專利名稱：用于分離純化的rna的試劑和方法
技術領域：
本發明是關于改善從生物學樣品中分離純化的RNA的組合物和方法。
背景技術：
純的完整RNA的分離為分子生物學、臨床和生物技術應用中分析基因表達的關鍵步驟。為實現上述目標，已經開發了多種RNA分離的方法。最經常使用的用于RNA分離的方法基于酚提取、從離液序列高的鹽溶液中沉淀以及二氧化硅吸附(Ausubel等人，2002)，參閱申請人的專利US4843155、US 5346994和US 5945515。在US 4843155中描述的方法通常被稱為單步(single-step)方法，用pH為4的酚-胍溶液(phenol-guanidinesolution)提取RNA。該方法的有效和簡便使單步方法成為最常用的分離RNA的方法。
在申請人的US 5346994中描述的單步方法的改良方法允許通過pH為4-6的酚-胍溶液的提取，從同一樣品中同時分離RNA、DNA和蛋白質。均質處理生物學樣品，并且所得勻漿用諸如氯仿或溴氯丙烷的疏水有機溶劑進行相分離。然后離心，所得混合物分為含有RNA的上層水相、相的界面和含有DNA和蛋白質的下層有機相。收集所述水相，用醇沉淀并洗滌RNA。
在US 4843155和US 5346994中描述的單步方法中，小心收集分層的水相對分離RNA的質量很關鍵。少量的相的界面和有機相容易和水相一起轉移，導致DNA和蛋白質污染分離的RNA。并且水相的收集要求手工處理，成為實現單步方法自動化的障礙。
US 4843155和US 5346994中描述的試劑和方法提供了基本純的、未降解的RNA。然而根據US 4843155和US 5346994分離的RNA含有殘留量(residual amount)的基因組DNA，可以通過反轉錄聚合酶鏈式反應測定法(reverse transcription-polymerase chain reaction assay，RT-PCR)檢測。因此根據US 4843155和US 5346994分離出的RNA還必須進一步純化使其不含DNA(Guan等人，2003；Girotti和Zingg，2003)。所述污染基因組DNA可以用作DNA聚合酶的母板(matrix)，產生另外的擴增產物并且擾亂RNA-依賴的反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。RT-PCR中的DNA污染只能通過使用一組含有基因組DNA中外顯子-內含子序列的引物而部分減輕，因為所述基因組DNA存在不含內顯子的假基因(pseudogene)，使所述方法不可靠(Mutimer，1998)。
單步方法的改良已經改善了分離RNA的質量。在一種改良方法中，通過加入氯化鋰的沉淀步驟移除RT-PCR抑制劑(Puissant，1990；Mathy，1996)。在另一改良方法中，在鹽存在下以醇沉淀RNA增加了分離RNA的純度(Chomczynski，1995)。然而，所述這些改良不能有效去除DNA污染。
去除污染DNA的共同慣例是用脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)處理含有RNA的樣品。在DNA酶處理后，所述含有RNA的樣品隨后用酚和氯仿萃取。在一種為了限制DNA污染的嘗試中，于單步方法中包括了附加的DNA沉淀步驟。通過添加三分之一體積的95％重量/重量乙醇，從水相中沉淀出所述污染的DNA(Siebert，1993)。乙醇的終濃度為約24％重量/重量。該文作者指出，在所述低的乙醇濃度下，DNA沉淀而RNA仍然存留在溶液中。RNA通過添加更多的乙醇從溶液中沉淀出來。然而，通過分析分離的RNA在瓊脂糖凝膠上用溴化乙錠染色的可見DNA帶以及RT-PCR證明，所述方法得到的RNA仍然受DNA污染。
在另一種為了減少DNA污染并改善單步方法中RNA的質量的嘗試中，Monstein(1995)在一種繁復的方法中，將酚提取的pH值提高到4.1-4.7，并用蛋白酶K處理樣品，然后再進行另一循環的酚提取、沉淀和醇洗滌。這一方法不僅耗時，而且仍然必需用DNA酶處理以得到備用于RT-PCR中的不含DNA的RNA。
從DNA中分離RNA也可以通過不加胍鹽(guanidine salt)的pH為4的酚提取實現(Kedzierski，1991)。然而，所述方法中不存在胍鹽使得RNA對RNA酶(ribonuclease，RNase)敏感，因此降解了所述RNA。所述方法較近的改進使用了存在十二烷基硫酸鈉的pH 4.2的酚提取緩沖液(Chattopadhyay等人，1993)。RNA分離方法中，使用單步方法然后硅柱(silica column)操作的結合也需要DNA酶處理(Bonham，1996)。所述雙重純化方法的應用減少了DNA污染，但是通過RT-PCR檢測所得分離的RNA仍然存在基因組DNA。用于分離RNA的另一方法使用了含有10％重量/重量至60％重量/重量的酚的單相水性溶液(US專利申請20030204077)。不含離液劑(chaotrope)時，15％重量/重量至55％重量/重量的一元醇(monoalcohol)、二元醇或者多元醇用于使酚保持在水性溶液中。
因此，通過US 4843155和US 5346994中描述的方法分離的RNA中存在DNA殘留量，必需通過引入DNA酶處理而擴展所述操作。這樣做由于操作的時間較長且在DNA處理過程以及附加的純化步驟中可能造成RNA不必要地降解，因此減少了所述方法的有用性。然而從RNA制品中去除殘留DNA為基于微陣列基因表達測定的RT-PCR所必需。
前述分離RNA的方法，如US 4843155和US 5346994中所述，基于在pH為4或者更高條件下進行的酚提取。以前單步方法的改良沒有嘗試通過進行pH低于4的酚提取改善RNA質量。相反，首次用在US 4843155中的pH為4，在接下來的US 5346994中增加到pH范圍4-6。類似地，Monstein(1995)所述的方法酚提取的pH值升高到4.7。另一改善所述單步方法的精心嘗試提高了胍-酚提取的pH至5.2(Suzuki，2003)。
