以采用銀染方式檢測。
若在上述復合擴增引物對中的引物之一的5′端上進一步標記與熒光檢測儀配套的熒光標記物“YG”，就可以構成如下二對帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對5′-GTTCTT-F1-3′5′-YG-GTTCTT-R1-3′5′-GTTCTT-F2-3′5′-YG-GTTCTT-R2-3′當然，也可以構成如下二對帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對5′-YG-GTTCTT-F1-3′5′-GTTCTT-R1-3′5′-YG-GTTCTT-F2-3′5′-GTTCTT-R2-3′
另外，還可以構成如下二對帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對5′-GTTCTT-F1-3′5′-YG-GTTCTT-R1-3′5′-YG-GTTCTT-F2-3′5′-GTTCTT-R2-3′或者構成如下二對帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對5′-YG-GTTCTT-F1-3′5′-GTTCTT-R1-3′5′-GTTCTT-F2-3′5′-YG-GTTCTT-R2-3′利用這種帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對進行復合擴增，所得到的PCR產物可以使用熒光檢測方式進行檢測。在上述帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對中，“YG”表示熒光標記物，它可以采用現有的市售熒光標記物，如FAM、HEX、VIC、NED、PET等。
本發明的引物設計方法也可應用于二個以上基因座的復合擴增體系中，如三個或四個、六個基因座的復合擴增體系中，其復合擴增引物對或熒光復合擴增引物對的產生方法與上面的方式完全相同。
如圖1所示，在使用本發明設計的引物進行復合擴增時，每一個PCR反應實際包含兩個連續的過程。
第一個過程在開始的幾個循環時，是5′端加有非人類基因組序列GTTCTT的位點特異性引物(即復合擴增引物對或熒光復合擴增引物對，圖1中所示為采用熒光復合擴增引物對)在起作用，啟動復合擴增反應，將目標靶序列擴增，同時將非人類基因組序列整合到所擴增的片段上。
第二個過程整合了非人類基因組序列GTTCTT的擴增片段在經過第一個過程的逐漸成倍增加，做為PCR反應體系中的主要模板DNA，同新的熒光復合擴增引物對(或復合擴增引物對)完全匹配結合，使得擴增反應繼續進行。這一過程中由于模板DNA同熒光復合擴增引物對(或復合擴增引物對)的匹配堿基數量的增加，引物同模板DNA的結合速率相應提高，從而提高了擴增效率。
在本發明中，使用特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)同原始引物相加后，具有以下幾個優點(1)可以促進目的片段正反雙鏈的完全加A，消除相同片段加A不全造成的分型錯誤。(2)引物對中的每條引物均加上特殊序列，兩條引物的長度差距較原來減少或相同，兩條引物同目標片段的結合速率和延伸速率更加匹配，提高了擴增效率。(3)在擴增進行幾個周期后，新的復合擴增引物組合同待擴增片段的匹配堿基數較原始引物對增加了六個，可以提高復合擴增的特異性和效率。(4)本發明方案中的總引物數目沒有新的增加，有利于擴增條件的優化和復合擴增的進行。(5)新的復合擴增引物組合的5′端結構相同，引物間相互反應的可能性相對較小，有利于復合PCR的進行。
與普通原始引物的PCR產物作比較，在采用原始引物進行復合擴增時，由于TaqDNA聚合酶的非模板擴增作用，產物中加A和不加A的兩種片段在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中會造成帶型的模糊和混亂，如圖2所示。
而采用本發明的復合擴增引物進行復合擴增時，PCR產物的所有片段完全加A，PCR產物在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中不會造成帶型的模糊和混亂，如圖3所示。
如圖4所示，應用毛細管電泳激光熒光檢測法(用ABI310熒光檢測儀)對原始引物的PCR產物進行分離檢測時，加A不全的影響則更為明顯，其PCR產物的峰型變寬，雙尖峰型說明有兩種不同的PCR產物。
如圖5所示，應用毛細管電泳激光熒光檢測法對本發明中復合擴增引物的PCR產物進行分離檢測時可以看到，PCR產物的峰型尖銳，易于判讀和分析。
需要說明的是Butler等人使用在反向引物的5′端增加GTTTCTT序列的方法來促進熒光標記引物的3′端完全加A(其PCR反應的過程如圖6、7所示)，這個方法從檢測意義上可以滿足分型準確的要求，但是卻會影響復合擴增的效率。由于反向引物較原引物增加了GTTTCTT序列，根據Tm＝4(G+C)+2(A+T)的計算公式，反向引物的退火溫度較原引物增加了18℃，造成兩條引物退火溫度的差異較原來也相應增加了18℃；同時標記熒光分子的正向引物和帶有GTTTCTT序列的反向引物長度不相同，正向引物同基因組DNA、產物1和產物3的連接速率快，延伸效率高，而堿基數量長了7個的反向引物同基因組DNA、產物2和產物4的連接速率慢，延伸效率低，直接影響擴增效率。
因此，與Butler等人使用的方法相比較，本發明的方法可以明顯地提高擴增效率。
本發明的內容結合以下實施例作更進一步的說明，但本發明的內容不僅限于實施例中所涉及的內容。


圖1是使用本發明所設計引物進行復合擴增時的PCR反應過程圖。
圖2是使用原始引物的PCR產物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖3是使用本發明復合擴增引物的PCR產物使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖4是使用原始引物(帶熒光標記物)的PCR產物熒光檢測結果圖。
圖5是使用本發明熒光復合擴增引物的PCR產物熒光檢測結果圖。
圖6是使用Butler等人所設計引物進行復合擴增時的PCR第一階段反應過程圖。
圖7是使用Butler等人所設計引物進行復合擴增時的PCR第二階段反應過程圖。
圖8是實施例1中采用熒光復合擴增引物的PCR產物熒光檢測結果圖。
具體實施例方式
實施例1在本實施例中，我們選用以下四個基因座DYS510、DYS520、DYS542和DYS561。
