一種快速蛋白純化組合層析柱、試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發明提供一種快速蛋白純化組合層析柱、試劑盒及制備方法，層析柱包括柱體、離子交換樹脂層、三片濾片、凝膠過濾樹脂層、流出口，三片濾片分別設置于柱體內部底面、離子交換樹脂層床面上和凝膠過濾樹脂層床面上，濾片形狀大小與柱體截面相同，孔徑大于被分離蛋白，小于離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂，流出口設置在柱體底部。本發明的一種快速蛋白純化組合層析柱，用該層析柱進行蛋白分離與純化，操作方便、快速，可大大節省時間，提高工作效率。
【專利說明】一種快速蛋白純化組合層析柱、試劑盒及制備方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白分離純化【技術領域】，具體是涉及一種快速蛋白純化組合層析柱、試劑盒及制備方法。

【背景技術】
[0002]蛋白質分離純化是用生物工程下游技術從混合物之中分離純化出所需要的目標蛋白質的方法，是生物【技術領域】的一個重要技術。該技術難度、成本均高，例如一個生物藥品成本的75%都花在了下游蛋白質分離純化當中。蛋白質分離純化技術主要有沉淀、透析、層析等，其中層析技術中的常用技術有離子交換層析和分子篩(凝膠過濾)。
[0003]離子交換層析(1n Exchange Chromatography, IEC)是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組份離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年,Thompson等人在研究土壤堿性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前，離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。根據離子交換樹脂的性能，分為陽離子交換樹脂與陰離子交換樹脂。若被分離物質為帶正電荷的堿性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故采用陽離子交換劑，而酸性物質，在堿性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH值范圍內帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換樹脂的優點主要是處理能力大，分離范圍廣，分離容量高，能除去各種不同的離子，可以反復再生使用，工作壽命長，運行費用較低(雖然一次投入費用較大)。
[0004]凝膠過濾是利用凝膠(如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)的多孔性，根據被分離物質的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。凝膠過濾的優點主要有分離條件溫和，蛋白質不易變性，收率高，重現性好，工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大等。
[0005]由于離子交換樹脂與凝膠過濾樹脂的分離原理上不同，兩種層析交替地使用可以用來分離、純化高純度蛋白。然而，這樣的蛋白分離純化過程是一個非常繁瑣的過程。通常蛋白粗提液先被添加到離子交換樹脂層析柱后，經過洗柱、梯度洗脫、收集不同時間流出的組分，使蛋白粗提液被分離成多個組分，每個組分還需經過其他方法(如SDS-PAGE凝膠電泳)進一步分析找出含目標蛋白組分，然后將含目標蛋白組分添加到凝膠過濾樹脂層析柱上進一步分離，收集不同時間流出的組分，再經過其他方法(如SDS-PAGE凝膠電泳)分析找出含相對高純度目標蛋白的組分。這樣的蛋白分離純化過程不僅需要多個層析柱，還需要設計復雜的緩沖液體系，沒有專業培訓，無法從事該類工作。因此，有必要開發一種簡單的快速蛋白分離純化層析柱。


【發明內容】

[0006]本發明要解決的問題是提供一種聯合使用離子交換樹脂與凝膠過濾樹脂的層析柱，用該層析柱進行蛋白分離與純化，操作方便、快速，可大大節省時間，提高工作效率。
[0007]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:一種快速蛋白純化組合層析柱，包括柱體、離子交換樹脂層、三片濾片、凝膠過濾樹脂層、流出口，所述三片濾片分別設置于柱體內部底面、離子交換樹脂層床面上和凝膠過濾樹脂層床面上，濾片形狀大小與柱體截面相同，孔徑大于被分離蛋白，小于離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂，流出口設置在柱體底部。
[0008]層析柱的柱體為塑料柱、玻璃柱或金屬柱，柱體形狀為圓柱形、方柱形或橢圓柱形，濾片為塑料濾片或紙濾片。