US 5973137中公開了RNA分離的單步方法一種選擇，使用非離液序列高的(non-chaotropic)酸性鹽。然而，所述單步酚提取法仍是用于RNA分離的最經常使用的方法。描述單步方法的出版物(Chomczynski，1987)為American Chemical Society and Institute for Scientific Information數據庫中第四被引用最多的論文，以及近二十年中出版的被引用最多的論文(CAS 2003，American Chemical Society)。
因此需要提高分離RNA的純度的新方法。

發明內容
本發明公開了能從生物學樣品中分離基本不含DNA的RNA的試劑和方法，因此易于用于反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR)。所述RNA稱為基本純的RNA，為臨床、研究以及其他應用中的基因表達合適診斷所必需。
一種實施方式為使用酸性酚的相分離(phase separation)方法，RNA在水相中析出。該方式基于預料不到的發現——基本純的RNA可以通過酚提取在pH低于4下完成分離。
另一種實施方式為DNA和蛋白質的酸性酚沉淀，RNA存留在可溶性部分中。該方式基于預料不到的發現——特定濃度的酸性酚選擇性地沉淀DNA、蛋白質和其他細胞組分，使RNA保持可溶性形式。使用酸性酚用于選擇性沉淀DNA和蛋白質，消除了對相分離的需要，還避免了有毒相分離有機溶劑的使用。該方法大大簡化了RNA分離過程。
另一種實施方式為從含有酚、離液劑和少量有機溶劑的溶液中選擇性沉淀RNA。所述實施方式可以用于選擇性沉淀一直到大約200個核苷酸的RNA分子。較短的RNA分子(低分子量RNA)和/或DNA還可以被回收。DNA還可以通過升高有機溶劑的濃度至至少約50％重量/重量而從樣品中回收。
另一實施方式為通過調節溶液的pH值至最大值3.3從含有至少一種鹽的溶液中沉淀RNA。
通過本發明的組合物和方法分離的RNA因其高純度可以直接用于RT-PCR，也就是說，與原有的RNA分離方法相比，本發明的方法的RNA受DNA和/或蛋白質污染少。所述原有的方法例如在US 4843155、US5346994和US 5945515中公開的方法，每一專利在此整體并入作為參考。所述分離的RNA可以為單鏈(ssRNA)或雙鏈(dsRNA)，并且可以分離自各種生物來源，包括動物、植物、酵母、細菌以及病毒。本發明的方法和本發明組合物分離的RNA可以用于分子生物學、生物技術和臨床科學。此外，本發明的試劑可以單獨使用，或者與分離基本純的DNA(基本不含RNA和蛋白質的DNA)和基本純的蛋白質(基本不含RNA和DNA的蛋白質)的其他方法結合。
通過下列詳細描述和實施例明確本發明上述和其它的優點。
具體實施例方式
公開了從生物學樣品中制備純RNA的方法和組合物。生物學樣品為生物來源的任何樣品，無論體內、體外或者離體。樣品可以來源于人類、動物、植物、細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體等。純化的RNA為通過反轉錄聚合酶鏈式反應測定的基本未降解并且不含DNA污染的RNA。
相分離本發明的一種實施方式提供了通過在pH小于4完成含有RNA樣品的酚提取而提高分離的RNA的純度的方法和試劑。在一個實施方式中，pH的范圍從約3.9到約3.6。pH小于4的酚提取比pH為4或者更高的酚提取更有效地分離RNA和DNA。
用于本發明相分離方法的所述RNA分離試劑包括酚的水性溶液以及保持pH范圍在約3.6至4.0以下的緩沖劑。在一個實施方式中，pH范圍在3.7至3.9之間。在RNA分離試劑中酚的有效濃度范圍為從約10％重量/重量到約60％重量/重量。在一個實施方式中，所述酚的濃度范圍為從約25％重量/重量到約45％重量/重量。
所述組合物還可以包括其他組分例如RNA酶抑制劑、鹽、螯合劑、增溶劑、去污劑、離液劑以及酚的衍生物。
在一些實施方式中，例如培養細胞的樣品中具有低RNA酶活性的RNA，可以用pH約3.6至pH小于4的酸性酚提取，并且這樣可以保護RNA不受降解。然而酚可能不足以防止來自細胞RNA酶或者污染的實驗室器皿的RNA降解。因此，組合物中還可以包括至少一種有效量的RNA酶抑制劑。所述RNA酶抑制劑可以存在于樣品勻漿和/或酸性酚提取過程中。RNA酶抑制劑包括蛋白酶K、來自人胎盤的核糖核酸酶抑制劑、氧礬核糖核苷復合物，以及離液序列高的鹽(chaotropic salt)。離液序列高的鹽包括硫氰酸胍、鹽酸胍，以及它們的混合物。在一個實施方式中，離液序列高的鹽的有效濃度范圍為從約0.5M到約6M。在另一實施方式中，離液序列高的鹽的有效濃度范圍為從約2M到約4M。
所述緩沖劑為醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鹽(phthalate)、酒石酸鹽或乳酸鹽中的至少一種鹽。緩沖劑的濃度應當足以維持組合物的pH在約3.6至小于4.0。在一個實施方式中，所述pH的范圍為約3.75至約3.85。所述緩沖劑可以在樣品勻漿前或勻漿后，單獨或者與相分離試劑一起加入。一些具有高緩沖能力的例子例如血液以及植物組織，可以要求額外量的酸以將pH值調整到需要的范圍內。