通過互聯網，從GDB(The Genome Database)數據庫(http//www.gdb.org)中檢索到上述四個基因座的原始引物對為DYS510 Y4C113F′ (5′--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)Y4C113R′ (5′--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)DYS520 Y4C16fF′ (5′--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)Y4Cl6fR′ (5′--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)DYS542 Y4C37F′ (5′--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)Y4C37R′ (5′--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)
DYS561 Y4C87F′ (5′--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)Y4C87R′ (5′--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)依照本發明的引物設計方法，得到新的復合擴增引物對為NDP 510 510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′(5′--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520 520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′(5′--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 542 542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′(5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561 561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′(5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)由于DYS520/DYS561與DYS542/DYS561的擴增片段大小彼此兩兩重疊，我們使用了市售的兩種顏色的熒光標記物FAM和HEX標記每個基因座的引物對中的后引物。藍色熒光標記物FAM標記DYS520和DYS542，綠色熒光標記物HEX標記DYS510和DYS561，得到帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對NDP 510 510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′(5′--HEX--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520 520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′(5′--FAM--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 542 542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′(5′--FAM--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561 561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′(5′--HEX--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)為了進一步說明本實例中所設計引物的使用方法和使用效果，下面繼續說明本實施例中所設計引物用于復合擴增反應時的具體過程及擴增產物的檢測結果。
PCR反應體系總體積37.5μl，DNA模板約10ng、dNTP 8.0μL(0.2mMol/l)、Taq酶(申能博采，國產)2u、10×buffer 3.75μl、Mg2+3μl(2.25mmol/L)、引物混合物2.3μMol(含有四條熒光標記引物，DYS5101μMol，DYS5200.42μMol，DYS5420.36μMol，DYS5610.52μMol)。
PCR擴增參數94℃3分鐘94℃30秒58℃50秒72℃30秒30個循環72℃4 45分鐘4℃ 保存上述復合擴增后所得到的PCR產物使用ABI310遺傳分析儀(PE美國)檢測分析。PCR產物0.1μl，LS300 ROX size standard 0.2μl，Hi-DiTMformamide13μl，混勻編號，放入自動進樣盤。電進樣15000V、5s。電泳15000v，24分鐘。Date Collection軟件收集數據，Genescan3.7分析數據，用修改過的4-Y-STR在Genetype3.7自動分型。等位基因的辨認通過與等位基因分型標準物比較來確認，窗口范圍+/-0.5bp。
本實施例中的PCR產物熒光檢測結果如圖8所示。圖中的藍色標記(用標號1指示)的為DYS520和DYS542，綠色標記(用標號2指示)的為DYS510和DYS561，紅色標記(用標號3指示)的為ROX內標，genescan軟件分析結果顯示檢測到FAM標記的181bp和250bp大小的兩個片段，HEX標記的202bp和270bp兩個片段。
采用本實施例設計的引物進行多基因座擴增后，其擴增產物生成量大，毛細管電泳熒光檢測器檢測到的熒光信號強，檢測到的產物峰型細長高挑，為進一步的分型打下了良好的基礎。同時，所得到的擴增產物經過測序，證實擴增產物的DNA序列與目的DNA片段序列一致。
實施例2在本實施例中，我們選用以下六個基因座DYS510，DYS520，DYS531，DYS533，DYS542，DYS561。
通過互聯網，從GDB(The Genome Database)數據庫(http//www.gdb.org)中檢索到上述六個基因座的原始引物對為DYS510 Y4C113F′(5′--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)