[0009]進一步的，所述離子交換樹脂層的填充高度是柱體內徑的0.3-3倍，所述凝膠過濾樹脂層的填充高度是所述離子交換樹脂層填充高度的2倍以上。
[0010]進一步的，所述凝膠過濾樹脂層的填充高度是所述離子交換樹脂填充高度的5-20倍之間。
[0011]一種制備上述快速蛋白純化組合層析柱的方法，包括如下步驟:
[0012](I)選取層析柱空柱體，清潔后在柱體底部放入一片濾片；
[0013](2)取活化的凝膠過濾樹脂或離子交換樹脂，用水溶脹充分后，取少量裝入柱體，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，如加入凝膠過濾樹脂時，床面達到柱體內徑的
0.6倍以上后，在床面上輕輕壓入一片濾片，如加入離子交換樹脂時，床面達到柱體內徑的
0.3-3倍后，在床面上輕輕壓入一片濾片；
[0014](3)取活化的凝膠過濾樹脂或離子交換樹脂，且與步驟(2)的樹脂不相同，用水溶脹充分后，取少量添加在步驟(2)樹脂層床面上的濾片上方，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，如加入凝膠過濾樹脂時，床面達到步驟(2)加入的離子交換樹脂床面高度的2倍以上后，在床面上輕輕壓入一片濾片，如加入離子交換樹脂時，當床面高度與步驟(2)加入的凝膠過濾樹脂層床面高度的比值大于0，小于等于0.5后，在床面上輕輕壓入一片濾片;
[0015](4)用50ml的30%乙醇水溶液，逐量添加于層析柱上，開放層析柱下方出口，反復添加至全部30%乙醇水溶液加入后，分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及層析柱上面柱口，置于冰箱4-8 °C冷藏備用。
[0016]一種含有上述快速蛋白純化組合層析柱的一步法白介素純化試劑盒，還包括緩沖液。
[0017]進一步的，所述緩沖液包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液和TriS-HCl緩沖液中的一種或兩種。
[0018]一種一步法白介素純化試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
[0019](I)取緩沖液用去離子水稀釋成IX緩沖液；
[0020](2)取5倍于快速蛋白純化組合層析柱中離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂總體積量的IX緩沖液，逐量從柱上方添加于快速蛋白純化組合層析柱，使其通過層析柱，以平衡柱內樹脂緩沖體系；
[0021](3)將待分離的蛋白粗提液用該IX緩沖液透析過夜，或在待分離的蛋白粗提液中添加適量的濃縮緩沖液，使緩沖液的終濃度為IX，檢測稀釋后的蛋白粗提液pH值是否與原緩沖液的PH值相同，調節其pH值至與原緩沖液pH值相同；
[0022](4)取凝膠過濾樹脂體積的1/10-1/20經步驟(3)處理的蛋白粗提液，加在經步驟(2)處理的快速蛋白純化組合層析柱的上層樹脂上，靠自重或壓力差讓蛋白粗提液流入樹脂中，然后取3-5倍于快速蛋白純化組合層析柱中樹脂總體積量的IX緩沖液，讓其自上而下通過層析柱，使目標蛋白被分離后流出，用紫外檢測儀在280nm波長處檢測流出峰，或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪制洗脫曲線；
[0023](5)從檢測到蛋白流出組分開始分量收集流出液組分，檢測各流出液組分中目標蛋白純度和含量，保存含有目標蛋白的流出液組分。
[0024]本發明具有的優點和積極效果是:
[0025]1、本發明采用將離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂分層放入同一層析柱中，中間用濾片隔開，一次上柱即可同時進行離子交換層析與凝膠過濾層析，無需復雜的洗滌和梯度洗脫等程序，無需使用多個層析柱，操作便捷，普通實驗人員在簡單培訓后即可熟練操作，節約時間，節省試劑耗材；
[0026]2、全部純化過程只需要一種緩沖液，無需設計多種梯度鹽度緩沖液及不同pH值的緩沖液，使操作簡單、方便，提高工作效率；
[0027]3、本發明的包含快速蛋白純化組合層析柱的白介素純化試劑盒，一步法快速分離純化白介素蛋白，獲得高純度的目標蛋白，使用方便，試劑成本低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是本發明的1-型快速蛋白純化組合層析柱。
[0029]圖2是本發明的I1-型快速蛋白純化組合層析柱。
[0030]圖3是本發明SDS-PAGE電泳檢測各組分中目標蛋白IL_4純度。
[0031]圖4是本發明SDS-PAGE電泳檢測各組分中目標蛋白IL_7純度。
[0032]圖1和圖2中:1.柱體，2.離子交換樹脂層，3.濾片，4.凝膠過濾樹脂層，5.流出□。