本發明組合物還可以包括有機和無機鹽例如鈉、鉀、鋰和銨的氯化物、磷酸鹽、醋酸鹽和硫氰酸鹽。本發明組合物可以包括螯合劑例如檸檬酸鹽和乙二胺四乙酸鹽(ethylenediamine tetraacetate salt)。本發明組合物可以包括去污劑例如聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitan)、十二烷基硫酸鈉和肌氨酸。所述鹽、螯合劑和去污劑促進組織增溶作用和基本純RNA沉淀。為了幫助溶解酚，所述水性組合物還可以包括增溶劑或增溶劑的混合物。增溶劑包括多元醇例如濃度從約1％重量/重量到約10％重量/重量的丙三醇，選擇上限為了不增加分離的RNA中的DNA污染。增溶劑也可以包括胍鹽。
本發明組合物可以包括約60％重量/重量范圍內的酚，最多約5％重量/重量的比酚自身毒性低的酚衍生物。所述衍生物包括苯基乙醇、丙烯苯氧基醇(propylene phenoxytol)、百里酚或丁基酚(butylphenol)。在一個實施方式中，所述衍生物存在量范圍為1％重量/重量至約5％重量/重量。所述組合物還可以包括不溶或部分水溶性的有機化合物，例如，環己醇、環己基溴化物和二氯苯甲酸。所述化合物增加了組合物的密度并取代酚，因此最小化所述組合物的毒性。
在相分離方法的一個實施方式中，通常通過勻漿或溶胞(lysis)準備本發明組合物中的樣品。大量DNA和顆粒物質可以通過沉淀或過濾從勻漿或溶胞產物中除去。所述勻漿或溶胞產物通過與疏水有機溶劑或有機溶劑的混合物混合分成水相和有機相，所述有機溶劑例如氯仿、四氯化碳、溴萘、溴苯甲醚或溴氯丙烷。所述混合物可以通過離心沉淀，例如在約4℃到約10℃的溫度范圍內離心。上層水相含有RNA，并且相的界面和有機相含有DNA和蛋白質。
從水相中用例如低級醇的水溶性有機溶劑沉淀RNA。所沉淀的RNA通過沉降作用(sedimentation)或過濾洗滌并溶解在水、甲酰胺或緩沖液中。所述最終RNA制備物為基本純的，即未降解并且通過RT-PCR測試基本不含DNA污染。
另外，本發明相分離方法為適合用于RNA、DNA和蛋白質的同時分離的方法。如Chomczynski，1993或TRI Reagent brochure，2003中所述，分離到相的界面和有機相的所述DNA和蛋白質可以回收。可選地，通過加入0.3體積的乙醇DNA可以從有機相和相的界面中沉淀出來，然后通過用更高量的乙醇沉淀蛋白質。例如，DNA可以用pH 7.0或者更高的水性溶液從相的界面和有機相中在提取。在提取的DNA用乙醇從水性溶液中沉淀。可以理解，本發明組合物和方法可以用于從同一樣品中分離基本純的RNA、基本純的DNA(即，基本不含RNA的DNA)和蛋白質。全部三種組分的分離允許用于具有DNA序列變化的基因表達模式與生物學樣品中的蛋白質含量的相關性，還具有很多其他應用。
在一個實施方式中，用作樣品勻漿或溶胞的所述組合物可以不含一種或多種組分，在樣品勻漿或溶胞后，再單獨或與相分離有機溶劑(例如氯仿)一起加入到勻漿或溶胞產物中。在另一實施方式中，樣品勻漿或溶胞可以在高于pH 4.0下進行，在此情況下然后加入酸或者緩沖劑到勻漿或溶胞的樣品中，加入的量足以將勻漿或溶胞產物的pH控制在約3.6至低于4的范圍內。所述酸或緩沖劑的量可以直接加入勻漿或溶胞產物，或者可以溶解于相分離溶劑中。當與相分離溶劑一起加入時，所述酸可以為甲酸、乙酸、三氯乙酸、氨基己酸、乳酸或氯苯乙酸。為了提高酸的溶解性，所述相分離試劑可以包括諸如乙二醇的增溶劑。
在一個實施方式中，樣品的勻漿或溶胞在不含酚含有RNA酶抑制劑的溶液中進行。在勻漿或溶胞后，加入酚以達到終濃度范圍為10％重量/重量至60％重量/重量，并在從約3.6到低于4的pH下進行提取。通過作為水性溶液一部分的緩沖劑、或者加入酚中的緩沖劑、或者單獨加入的緩沖劑，維持所述提取過程中的pH范圍。相分離后通過離心從水相中用醇沉淀RNA。洗滌沉淀的RNA并可以將其在水、緩沖液或甲酰胺中溶解。
酸性酚沉淀DNA保留RNA在上清中本發明的一個實施方式用不產生相分離的酸性酚溶液分離基本純的RNA。一定濃度的酸性酚選擇性沉淀DNA(單鏈DNA(ss DNA)和雙鏈DNA(ds DNA))、蛋白質以及其它細胞組分，而RNA仍然保持溶解形式。利用這一預料不到的現象，設計無需分離水相和有機相以及相的界面的用于分離RNA的試劑和方法。
所述酸性酚沉淀方法簡化了RNA分離步驟。它也排除了在相分離方法中使用的毒性有機溶劑。所述組合物促使DNA和蛋白質在試管底部形成穩固的小球(pellet)，減少了向含有RNA的上清部分中意外轉移DNA和蛋白質分子的危險。所述上清能安全地通過移液、虹吸、傾析或過濾收集，其中每一種方式都可以在RNA分離的自動化操作中自動化應用。此外所述全部的酸性酚沉淀方法可以在室溫下進行，消除了對相分離方法中應用的冷凍離心機的需求。
用于酸性酚沉淀的組合物包括濃度范圍為從約3％重量/重量到低于30％重量/重量的酚的水性溶液。在一種實施方式中，所述酚濃度范圍為從約3％重量/重量到約25％重量/重量。在另一實施方式中，所屬酚濃度在約8％重量/重量到約20％重量/重量范圍內。所述酸沉淀實施方式中酚濃度低于US 4843155和US 5346994中所述的30％重量/重量的酚到60％重量/重量的酚濃度。
本發明組合物用緩沖劑或酸酸化，用量足以維持pH在約3.6至約5.5范圍內。在一個實施方式中，所述pH范圍從約3.9至約4.5。所述緩沖劑可以選自有機或無機緩沖劑，包括但不限于醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、酒石酸鹽和/或乳酸鹽。
