專利名稱：一種穩定同位素標記的的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種15N-L-天冬氨酸的制備方法，具體地說是涉及一種以大腸桿菌游離整體細胞作酶源來制備穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的方法；屬于穩定性同位素標記化合物生產領域，涉及到微生物酶和生物下游分離技術。
背景技術：
由于15N比普通的14N多一個質量單位，而且其核自旋I＝1/2，具有核磁共振信號，因此可利用它的質量效應和同位素效應，借助質譜等測試技術，獲得寶貴的結構信息。所以無放射性的穩定同位素標記的氨基酸因有著獨特的示蹤作用而得到廣泛的應用。15N標記的氨基酸，是研究人體蛋白質代謝和個別氨基酸代謝，以及氨基酸之間轉氨作用的不可缺少的示蹤物。隨著人類基因圖譜的測定、蛋白質工程的發展及其他相關科學的快速發展，15N-L-天冬氨酸等標記氨基酸將在醫學、藥物學、生物學、生命科學、農業科學、有機化學等領域得到更為廣泛的應用。
傳統的生產15N-L-氨基酸的方法可采用有機合成法、微生物發酵法或酶法及標記蛋白質分解分離制備法等。采用合成法比較簡單，但需要光學拆分使15N原料利用率大為降低，成本上升。標記蛋白質分解分離制備法常用于制備復合氨基酸，要分離得到單一氨基酸很難。采用酶法生產15N-L-天冬氨酸，產物較單一，雜酸很少，分離比較簡單。但由于培養酶液的發酵配方中存在有機氮源，常使15N-L-天冬氨酸的豐度下降較多達不到產品質量要求。故需對豐度下降及15N的利用率加以技術上的控制。目前，在15N穩定性同位素標記L-天冬氨酸的生產領域中僅見一篇國內專利報道，申請號為03141991.7。該專利申請的豐度下降值較大，15N的利用率較低，并未述及反應殘余的15N原料的回收。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，該制備方法通過采用游離整體細胞酶法生產15N-L-天冬氨酸的技術路線，旨在以一定的技術條件緩和15N豐度下降的問題，并盡量提高15N利用率。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下工藝步驟(1).發酵產酶所采用的微生物大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11303或CGMCC 1.881；(2).斜面培養培養基為營養肉汁瓊脂培養基(g/L)蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化鈉5.0，瓊脂15.0，蒸餾水1.0L，pH值6.8～7.2，定容至1.0L，分裝，0.1MPa(121℃)滅菌20分鐘，菌種接入后28℃～32℃培養16～24小時；(3).發酵培養以碳源、氮源、微量元素離子配置成發酵培養基，調節其pH值5～9，滅菌后接入大腸桿菌斜面種子，于150～260rpm，22℃～40℃，培養16～24小時；裝液量為50ml/500ml，滅菌條件為0.1MPa(121℃)，20分鐘；菌體的生長濃度通過分光光度法加以分析；(4).酶反應底物反應液(g/L)底物反丁烯二酸的濃度為50g/L～200g/L，以100g/L～150g/L為較佳，加入微量元素離子及15N氮源后用NaOH調節pH值為7.5～9.5；將發酵所得游離整體細胞作為酶源加入底物溶液中，菌體加入量0.5重量％～1.2重量％，在30℃～50℃下，更適宜的35℃～40℃反應20～28小時，中間經取樣以分光光度法測試反丁烯二酸的濃度小于0.25重量％時停止反應；反應過程中及最終反應結束時反丁烯二酸的濃度通過紫外分光光度法來測定，從而可計算出轉化率；(5).提取精制及15N的回收反應結束后，將酶反應液進行離心，上清液于旋轉蒸發儀上趕氨濃縮，所溢出氨加以吸收回收，直至冷凝液pH值為6.5～7.5；然后將該溶液加熱至75℃～85℃，加入0.2～0.8重量％活性炭脫色30～45分鐘，過濾得無色濾液；將濾液置于恒溫磁力攪拌器或旋轉蒸發儀上加以濃縮至原來體積的1/5～1/3，待溫度維持在60℃～70℃，加入鹽酸等酸調節pH值至2.80～3.00，逐漸有晶體析出；冷至室溫后，放冰箱冷藏過夜，第二天抽濾得白色晶體，洗滌、抽干，將晶體刮入容器內，于50℃～60℃真空烘干；對產品進行純度、豐度檢測，純度＜98.5％可再行重結晶，最終得到15N-L-天冬氨酸產品；15N的摩爾轉化率在70％以上，最終15N的利用率達65.99％；等電點母液濃縮后可再調pH或再上柱提純又可得到產品；對反應殘余的15N原料的回收達80％以上。
所述的步驟(3)發酵培養以碳源、氮源、微量元素離子配置成發酵培養基，調節其pH值6～8，滅菌后接入大腸桿菌斜面種子，于180～200rpm，25℃～37℃，培養16～24小時。
所述的碳源選自葡萄糖、反丁烯二酸、果糖、蔗糖，或含這些糖的糖蜜、淀粉。