【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但不限定本發明的保護范圍。
[0034]實施例1
[0035]如圖1所示，一種快速蛋白純化組合層析柱(1-型)，在直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱柱體I內自下而上分別是塑料濾片3、S印hadex G_50凝膠過濾樹脂層4、塑料濾片3、DEAE陰離子交換樹脂層2、塑料濾片3，塑料濾片3的形狀大小與柱體I截面相同，孔徑大于被分離蛋白，小于DEAE陰離子交換樹脂和Sephadex G_50凝膠過濾樹脂。
[0036]一種制備快速蛋白純化組合層析柱(1-型)的方法，包括如下步驟:
[0037](I)選取一直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱空柱體1，清潔后在柱體I底部放入一片與柱體I內徑等同的塑料濾片3 ；
[0038](2)取1g活化的Sephadex G-50凝膠過濾樹脂，用水溶脹充分后，取少量裝入柱體1，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，直至沉降后凝膠過濾樹脂層4的床高達200mm,剩余Sephadex G-50凝膠過濾樹脂不再裝入,在此床面上輕輕壓入一片與柱體I內徑等同的塑料濾片3 ；
[0039](3)取2g活化的DEAE陰離子交換樹脂，用水溶脹充分后，取少量添加在凝膠過濾樹脂層4床面上的濾片3上方，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，直至沉降后樹脂層的床高達30mm，剩余DEAE陰離子交換樹脂不再裝入，在此床面上再輕輕壓入一片與柱體I內徑等同的塑料濾片3;
[0040](4)層析柱制備完畢，如果立即使用，可用緩沖液平衡柱子后使用；如果不立即使用，可用30 %乙醇水溶液平衡柱子后分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及層析柱上面柱口，置于冰箱4-8 °C冷藏備用。
[0041]實施例2
[0042]如圖2所示，一種快速蛋白純化組合層析柱(I1-型)，在直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱柱體I內自下而上分別是塑料濾片3、DEAE陰離子交換樹脂層2、塑料濾片3、Sephadex G_50凝膠過濾樹脂層4、塑料濾片3，塑料濾片3的形狀大小與柱體I截面相同，孔徑大于被分離蛋白，小于DEAE陰離子交換樹脂2和Sephadex G-50凝膠過濾樹脂4。
[0043]一種制備快速蛋白純化組合層析柱(I1-型)的方法，包括如下步驟:
[0044](I)選取一直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱空柱體1，清潔后在柱底放入一片與柱體I內徑等同的塑料濾片3 ；
[0045](2)取2g活化的DEAE陰離子交換樹脂，用水溶脹充分后，取少量裝入柱體1，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，直至沉降后DEAE陰離子交換樹脂層2的床高達25mm，剩余DEAE陰離子交換樹脂不再裝入，在此床面上再輕輕壓入一片與柱體I內徑等同塑料濾片3 ；
[0046](3)取1g活化的Sephadex G-50凝膠過濾樹脂，用水溶脹充分后，取少量添加在DEAE陰離子交換樹脂床面上的濾片3上方，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，自至沉降后凝膠過濾樹脂層4的床高達200mm，剩余S印hadex G-50凝膠過濾樹脂不再裝入，在此床面上輕輕壓入一片與柱體I內徑等同的塑料濾片3 ；
[0047](4)層析柱制備完畢，如果立即使用，可用緩沖液平衡柱子后使用；如果不立即使用，可用30%乙醇水溶液平衡柱子后，分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及層析柱上面柱口，置于冰箱4-8 V冷藏備用。
[0048]實施例3
[0049]一種含有快速蛋白純化組合層析柱的一步法白介素純化試劑盒，包括一個1-型快速蛋白純化組合層析柱、一瓶20X甘氨酸-氫氧化鈉濃縮緩沖液。
[0050]一種一步法白介素純化試劑盒的制備方法，包括如下步驟:
[0051](I)選取一直徑1mm,長350mm的圓形塑料層析柱空柱體1，清潔后在柱底放入一片與柱體I內徑等同塑料濾片3 ；
[0052](2)取1g活化的Sephadex G-50凝膠過濾樹脂4,用水溶脹充分后,裝入柱體I,靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，直至沉降后凝膠過濾樹脂層4的床高達250_，剩余S印hadex G-50凝膠過濾樹脂不再裝入，在此床面上輕輕壓入一片與柱體I內徑等同塑料濾片3 ；