為了提高RNA分離的效率，酸性酚可以補充RNA酶、鹽、螯合劑、酚增溶劑和/或去污劑。RNA酶抑制劑包括氧礬核糖核苷復合物和蛋白酶K，或者所述抑制劑的組合。RNA酶抑制劑還包括促溶劑和離液劑例如濃度范圍約0.5M到約6M的胍鹽。在另一實施方式中，所述離液劑的濃度為約1.5M至約2.5M。離液序列高的鹽能維持水性溶液中的酚用作為酚的增溶劑。所述酸性酚組合物還可以包括有機和/或無機鹽例如鈉、鉀、鋰和銨的氯化物、磷酸鹽、醋酸鹽和硫氰酸鹽。所述組合物還包括螯合劑例如檸檬酸鹽和乙二胺四乙酸鹽。所述組合物還含有去污劑包括例如聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitan)、十二烷基硫酸鈉和肌氨酸。所述組合物還含有最多約5％重量/重量的比酚毒性低的溶劑和試劑例如百里酚、苯基乙醇、環己醇、環己基溴化物和二氯苯甲酸。所述附加的組分促進組織增溶作用和純RNA沉淀。
所述酸性酚沉淀試劑可以含有附加的增溶劑或增溶劑的混合物以幫助份保持在水溶液中。酚增溶劑包括乙二醇、多元醇以及低級醇。所述增溶劑可以以從約1％重量/重量到約10％重量/重量的量加入到所述酸性酚沉淀試劑中，選擇上限為了不增加分離的RNA中的DNA污染。
在酸性酚沉淀方法的一個實施方式中，生物學樣品在沉淀試劑中勻漿或者溶胞。離心或過濾所得勻漿或溶胞產物以去除沉淀的DNA、蛋白質以及其它細胞組分。RNA保持可溶形式，隨后用諸如低級醇的水溶性有機溶劑從上清中沉淀出來。所述低級醇包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇。然后洗滌并可以在水、緩沖劑或甲酰胺中溶解所述RNA小球。
在酸性酚沉淀方法的另一實施方式中，生物學樣品在大約3倍(3X)至5倍(5X)濃縮的酸性酚沉淀試劑中勻漿。應用濃縮的試劑允許使用同一種試劑處理實體組織(solid tissue)以及大體積(high volume)的液體樣品。大體積的液體樣品可以通過加入向濃縮試劑少量水代償。所述濃縮的試劑溶解生物學樣品中的大多數組分，并且從細胞結構中有效釋放RNA。例如試樣可以在兩倍(2X)濃縮的試劑中勻漿。勻漿之后，等體積水與所得勻漿混合。水的加入使酚、胍以及其它組分在期望的濃度內。如此創造了從含有RNA的樣品中有效沉淀并去除DNA和蛋白質的條件。
離心或過濾所述勻漿或溶胞產物后，RNA保留在上清液或濾液中，而DNA、蛋白質以及其它細胞組分在試管底部形成了穩固的小球。如前面所述，RNA用水溶性有機溶劑從上清或濾液中沉淀出來。洗滌并可以在水、緩沖劑或甲酰胺中溶解所述RNA沉淀。
在本發明的一種實施方式中，在相分離方法或酸性酚沉淀方法中都可以使用單一試劑(single reagent)。所述雙重作用的試劑包括用在相分離方法中的試劑組分以及用在酸性酚沉淀方法中的2X濃度試劑。如前所述，用于相分離法的pH為約3.6至低于4.0，用于酸性酚沉淀法的pH為pH為約3.6至低于5.5。因此在雙重作用實施方式中，從一種方法到另一種方法的轉換前，試劑pH的調節很必要。例如用于酸性酚沉淀方法的2X試劑pH為4.2，在使用相分離方法前必須進一步酸化到pH低于4。
本發明相分離方法可以用于含有高量脂肪的樣本例如脂肪組織和特定腫瘤或瘤形成的組織。具有高水平污染物的樣品，例如植物以及含有脂肪的組織可以使用雙重作用步驟，其中包括酸性酚沉淀方法和相分離方法。在一個實施方式中，生物學樣品在2X酸性酚沉淀試劑中勻漿。然后用水稀釋所得勻漿達到酸性酚沉淀試劑的濃度范圍(即約3％重量/重量的酚至約30％重量/重量的酚)。稀釋之后，沉淀的DNA、蛋白質和其它細胞組分通過沉降作用或過濾除去。收集所得上清或濾液并與相分離溶劑混合。在一個實施方式中，每一體積上清加入0.05體積至0.1體積的相分離溶劑。所述相分離溶劑或溶劑的混合物為至少一種疏水溶劑，包括但不限于己內酯、乙二醇二乙酸酯、聚乙二醇二苯甲酸酯以及用于相分離方法的溶劑。離心所得混合物以得到上層水相、相的界面和有機相。收集含有RNA的所述水相并與一體積低級醇混合以沉淀RNA。洗滌并可以在水、緩沖液或甲酰胺中溶解所述沉淀的RNA。
所述基于本發明酸性酚溶液的提供純化的RNA的方法，可用于使用RT-PCR的基于微點陣測試基因表達，應用于生物化學、分子生物學和臨床應用。可以通過檢測癌細胞以及其它類型病理樣本中特異基因表達模式說明。
使用小體積有機溶劑的選擇性RNA沉淀作用如前所述，RNA可以從本發明相分離方法中的水相沉淀，并且可以從酸性酚組合物中沉淀。在每一種情況下，通過添加約一體積有機溶劑以達到約50％重量/重量的有機溶劑終濃度，沉淀RNA。然而在一些樣品制備中，一體積有機溶劑共沉淀例如蛋白聚糖的多糖和蛋白質以及RNA。以前，為了避免污染物的共沉淀，一種改良所述單步RNA純化方法的方法，通過在0.9M鈉離子存在下使用25％重量/重量的乙醇沉淀RNA(Chomczynski，1995)。另一方法用13％重量/重量至23％重量/重量的有機溶劑處理不含酚的離液劑溶液，使所述溶液pH保持在6至7.5范圍內沉淀RNA。
在本發明方法中，通過加入有機溶劑或溶劑的混合達到有機溶劑終濃度約10％重量/重量至約40％重量/重量，從酚-離液劑溶液中沉淀基本純的RNA。所述有機溶劑為丙酮、四甲烯砜(tetramethylene sulfone)、低級醇、乙二醇、多元醇、丙酮、乙二醇二乙酸酯和/或二甲亞砜。當或者從相分離方法的水相中或者從酸性酚沉淀方法中不含DNA且不含蛋白質上清中沉淀RNA時，所述方法提供了基本純的RNA。所述方法不要求向酚-離液劑溶液加入鹽。
出乎預料的是，不采用較早建議的(Chomczynski，1995)用鹽補入溶液，即可從約10％重量/重量至約40％重量/重量濃度的有機溶劑酚-離液劑溶液沉淀出基本純的RNA。事實上，與醇一起加入鹽降低了所述分離的RNA的純度。10％重量/重量至40％重量/重量的乙醇從酚-離液劑溶液中單獨沉淀RNA的結果也與報道相反，其中通過向酚-離液劑溶液加入0.3體積乙醇(終濃度24％重量/重量)使得DNA沉淀，而RNA保持可溶形式(Siebert，1993)。