所述的氮源選自氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨、氨水，或酵母提取物、玉米漿、玉米淀粉中的一種或多種。
所述的步驟(3)中，微量元素離子選自磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣中的一種或多種。
所述的步驟(3)中，有機氮源玉米漿的添加可通過測定菌體濃度來加以控制，以發酵液稀釋10倍后于650nm處測得的吸光度值為0.680作為判斷依據。
所述的發酵培養基(g/L)玉米漿60，反丁烯二酸20，MgSO4.7H2O 0.2，KH2PO40.5，氨水調pH值5～9，煮沸后過濾。
所述的步驟(4)中，底物為反丁烯二酸，底物溶液中所用的15N氮源為15N標記的氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨、氨水、尿素中的一種或多種。
所述的步驟(4)中，微量元素離子選自磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣中的一種或多種。
本發明的技術方法，已建立起一套實驗室規模的生產工藝，體現出了酶法制備15N-L-氨基酸的優越性，有利于15N利用率的提高及后提取工藝的簡化，減少了生產成本，提高了產品品質，以較高的15N利用率得到豐度下降值很小的產品，且提取得率很高，大大提高了產品的市場競爭力。
具體實施例方式
本發明將通過以下具體實施例來說明本技術的實施過程。
實施例1將斜面培養18小時的大腸桿菌接入發酵培養基，500ml三角瓶中裝50ml培養基，于30℃恒溫搖床培養20小時，轉速180rpm。培養所得發酵液于4800rpm離心30分鐘，傾去上清液，取得到的濕菌體0.5克加入到底物濃度為10％、含豐度為10.39at％的15N-硫酸銨7.7重量％、0.01重量％的硫酸鎂的底物溶液100ml中，用NaOH調節pH值為7.9，于35℃恒溫反應23小時。得到的反應液經離心，上清液趕氨濃縮至pH值7.5后，加入活性碳0.2克脫色30分鐘后得無色溶液，濃縮至25ml，加入硫酸調至pH值2.85，析出較多晶體，冷卻，第二天抽濾、洗滌，得雪白晶體，烘干，得產品9.92克，豐度為10.38at％，僅比原料絕對下降0.01at％，相對下降0.09at％，提取得率為89.3重量％。
實施例2取與實施例1一樣培養的濕菌體2.0克，加入到底物濃度為11.6重量％，含豐度為99.53at％的15N-氯化銨7.4重量％、0.01重量％的硫酸鎂的底物溶液200ml中，用10MNaOH調節pH值為9.0，于39℃恒溫反應27小時。得到的反應液經離心，上清液趕氨濃縮至pH值6.5后，加入活性碳0.6克脫色35分鐘后得無色溶液，濃縮至55ml，加入鹽酸調至pH值3.00，析出大量白色晶體，冷卻，第二天抽濾、洗滌，得雪白晶體，烘干，得產品23.65克，豐度為99.18at％，僅比原料絕對下降0.35at％，相對下降0.35at％，提取得率達90.3重量％。
實施例3將斜面培養20小時的大腸桿菌接入發酵培養基，500ml三角瓶中裝50ml培養基，于32℃恒溫搖床培養24小時，轉速200rpm。培養所得發酵液于4800rpm離心30分鐘，傾去上清液，取得到的濕菌體0.5克加入到底物濃度為10％、含豐度為98.50at％的15N-硫酸銨8重量％、0.01重量％的硫酸鎂的底物溶液100ml中，用NaOH調節pH值為8.3，于37℃恒溫反應25小時。得到的反應液經離心，上清液趕氨濃縮至pH值6.8后，加入活性碳0.25克脫色40分鐘后得無色溶液，濃縮至20ml，加入硫酸調至pH值2.80，析出較多晶體，冷卻，第二天抽濾、洗滌，得雪白晶體，烘干，得產品10.05克，豐度為98.19at％，僅比原料絕對下降0.31at％，相對下降0.31at％，提取得率為90.5重量％。
實施例4取與實施例3一樣培養的濕菌體2.2克，加入到底物濃度為15.0重量％，含豐度為99.62at％的15N-氯化銨9重量％、0.01重量％的硫酸鎂的底物溶液200ml中，用10MNaOH調節pH值為9.2，于40℃恒溫反應26小時。得到的反應液經離心，上清液趕氨濃縮至pH值6.5后，加入活性碳1.0克脫色45分鐘后得無色溶液，濃縮至60ml，加入鹽酸調至pH值2.90，析出大量白色晶體，冷卻，第二天抽濾、洗滌，得雪白晶體，烘干，得產品31.08克，豐度為99.28at％，僅比原料絕對下降0.34at％，相對下降0.34at％，提取得率達91.5重量％。
權利要求
