專利名稱：牛結核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物檢測技術，尤其涉及一種牛結核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒。
背景技術：
牛結核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛型結核桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種人畜共患的慢性傳染病。世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。牛結核桿菌是牛結核病的致病菌。牛結核桿菌的細菌學檢查是確診牛結核病的重要依據。
目前，牛結核桿菌的傳統檢查方法是采用抗酸桿菌涂片和牛結核桿菌培養?？顾釛U菌涂片檢查敏感性低、特異性差，無法確定細菌死活。牛結核桿菌的培養通常是將待檢標本接種至改良羅氏培養基，37℃培養20-60天，待細菌生長后再依據生物學特征及生化反應多項指標綜合判斷。這種牛結核桿菌的培養方法耗費時間長，而且操作煩瑣，無法滿足快速確診牛結核病的需要。

發明內容
本發明的目的，在于解決上述現有技術存在的問題，提供一種牛結核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒，以滿足快速確診牛結核病的需要。
本發明的目的是這樣實現的牛結核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，包括樣品處理液、增菌液、分枝桿菌噬菌體、中止液和菌落培養皿。
所述的樣品處理液為2-4％的氫氧化鈉溶液；所述的增菌液由米氏7H9培養基5-7重量份、氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的純水中制備而成；所述的中止液為5-8％的硫酸亞鐵氨溶液；所述的菌落培養皿由1.5-3％的熔化瓊脂6-8體積份、增菌液6-8體積份和指示菌1-2體積份混勻凝聚于無菌平皿中形成。
所述的指示菌為恥垢分枝桿菌或草分枝桿菌。
牛結核桿菌菌體的快速鑒定方法，采用牛結核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑，按以下步驟進行a、取10-50毫升待檢樣品置于樣品管中，加入等量的樣品處理液，室溫作用20-30分鐘，然后離心分離；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1-2毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.1-0.2毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.1-0.2毫升，室溫作用10分鐘；e、取步驟d所得液體10-20微升，滴于菌落培養皿上，在35-38℃下培養15-20小時，觀察結果，如在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結核桿菌菌體，反之則不存在。
上述步驟a中所述的待檢樣品包括牛的鼻汁、乳汁、糞便、痰液、穿刺液。
本發明的方法原理是通過制備感受態細菌的方式，將待檢菌株置于易感狀態，并被分枝桿菌噬菌體感染，噬菌體在感染菌中增殖，并將感染菌裂解，釋放出的噬菌體立即感染菌落培養皿中的指示菌并使其裂解，在菌落培養皿上出現肉眼可見的透亮圈。如待檢樣品中不含活的牛結核桿菌，則噬菌體未能進入感染細胞而被隨后加入的中止液所滅活，因此不會造成指示菌被噬菌體感染，菌落培養皿不會出現透明圈。由于處于感受態的牛結核桿菌極易被相應的噬菌體感染，而且噬菌體在感染菌體內繁殖迅速，加上菌落培養皿中的指示菌生長快速，所以，本發明的試劑盒特異性強、敏感度高、操作簡便、結果明晰，可用于各種待檢樣品中活的牛結核桿菌菌體快速鑒定及其對藥物的敏感性試驗。非常適合飼養奶牛畜牧場、生產牛奶的企業以及各級獸醫基層單位應用。又因噬菌體只能感染活加藥管菌，而且感染結果是將菌體裂解，因此，本發明的試劑和方法既可檢測待檢標本中是否存在活的牛結核桿菌菌體，又可保護實驗人員免受感染。
具體實施例方式
實施例1一、試劑配制樣品處理液取3克固體氫氧化鈉溶于純水并稀釋至100毫升，配制成氫氧化鈉溶液；增菌液取米氏7H9培養基6克、氯化鈣2克、氨芐青霉素28克、二性霉素B30克、牛血清白蛋白150克、葡萄糖12克、油酸2克和過氧化氫酶0.1克溶于1000毫升純水中，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；中止液取固體硫酸亞鐵氨7克，溶于純水并稀釋至100毫升，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；菌落培養皿取濃度為2％的熔化瓊脂7毫升，加入到市售的一次性無菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液7毫升和1毫升快速生長的恥垢分枝桿菌，混勻，凝聚成型。
二、牛結核桿菌菌體的快速鑒定a、取50毫升牛的穿刺液置于樣品管中，加入等量的氫氧化鈉溶液，室溫作用25分鐘，然后在每分鐘8000轉下離心8分鐘；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.1毫升，室溫下作用10分鐘；e、取步驟d所得液體10微升，滴于菌落培養皿上，在37℃下培養18小時，觀察結果，如在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結核桿菌菌體，反之則不存在。