在一個實施方式中，組合物中所述有機溶劑的終濃度為從約20％重量/重量至約25％重量/重量。在另一個實施方式中，所述組合物中有機溶劑的終濃度為從約10％重量/重量至約40％重量/重量。所述酚-離液劑溶液的pH范圍為從約2.0至約9.0。在一個實施方式中，所述酚-離液劑溶液的pH范圍為從約3.5至約5.0。
濃度10％重量/重量至40％重量/重量的有機溶劑沉淀被認為是較高分子量RNA的大于約200個堿基的RNA分子。低于200個堿基的RNA片段和多糖以及蛋白聚糖一起保留在溶液中。較高分子量RNA沉淀后，較小分子量RNA能通過沉淀從所述溶液中回收，通過使用額外量的有機溶劑達到約50％重量/重量或者更高例如約90％重量/重量的終濃度進行沉淀。
本發明的方法憑借用約10％重量/重量至約40％重量/重量的有機溶劑沉淀RNA，還能夠用于減少RNA制品中DNA污染的量。所述RNA的選擇性沉淀僅在所述溶液中存在小量污染的DNA時有效，例如每1微克RNA中少于10納克DNA。用約10％重量/重量至約40％重量/重量的有機溶劑沉淀RNA也提高了分離的RNA的質量，這樣得到高產率的基本純的并未降解的RNA，與申請人在先專利US 4843155和US 5346994中描述的方法一致。
從含鹽溶液中進行酸性RNA沉淀從含有鹽的水性溶液中，在pH低于約3.3，通過pH依賴沉淀RNA得到基本純的RNA連同DNA。從鹽溶液中在酸性pH下沉淀RNA與US5973137的報道相反。US 5973137公開在pH低于6的溶液中，非離液序列高的鹽沉淀DNA，而RNA停留為可溶形式。
在本發明方法中，向RNA溶液加入足以導致pH為3.3或者更低的量的緩沖酸。在一個實施方式中，所得pH在從約3.0到約2.7范圍內。所述酸可以為有機酸或無機酸。所述酸可以為鹽酸、磷酸、乙酸和/或乳酸。在一個實施方式中，組合物中的鹽為胍鹽。
所述實施方式可以并入本發明相的分離方法和/或本發明的酸性酚沉淀方法。為了用在酸性酚沉淀方法中，酸或緩沖劑可以溶解在水中或溶解在有機溶劑中。所述酸選擇性沉淀RNA，以可溶形式保留多糖和蛋白質。用于沉淀RNA的酸的量小，允許RNA分離過程中的低樣品量。在一個實施方式中，所述酸的量的范圍為RNA溶液的量的約0.1％重量/重量至25％重量/重量。
如本發明所述，用少量有機溶劑和酸性pH沉淀RNA，使用申請人的US 4843155和US 5346994中公開的方法還可以用于提高RNA的質量。
處理含有RNA的樣品，該樣品得自用少量有機溶劑沉淀的RNA或從含鹽的溶液中酸性沉淀的RNA，沉淀出較高分子量的RNA。較高分子量的RNA包括核糖體核糖核酸(ribosomal RNA，rRNA，例如18S和28S的RNA)以及信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)。所述保留的低分子量RNA少于約200個核苷酸，包括轉移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)、5S的RNA以及調控基因表達的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)。較低分子量RNA通過用附加量的有機溶劑處理，從上述描述的溶液中回收。在一個實施方式中，所述樣品用一體積例如甲醇、乙醇、丙醇等的低級醇處理沉淀低分子量RNA。
本發明典型的溶液和方法在下列工作實施例中描述。
實施例1從大鼠肝相分離分離RNA在一個實施方式中，下列組合物用于相分離RNA4M硫氰酸胍、0.2M硫氰酸銨、5％重量/重量丙三醇、40％重量/重量苯酚、0.1％重量/重量肌氨酸、10mM檸檬酸鈉以及0.1M乙酸鈉的緩沖液，pH為3.8。
大鼠肝(38毫克)在1.5毫升上述組合物中勻漿。然后，向勻漿中加入0.15毫升溴氯丙烷。振蕩所得混合物，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分鐘。沉降后，形成水相、相的界面和下層的有機相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白質分布到相的界面和有機相中。
通過加入0.75毫升異丙醇從水相中沉淀出RNA。所述RNA沉淀在10000重力加速度下離心5分鐘。所得小球用0.75毫升的75％重量/重量的乙醇洗滌并在10000重力加速度下離心5分鐘。最終RNA小球溶解在水中，并且通過本領域技術人員公知的方法——用分光光度計測量在260/280納米下吸光度(A260/280)檢測所述RNA的濃度。
所述RNA的產量為0.22毫克。所述在260/280納米下吸光度(A260/280)的比值為1.76，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、肌動蛋白和c-fos基因的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR。用Invitrogen(Carlsbad CA)的SuperScript轉錄酶進行反轉錄，用Sigma(St.Louis MO)的Taq DNA聚合酶進行PCR。在1％瓊脂糖-溴化乙錠凝膠上分析RT-PCR產物。在沒有反轉錄作用時，分離的RNA中沒有檢測到DNA。用1％甲醛-瓊脂糖凝膠并轉移到尼龍膜上對分離的RNA進行Northern印跡分析。溴化乙錠和亞甲藍染色顯示了未降解的核糖體帶(ribosomal band)。與生物素標記的探針雜交，顯示了未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶、肌動蛋白和c-fos的mRNA帶。