[0053](3)取Ig活化的CM弱陽離子交換樹脂，用水溶脹充分后，取少量添加在凝膠過濾樹脂層4床面上的濾片3上方，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，直至沉降后CM弱陽離子交換樹脂層2的床高達20mm，剩余弱陽離子交換樹脂不再裝入，在此床面上再輕輕壓入一片與柱體I內徑等同塑料濾片3。
[0054](4)配置50ml30%乙醇水溶液，將其逐量添加于上述所制備的層析柱上，開放層析柱下方出口，反復添加至全部30%乙醇水溶液加入后，分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及析柱上面柱口，置于冰箱4-8°C冷藏備用。
[0055](5)配制20X濃縮的pH = 10的500mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，包括如下步驟:
[0056]I)稱取甘氨酸(分子量:70.07)35g，加去離子水至1L，攪勻使充分溶解便得500mM甘氨酸溶液，稱取氫氧化鈉(分子量:40)20g，加去離子水至1L，攪勻使充分溶解便得
0.5N氫氧化鈉溶液；
[0057]2)取500mM甘氨酸溶液500ml，取0.5N氫氧化鈉溶液320ml，在攪拌并測定pH值情況下向500mM甘氨酸溶液中逐步加入0.5N氫氧化鈉溶液直至pH = 10為止，便得20X濃縮的pH = 10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，裝入塑料瓶中，置于冰箱4-8°C冷藏備用。
[0058](6)取上述制備的1-型快速蛋白純化組合層析柱一個和一瓶500ml的20X甘氨酸-氫氧化鈉濃縮緩沖液，合裝在一個紙盒子里，得到一步法白介素純化試劑盒。
[0059]實施例4
[0060]一步法白介素純化試劑盒純化重組人白介素-4(rhIL_4，分子量14.8KD，等電點9.3)的使用方法，包括如下步驟:
[0061](I)取一步法白介素純化試劑盒一套，包含一個1-型快速蛋白純化組合層析柱和一瓶20X濃縮甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；
[0062](2)從試劑盒中取20X濃縮緩沖液50ml，用去離子水稀釋成IX緩沖液100ml ；
[0063](3)從試劑盒中取出1-型快速蛋白純化組合層析柱，打開層析柱上面和下面蓋子，取IX緩沖液100ml，逐量從柱上方添加于快速蛋白純化組合層析柱，使其通過層析柱，以洗滌并平衡柱內樹脂緩沖體系；
[0064](4)將含rhIL-4的大腸桿菌表達的粗提液2ml用500ml的IX緩沖液透析過夜；
[0065](5)將透析過的蛋白粗提液，加在平衡過的1-型快速蛋白純化組合層析柱的上層樹脂上，靠自重讓蛋白粗提液流入樹脂中，然后取50ml的IX緩沖液，逐量加入層析柱，使目標蛋白被分離后流出，用紫外檢測儀在280nm波長處檢測流出峰，或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪制洗脫曲線；
[0066](6)從檢測到蛋白流出組分開始按每Iml分量收集流出液組分，用SDS-PAGE電泳檢測各組分中目標蛋白純度和含量；
[0067](7)根據SDS-PAGE電泳圖分析，如圖3所示，流出液組分3、4(即第4、5泳道)具有純度最聞的目標蛋白IL-4,保存該組分。
[0068]實施例5
[0069]一步法白介素純化試劑盒純化重組人白介素-7(rhIL_7，分子量17.2KD，等電點
8.9)的使用方法，包括如下步驟:
[0070](I)取一步法白介素純化試劑盒一套，包含一個I1-型快速蛋白純化組合層析柱和一瓶 PH = 8 的 20mM Tris-HCl 緩沖液 500ml ；
[0071](2)打開I1-型快速蛋白純化組合層析柱上面和下面蓋子，取Tris-HCl緩沖液約100ml，逐量從柱上方添加于快速蛋白純化組合層析柱，使其通過層析柱，以洗滌并平衡柱內樹脂緩沖體系；
[0072](3)將含rhIL-7的大腸桿菌表達的粗提液3ml用500mlTris-HCl緩沖液透析過夜，將透析過的蛋白粗提液，加在平衡過的I1-型快速蛋白純化組合層析柱的上層樹脂上，靠自重讓蛋白粗提液流入樹脂中，然后取50ml的IX緩沖液，逐量加入層析柱，使目標蛋白被分離流出，用紫外檢測儀在280nm處檢測流出峰，或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪制洗脫曲線；
[0073](4)從檢測到蛋白流出組分開始按每2ml分量收集流出液組分，用SDS-PAGE電泳檢測各組分中目標蛋白純度和含量；