三、牛結核桿菌菌體的藥敏試驗a、將待檢菌株以標準比濁法制備成濃度為1毫克/毫升的懸液；b、取步驟a所得懸液1毫升稀釋至1000毫升，制備成濃度為1微克/毫升的懸液；c、取兩試驗管1和2作為加藥管，各加入1毫克/毫升懸液0.5毫升；d、取兩試驗管3和4作為對照管，各加入1微克/毫升懸液0.5毫升；e、在試驗管1和3中各加入0.1毫升試驗藥物，在試驗管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下溫育30小時；f、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；g、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升中止液，室溫作用5分鐘；h、取步驟g中所得各加藥管和對照管中的溶液各15微升，分別滴于菌落培養皿上，在37℃下溫育18小時，觀察結果。如對照管樣品在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈、加藥管無透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為耐藥株；如對照管和加藥管樣品在滴樣區域均出現全透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為敏感株。
實施例2一、試劑配制樣品處理液取2克固體氫氧化鈉溶于純水并稀釋至100毫升，配制成氫氧化鈉溶液；增菌液取米氏7H9培養基5克、氯化鈣2克、氨芐青霉素25克、二性霉素B50克、牛血清白蛋白100克、葡萄糖15克、油酸1克和過氧化氫酶0.2克溶于1000毫升純水中，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；中止液取固體硫酸亞鐵氨5克，溶于純水并稀釋至100毫升，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；菌落培養皿取濃度為1.5％的熔化瓊脂6毫升，加入到市售的一次性無菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液6毫升和1.5毫升快速生長的草分枝桿菌，混勻，凝聚成型。
二、牛結核桿菌菌體的快速鑒定a、取25毫升牛的乳汁置于樣品管中，加入等量的氫氧化鈉溶液，室溫作用20分鐘，然后在每分鐘8000轉下離心5分鐘；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1.5毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.15毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.15毫升，室溫下作用10分鐘；e、取步驟d所得液體15微升，滴于菌落培養皿上，在37℃下培養15小時，觀察結果，如在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結核桿菌菌體，反之則不存在。
三、牛結核桿菌菌體的藥敏試驗a、將待檢菌株以標準比濁法制備成濃度為1毫克/毫升的懸液；b、取步驟a所得懸液1毫升稀釋至1000毫升，制備成濃度為1微克/毫升的懸液；c、取兩試驗管1和2作為加藥管，各加入1毫克/毫升懸液0.5毫升；d、取兩試驗管3和4作為對照管，各加入1微克/毫升懸液0.5毫升；e、在試驗管1和3中各加入0.1毫升試驗藥物，在試驗管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下溫育24小時；f、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；g、向各加藥管和對照管中各加入0.15毫升中止液，室溫作用5分鐘；h、取步驟g中所得各加藥管和對照管中的溶液各10微升，分別滴于菌落培養皿上，在37℃下溫育15小時，觀察結果。如對照管樣品在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈、加藥管無透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為耐藥株；如對照管和加藥管樣品在滴樣區域均出現全透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為敏感株。
實施例3一、試劑配制樣品處理液取4克固體氫氧化鈉溶于純水并稀釋至100毫升，配制成氫氧化鈉溶液；增菌液取米氏7H9培養基7克、氯化鈣1.5克、氨芐青霉素50克、二性霉素B25克、牛血清白蛋白200克、葡萄糖10克、油酸1.5克和過氧化氫酶0.2克溶于1000毫升純水中，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；中止液取固體硫酸亞鐵氨8克，溶于純水并稀釋至100毫升，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；菌落培養皿取濃度為3％的熔化瓊脂8毫升，加入到市售的一次性無菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液8毫升和1.5毫升快速生長的恥垢分枝桿菌，混勻，凝聚成型。
二、牛結核桿菌菌體的快速鑒定a、取10毫升牛的鼻汁置于樣品管中，加入等量的氫氧化鈉溶液，室溫作用25分鐘，然后在每分鐘8000轉下離心10分鐘；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入2毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.2毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.2毫升，室溫下作用10分鐘；e、取步驟d所得液體20微升，滴于菌落培養皿上，在37℃下培養20小時，觀察結果，如在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結核桿菌菌體，反之則不存在。