實施例2從人血液中相分離的RNA分離人血液(0.5毫升)與75微升的冰乙酸(glacial acetic acid)和5毫升的如實施例1所述的組合物混合。然后，向所得混合物中加入0.5毫升溴氯丙烷。振蕩所得混合物，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分鐘。沉降后，所述混合物形成水相、相的界面和下層的有機相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白質分布到相的界面和有機相中。
通過加入1.25毫升異丙醇從水相中沉淀出RNA。所述RNA沉淀在12000重力加速度下離心5分鐘。所得小球用5毫升的75％重量/重量的乙醇洗滌并在10000重力加速度下離心5分鐘。最終RNA小球溶解在水中，并且通過本領域技術人員公知的方法——用分光光度計測量A260/280檢測所述RNA的濃度。
所述RNA的產量為18.9微克。所述A260/280的比值為1.70，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR。在沒有反轉錄作用時，分離的RNA通過PCR沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
實施例3通過相分離和酸化的溴氯丙烷分離RNA
大鼠脾(21毫克)在1毫升含有3.5M硫氰酸胍、50mM乙酸鉀、43％重量/重量苯酚、0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)pH為4.1的水溶液中勻漿。所述勻漿以12000重力加速度(g)離心10分鐘以去除大量DNA和微粒。所得澄清的勻漿與0.1毫升含有14％重量/重量乙酸的溴氯丙烷混合。所得混合物的pH為3.7。振蕩所得混合物，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分鐘。沉降后，所述混合物形成水相、相的界面和下層的有機相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白質分布到相的界面和有機相中。
通過加入0.5毫升乙醇從水相中選擇性沉淀出RNA。所得沉淀的RNA在10000重力加速度下沉降5分鐘，然后用75％重量/重量的乙醇洗滌并在10000重力加速度下沉降5分鐘。最終RNA小球溶解在水中，并且通過本領域技術人員公知的方法——用分光光度計測量在260/280納米下吸光度(A260/280)檢測所述RNA的濃度。
所述RNA的產量為77微升。所述A260/280的比值為1.74，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR，并且沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
實施例4通過相分離和在不含酚的離液劑溶液中勻漿分離RNA大鼠骨骼肌(29毫克)在0.5毫升的3M硫酸氰胍和5mM乙酸鹽的水性溶液中勻漿。所得勻漿與0.5毫升苯酚和0.1M乙酸鈉緩沖液混合，pH為3.7。所得混合物與0.1毫升的溴氯丙烷振蕩，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分鐘。沉降后，所述混合物形成水相、相的界面和下層的有機相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白質分布到相的界面和有機相中。
通過加入0.5毫升含有50％重量/重量乙醇的水性溶液從水相中選擇性沉淀出RNA。按實施例1中的描述洗滌、處理并檢測所述RNA沉淀。
所述RNA的產量為16微克。所述A260/280的比值為1.70，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR，并且沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
實施例5通過相分離和在1％重量/重量的十二烷基硫酸鈉中勻漿分離RNA在25平方厘米的塑料瓶中長滿的人類成纖維細胞(Clonetics，SanDiego CA)的原代培養，用1.5毫升含有1％重量/重量的十二烷基硫酸鈉以及10mM檸檬酸鈉、pH為7.0的溶液覆蓋，補充50微克/毫升的蛋白酶K。所得細胞溶液在室溫(約20℃)下孵育一小時，轉移到離心管中，與1.5毫升的含有12％重量/重量水的酸性酚以及100mM乙酸鈉混合，pH為3.7。在4℃下離心15分鐘后，所述混合物形成水相、相的界面以及有機相。相分離后，RNA分布到水相中，而DNA和蛋白質分別分布到相的界面和有機相中。
通過加入0.75毫升乙醇從水相中沉淀出RNA，并在10000重力加速度下沉降5分鐘。所得RNA小球用75％的乙醇洗滌，在10000重力加速度下離心5分鐘，并溶解在水中。
所述RNA的產量為18微克。所述A260/280的比值為1.71，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR，并且沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
實施例6通過酸性酚沉淀分離RNA
在一個實施方式中，下列組合物用于酸性酚沉淀RNA20％重量/重量苯酚、2M硫氰酸胍、15mM檸檬酸鈉、0.1M氯化鋰、0.05％重量/重量肌氨酸、1.5％重量/重量丙三醇以及醋酸鈉緩沖液，pH為4.2。大鼠肝(52毫克)在1毫升上述組合物中勻漿。所述勻漿于室溫(約20℃)下在10000重力加速度下離心5分鐘以去除沉淀的DNA、蛋白質和細胞組分。
所得上清液轉移至以干凈試管中，與1毫升乙醇混合以沉淀RNA。沉淀的RNA在10000重力加速度下離心5分鐘，用75％重量/重量的乙醇洗滌并溶解在水中。
所述RNA的產量為187微克。所述A260/280的比值為1.74，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR，并且沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