[0074](5)根據SDS-PAGE電泳圖分析，如圖4所示，流出液組分6(即第6泳道)具有純度最高的目標蛋白IL-7，保存該組分。
[0075]以上對本發明的較佳實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發明的實施范圍。凡依本發明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發明的專利涵蓋范圍之內。
【權利要求】
1.一種快速蛋白純化組合層析柱，其特征在于:包括柱體、離子交換樹脂層、三片濾片、凝膠過濾樹脂層、流出口，所述三片濾片分別設置于柱體內部底面、離子交換樹脂層床面上和凝膠過濾樹脂層床面上，濾片形狀大小與柱體截面相同，孔徑大于被分離蛋白，小于離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂，流出口設置在柱體底部。
2.根據權利要求1所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特征在于:所述離子交換樹脂層的填充高度是柱體內徑的0.3-3倍，所述凝膠過濾樹脂層的填充高度是所述離子交換樹脂層填充高度的2倍以上。
3.根據權利要求2所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特征在于:所述凝膠過濾樹脂層的填充高度是所述離子交換樹脂層填充高度的5-20倍之間。
4.一種制備權利要求1-3任一項所述層析柱的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)選取層析柱空柱體，清潔后在柱體底部放入一片濾片； (2)取活化的凝膠過濾樹脂或離子交換樹脂，用水溶脹充分后，取少量裝入柱體，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹脂、沉降，如加入凝膠過濾樹脂時，床面達到柱體內徑的0.6倍以上后，在床面上輕輕壓入一片濾片，如加入離子交換樹脂時，床面達到柱體內徑的0.3-3倍后，在床面上輕輕壓入一片濾片； (3)取活化的凝膠過濾樹脂或離子交換樹脂，且與步驟(2)的樹脂不相同，用水溶脹充分后，取少量添加在步驟(2)樹脂層床面上的濾片上方，靠重力沉降讓水流出，反復裝入樹月旨、沉降，如加入凝膠過濾樹脂時，床面達到步驟(2)加入的離子交換樹脂床面高度的2倍以上后，在床面上輕輕壓入一片濾片，如加入離子交換樹脂時，當床面高度與步驟(2)加入的凝膠過濾樹脂層床面高度的比值大于0，小于等于0.5后，在床面上輕輕壓入一片濾片； (4)用50ml的30%乙醇水溶液，逐量添加于層析柱上，開放層析柱下方出口，反復添加至全部30%乙醇水溶液加入后，分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及層析柱上面柱口，置于冰箱4-8 °C冷藏備用。
5.一種含有權利要求1-3任一項所述層析柱的一步法白介素純化試劑盒，其特征在于:還包括緩沖液。
6.根據權利要求5所述的一種一步法白介素純化試劑盒，其特征在于:所述緩沖液包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液中的一種或兩種。
7.—種權利要求5或6所述試劑盒的使用方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取緩沖液用去離子水稀釋成IX緩沖液； (2)取5倍于快速蛋白純化組合層析柱中離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂總體積量的IX緩沖液，逐量從柱上方添加于快速蛋白純化組合層析柱，使其通過層析柱，以平衡柱內樹脂緩沖體系； (3)將待分離的蛋白粗提液用該IX緩沖液透析過夜，或在待分離的蛋白粗提液中添加適量的濃縮緩沖液，使緩沖液的終濃度為IX，檢測稀釋后的蛋白粗提液PH值是否與原緩沖液的PH值相同，調節其pH值至與原緩沖液pH值相同； (4)取凝膠過濾樹脂體積的1/10-1/20經步驟(3)處理的蛋白粗提液，加在經步驟(2)處理的快速蛋白純化組合層析柱的上層樹脂上，靠自重或壓力差讓蛋白粗提液流入樹脂中，然后取3-5倍于快速蛋白純化組合層析柱中樹脂總體積量的IX緩沖液，讓其自上而下通過層析柱，使目標蛋白被分離后流出，用紫外檢測儀在280nm波長處檢測流出峰，或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪制洗脫曲線； (5)從檢測到蛋白流出組分開始分量收集流出液組分，檢測各流出液組分中目標蛋白純度和含量，保存含有目標蛋白的流出液組分。
【文檔編號】C07K1/18GK104231037SQ201410474278
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】鄒潮, 馬蕾 申請人:哈德遜（天津）生物技術有限責任公司