1.一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下工藝步驟(1).發酵產酶所采用的微生物大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11303或CGMCC 1.881；(2).斜面培養培養基為營養肉汁瓊脂培養基(g/L)蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化鈉5.0，瓊脂15.0，蒸餾水1.0L，pH值6.8～7.2，定容至1.0L，分裝，0.1MPa(121℃)滅菌20分鐘，菌種接入后28℃～32℃培養16～24小時；(3).發酵培養以碳源、氮源、微量元素離子配置成發酵培養基，調節其pH值5～9，滅菌后接入大腸桿菌斜面種子，于150～260rpm，22℃～40℃，培養16～24小時；裝液量為50ml/500ml，滅菌條件為0.1MPa(121℃)，20分鐘；菌體的生長濃度通過分光光度法加以分析；(4).酶反應底物反應液(g/L)底物反丁烯二酸的濃度為50g/L～200g/L，以100g/L～150g/L為較佳，加入微量元素離子及15N氮源后用NaOH調節pH值為7.5～9.5；將發酵所得游離整體細胞作為酶源加入底物溶液中，菌體加入量0.5重量％～1.2重量％，在30℃～50℃下，更適宜的35℃～40℃反應20～28小時，中間經取樣以分光光度法測試反丁烯二酸的濃度小于0.25重量％時停止反應；反應過程中及最終反應結束時反丁烯二酸的濃度通過紫外分光光度法來測定，從而可計算出轉化率；(5).提取精制及15N的回收反應結束后，將酶反應液進行離心，上清液于旋轉蒸發儀上趕氨濃縮，所溢出氨加以吸收回收，直至冷凝液pH值為6.5～7.5；然后將該溶液加熱至75℃～85℃，加入0.2～0.8重量％活性炭脫色30～45分鐘，過濾得無色濾液；將濾液置于恒溫磁力攪拌器或旋轉蒸發儀上加以濃縮至原來體積的1/5～1/3，待溫度維持在60℃～70℃，加入鹽酸等酸調節pH值至2.80～3.00，逐漸有晶體析出；冷至室溫后，放冰箱冷藏過夜，第二天抽濾得白色晶體，洗滌、抽干，將晶體刮入容器內，于50℃～60℃真空烘干；對產品進行純度、豐度檢測，純度＜98.5％可再行重結晶，最終得到15N-L-天冬氨酸產品；15N的摩爾轉化率在70％以上，最終15N的利用率達65.99％；等電點母液濃縮后可再調pH值或再上柱提純又可得到產品；對反應殘余的15N原料的回收達80％以上。
2.根據權利要求1所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)發酵培養以碳源、氮源、微量元素離子配置成發酵培養基，調節其pH值6～8，滅菌后接入大腸桿菌斜面種子，于180～200rpm，25℃～37℃，培養16～24小時。
3.根據權利要求1或2所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的碳源選自葡萄糖、反丁烯二酸、果糖、蔗糖，或含這些糖的糖蜜、淀粉。
4.根據權利要求1或2所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的氮源選自氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨、氨水，或酵母提取物、玉米漿、玉米淀粉中的一種或多種。
5.根據權利要求1或2所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，微量元素離子選自磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣中的一種或多種。
6.根據權利要求1或2所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，有機氮源玉米漿的添加可通過測定菌體濃度來加以控制，以發酵液稀釋10倍后于650nm處測得的吸光度值為0.680作為判斷依據。
7.根據權利要求1或2所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的發酵培養基(g/L)玉米漿60，反丁烯二酸20，MgSO4.7H2O 0.2，KH2PO40.5，氨水調pH值5～9，煮沸后過濾。
8.根據權利要求1所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，底物為反丁烯二酸，底物溶液中所用的15N氮源為15N標記的氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨、氨水、尿素中的一種或多種。
9.根據權利要求1所述的一種穩定同位素標記的15N-L-天冬氨酸的制備方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，微量元素離子選自磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣中的一種或多種。
全文摘要
本發明涉及一種穩定同位素標記的
文檔編號C12P13/20GK1869245SQ20051002624
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月27日 優先權日2005年5月27日
發明者侯靜華, 周震, 李良君, 杜曉寧, 宋明鳴 申請人:上海化工研究院