實施例7使用兩倍濃度的試劑通過酸性酚沉淀分離RNA大鼠肝(47毫克)在1毫升濃度為實施例6所指出濃度2倍的實施例6所述試劑中勻漿。所述濃縮的試劑包括添加的1％重量/重量苯基乙醇。所得勻漿與1毫升水混合形成沉淀試劑。
所述沉淀的DNA、蛋白質和其它細胞組分通過在于室溫(約20℃)下在10000重力加速度下離心5分鐘沉降。所得上清轉移至潔凈試管，與1毫升乙醇混合沉淀RNA。沉淀的RNA在10000重力加速度下沉降5分鐘，用75％重量/重量的乙醇洗滌，并溶解在水中。
所述RNA的產量為178微克。所述A260/280的比值為1.77，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR，并且沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
實施例8通過本發明的兩步程序分離RNA大鼠腦(61毫克)在1毫升實施例7中所述的2倍濃縮試劑中勻漿。所得勻漿與1毫升水和混合，并將所得混合物于室溫(約20℃)下在10000重力加速度下離心5分鐘去除沉淀的DNA、蛋白質和細胞組分。所得上清轉移到清潔試管，并與0.05毫升溴氯丙烷混合。離心所述混合物，分成上層水相、相的界面和有機相。
所述含有RNA的水相轉移到新的試管，用異丙醇中的5M乳酸酸化到pH為2.9。所述RNA沉淀在10000重力加速度下沉降5分鐘，用75％重量/重量的乙醇洗滌，并溶解在水中。
所述RNA的產量為33微克。所述A260/280的比值為1.77，說明沒有蛋白質的污染。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶的引物，成功地將所述分離的RNA應用于RT-PCR，并且沒有檢測到DNA污染。對分離的RNA進行Northern印跡分析顯示了未降解的核糖體RNA帶以及未降解的3-磷酸甘油醛脫氫酶的mRNA帶。
根據上述說明書和實施例，本發明的其它變化或實施方式對本領域普通技術人員而言也是很明顯的。因此，上述實施方式不能被理解為是對本發明范圍的限制。
權利要求
1.一種用于分離純化的RNA的含酚組合物，該組合物包括終濃度范圍從約3％重量/重量至約98％重量/重量的酚以及足以維持最終組合物的pH范圍在3.6至低于4.0的緩沖劑。
2.一種用于分離純化的RNA的含酚組合物，該組合物包括終濃度范圍從3％重量/重量至小于30％重量/重量的酚以及足以維持最終組合物的pH范圍在3.9至5.5的緩沖劑。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中，所述緩沖劑選自醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽或它們的混合物中的至少一種。
4.根據權利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物還包括至少一種核糖核酸酶抑制劑。
5.根據權利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物還包括酚的衍生物，所述酚的衍生物選自苯基乙醇、丙烯苯氧基醇、百里酚、丁基酚或它們的混合物中的至少一種，所述酚的衍生物終濃度上限為5％重量/重量。
6.根據權利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物還包括酚的增溶劑，所述酚的增溶劑選自多元醇、一元醇和胍鹽中的至少一種。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中，所述組合物還包括濃度范圍從1％重量/重量至5％重量/重量的至少一種有機化合物，其足以增加所述組合物的密度。
8.一種用于分離純化的RNA的不含酚的水性組合物，所述不含酚的水性組合物包括至少一種核糖核酸酶抑制劑以及選自醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽或它們的混合物中的至少一種緩沖劑，所述緩沖劑足以維持最終組合物的pH范圍在3.6至低于4.0。
9.權利要求1、2或8的任意一項所述的組合物，還包括去污劑。
10.權利要求1、2或8的任意一項所述的組合物，還包括無機鹽或有機鹽以及螯合劑。
11.一種用于通過相分離分離純化的RNA的不含酚的相分離組合物，所述組合物包括至少一種終濃度范圍為10％重量/重量至40％重量/重量的疏水有機溶劑，以及在相分離過程中足以維持pH范圍為3.6至低于4.0的至少一種酸，以及任選的酸的增溶劑。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中，所述有機溶劑為氯仿、四氯化碳、溴氯丙烷、溴萘或溴苯甲醚中的至少一種。
13.根據權利要求11所述的組合物，其中，所述酸為甲酸、乙酸、三氯乙酸、氨基己酸、乳酸或氯苯乙酸中的至少一種。
14.一種從生物學樣品中分離純化的RNA的方法，該方法包括a)用包括終濃度范圍從10％重量/重量至60％重量/重量的酚以及至少一種核糖核酸酶抑制劑的試劑處理樣品，b)將樣品與至少一種疏水溶劑混合，維持pH范圍為從3.6至低于4.0，c)向水相中加入約等體積水溶性有機溶劑以沉淀純化的RNA，從水相回收純化的RNA，以及d)洗滌并溶解所述沉淀的RNA。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括選自醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽或它們的混合物中的至少一種緩沖劑。