Y4C113R′ (5′--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)DYS520Y4C16fF′ (5′--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)Y4C16fR′ (5′--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)DYS531Y4C212f′ (5′--GACCCACTGGCATTCAAATC--3′)Y4C212r′ (5′--TGCTCCCTTTCTTTGTAGACG--3′)DYS533Y4C215f′ (5′--CATCTAACATCTTTGTCATCTACC--3′)Y4C215r′ (5′--TGATCAGTTCTTAACTCAACCA--3′)DYS542Y4C37F′ (5′--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)Y4C37R′ (5′--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)DYS561Y4C87F′ (5′--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)Y4C87R′ (5′--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)依照本發明的引物設計方法，得到新的復合擴增引物對為NDP 510510F′ (5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′ (5′--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520520F′ (5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′ (5′--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 531531F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)531R′ (5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 533533F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)533R′ (5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)NDP 542542F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′ (5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561561F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′ (5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)由于DYS520/DYS561與DYS542/DYS561/DYS533的擴增片段大小彼此兩兩重疊，我們使用了三種顏色的熒光標記物TEMRA(黃色)、FAM(藍色)和HEX(綠色)標記每個基因座的引物對中的后引物。FAM標記DYS531、DYS520和DYS542，HEX標記DYS510和DYS561，TEMRA標記DYS533，得到帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對
NDP 510510F′ (5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)510R′ (5′--HEX-GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)NDP 520520F′ (5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)520R′ (5′--FAM-GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)NDP 531531F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)531R′ (5′--FAM-GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 533533F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)533R′ (5′-TEMRA-GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)NDP 542542F′ (5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)542R′ (5′--FAM-GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)NDP 561561F′ (5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)561R′ (5′--HEX-GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)本實施例中所設計引物用于復合擴增反應時的具體過程及擴增產物的檢測結果與實施例1相類似，此處不再贅述。
權利要求
1.一種復合擴增引物設計方法，其特征是在各個待擴增基因座的原始引物對中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，構成待擴增基因座的復合擴增引物對。
2.如權利要求1所述的復合擴增引物設計方法，其特征是在所述復合擴增引物對中的引物之一的5′端上標記熒光標記物，構成帶熒光標記物的熒光復合擴增引物對。
全文摘要
一種復合擴增引物設計方法，其特征是在各個待擴增基因座的原始引物對中的每一引物的5′端分別加上一段非人類基因組的特殊序列YYP(5′－GTTCTT－3′)，構成待擴增基因座的復合擴增引物對。與現有同類方法相比較，發明的方法可以明顯地提高擴增效率。
文檔編號C12P19/34GK1597976SQ20041004026
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月20日 優先權日2004年7月20日
發明者侯一平, 李英碧, 戴浩霖, 王旭東, 吳謹 申請人:四川大學