三、牛結核桿菌菌體的藥敏試驗a、將待檢菌株以標準比濁法制備成濃度為1毫克/毫升的懸液；b、取步驟a所得懸液1毫升稀釋至1000毫升，制備成濃度為1微克/毫升的懸液；c、取兩試驗管1和2作為加藥管，各加入1毫克/毫升懸液0.5毫升；d、取兩試驗管3和4作為對照管，各加入1微克/毫升懸液0.5毫升；e、在試驗管1和3中各加入0.1毫升試驗藥物，在試驗管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下溫育30小時；f、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；g、向各加藥管和對照管中各加入0.2毫升中止液，室溫作用10分鐘；h、取步驟g中所得各加藥管和對照管中的溶液各20微升，分別滴于菌落培養皿上，在37℃下溫育20小時，觀察結果。如對照管樣品在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈、加藥管無透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為耐藥株；如對照管和加藥管樣品在滴樣區域均出現全透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為敏感株。
權利要求
1.一種牛結核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，其特征在于包括樣品處理液、增菌液、分枝桿菌噬菌體、中止液和菌落培養皿。
2.如權利要求1所述的牛結核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，其特征在于所述的樣品處理液為2-4％的氫氧化鈉溶液；所述的增菌液由米氏7H9培養基5-7重量份、氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的純水中制備而成；所述的中止液為5-8％的硫酸亞鐵氨溶液；所述的菌落培養皿由1.5-3％的熔化瓊脂6-8體積份、增菌液6-8體積份和指示菌1-2體積份混勻凝聚于無菌平皿中形成。
3.如權利要求2所述的牛結核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，其特征在于所述的指示菌為恥垢分枝桿菌或草分枝桿菌。
4.一種牛結核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于采用牛結核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，按以下步驟進行a、取10-50毫升待檢樣品置于樣品管中，加入等量的樣品處理液，室溫作用20-30分鐘，然后離心分離；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1-2毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.1-0.2毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.1-0.2毫升，室溫作用10分鐘；e、取步驟d所得液體10-20微升，滴于菌落培養皿上，在35-38℃下培養15-20小時，觀察結果，如在滴樣區域出現全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結核桿菌菌體，反之則不存在。
5.如權利要求4所述的牛結核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于步驟a中所述的待檢樣品包括牛的鼻汁、乳汁、糞便、痰液、穿刺液。
6.如權利要求4所述的牛結核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于步驟a中所述的樣品處理液為2-4％的氫氧化鈉溶液；步驟b中所述的增菌液由米氏7H9培養基5-7重量份、氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的純水中制備而成；步驟d中所述的中止液為5-8％的硫酸亞鐵氨溶液；步驟e中所述的菌落培養皿由1.5-3％的熔化瓊脂6-8體積份、增菌液6-8體積份和指示菌1-2體積份混勻凝聚于無菌平皿中形成。
7.如權利要求6所述的牛結核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于所述的指示菌為恥垢分枝桿菌或草分枝桿菌。
全文摘要
本發明提供了一種牛結核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒，試劑盒包括樣品處理液、增菌液、分枝桿菌噬菌體、中止液和菌落培養皿。牛結核桿菌菌體的快速鑒定方法包括用樣品處理液處理待檢樣品、用增菌液增菌、使分枝桿菌菌體感染噬菌體、用中止液滅活噬菌體以中止感染、將待測液滴于菌落培養皿上溫育及根據菌落培養皿上噬菌斑的形成情況判定結果等步驟。本發明的試劑盒和鑒定方法特異性強、敏感度高、操作簡便、結果明晰，可用于各種待檢樣品中活的牛結核桿菌菌體快速鑒定及其對藥物的敏感性試驗。非常適合飼養奶牛畜牧場、生產牛奶的企業以及各級獸醫基層單位應用。
文檔編號C12Q1/04GK1888076SQ20051002723
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月29日 優先權日2005年6月29日
發明者李建林, 胡忠義 申請人:李建林, 胡忠義