16.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括至少一種核糖核酸酶抑制劑。
17.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括去污劑。
18.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括無機鹽或有機鹽以及螯合劑。
19.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括酚的衍生物，所述酚的衍生物選自苯基乙醇、丙烯苯氧基醇、百里酚、丁基酚或它們的混合物中的至少一種，所述酚的衍生物終濃度上限為5％重量/重量。
20.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括酚的增溶劑，所述酚的增溶劑選自多元醇、一元醇和胍鹽中的至少一種。
21.根據權利要求14所述的方法，其中，(a)中所述試劑還包括濃度范圍從1％重量/重量至5％重量/重量的至少一種有機化合物，其足以增加所述組合物的密度。
22.根據權利要求14所述的方法，其中，在步驟(a)前，所述樣品首先用權利要求8或11所述的不含酚的組合物進行處理。
23.根據權利要求14或20的方法，其中，(a)中所述試劑是緩沖的，以維持pH范圍為從3.6至低于4.0。
24.根據權利要求14或22的方法，其中，所述步驟(a)在從3.9至9.0的pH范圍進行，并且然后將所述樣品pH范圍調節為3.6至低于4.0。
25.一種從生物學樣品中分離純化的RNA的方法，該方法包括步驟a)用試劑處理樣品，所述試劑包括終濃度范圍從3％重量/重量至低于30％重量/重量的酚以及足以維持所述組合物的pH范圍在3.6至5.5的緩沖劑，b)沉降或過濾所述樣品以得到基本不含DNA、蛋白質以及細胞組分的純化樣品，向所述純化樣品加入等體積水溶性有機溶劑以沉淀純化的RNA，d)沉降或過濾所述沉淀的RNA，以及e)洗滌并溶解所述沉淀的RNA。
26.一種從生物學樣品中分離純化的RNA的兩步方法，該方法包括a)用試劑處理樣品，所述試劑包括終濃度范圍從3％重量/重量至低于30％重量/重量的酚、至少一種離液劑、以及足以維持所述組合物的pH范圍在3.6至5.5的緩沖劑，b)沉降或過濾所述樣品以得到基本不含DNA、蛋白質以及細胞組分的純化樣品，c)向所述純化樣品加入至少一種疏水有機溶劑，以及濃度足以維持所述純化樣品的pH范圍為3.6至低于4.0的緩沖劑，d)向水相中加入等體積水溶性有機溶劑以沉淀純化的RNA，從水相回收純化的RNA，e)沉降或過濾所述沉淀的RNA，以及f)洗滌并溶解所述沉淀的RNA。
27.根據權利要求26的方法，其中，所述疏水有機溶劑的密度足以在相分離過程中分離有機相。
28.根據權利要求25或26所述的方法，其中，所述疏水有機溶劑選自己內酯、乙二醇二乙酸酯、聚乙二醇二苯甲酸酯、氯仿、四氯化碳、溴氯丙烷、溴萘、溴苯甲醚或它們的混合物中的至少一種。
29.根據權利要求25或26所述的方法，其中，所述樣品用(a)中的組合物的1.5倍至2.5倍濃縮物處理，并且稀釋所得樣品以得到非濃縮溶液。
30.根據權利要求14、22、25或26中任意一項所述的方法，其中，所述所加入的用于沉淀RNA的有機溶劑為低級醇、多元醇、丙酮、乙二醇二乙酸酯、二甲亞砜或它們的混合物中的至少一種。
31.一種從含有RNA和鹽的溶液中分離純化的RNA的方法，該方法包括用緩沖劑調節所述溶液的pH，所述緩沖劑的量足以導致最大為3.3的pH，然后沉淀純化的RNA。
32.根據權利要求31的方法，其中，所述pH范圍為3.0至2.7。
33.根據權利要求31的方法，其中，所述緩沖劑為有機酸或無機酸中的至少一種。
34.根據權利要求31的方法，其中，所述鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽和胍鹽組成的組中。
35.根據權利要求31的方法，其中，所述溶液含有濃度從1％重量/重量至60％重量/重量的酚。
36.一種從生物學樣品中選擇性沉淀較高分子量RNA的方法，該方法包括用水性組合物處理樣品以從所述樣品中選擇性沉淀較高分子量的RNA，所述水性組合物包括終濃度范圍從1％重量/重量至60％重量/重量的酚、至少一種離液劑、濃度足以維持所述組合物的pH范圍在2.0至9.0的緩沖劑、濃度范圍從10％重量/重量至40％重量/重量的至少一種水溶性有機溶劑，并從所述樣品中沉淀純化的較高分子量的RNA。
37.權利要求36所述的方法，還包括隨后加入附加的有機溶劑以沉淀較低分子量RNA的步驟，所述附加的有機溶劑足以使有機溶劑的濃度增加至至少50％重量/重量，以及從所述樣品中沉淀純化的較低分子量RNA的步驟。
38.權利要求36所述的方法，包括根據權利要求14、22、25或26中任意一項準備生物學樣品以獲得RNA的水性溶液，并從該水性溶液中沉淀RNA。
全文摘要
本發明提供了分離基本上不含DNA、稱為純RNA的完整RNA的組合物和方法。可以分離任何來源(例如，人類、其他動物、植物、病毒等)的RNA。在一個實施方式中，樣品用pH值小于4的酚處理，并從水相中回收純RNA。在另一實施方式中，從含有少量有機溶劑的酸化樣品中沉淀RNA。公開了其他實施方式。通過調節pH，同樣的本發明的組合物可以用于多種實施方式。通過本發明的方法得到的純RNA可以用于不希望DNA污染的試驗，例如，聚合酶鏈式反應。
文檔編號C12N15/10GK1997740SQ200580017853
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月14日 優先權日2004年4月16日
發明者彼得·科姆欽斯基 申請人:彼得·科姆欽斯基