專利名稱：脂解酶分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種測定脂解酶活性的方法，以及利用此方法從多肽文庫中篩選所需脂解酶的方法。
背景技術：
脂解酶是一類能水解酯鍵的酶，其廣泛用于各種工業中，例如去污工業和烘烤工業。
有很多不同的檢測脂解酶活性的方法是公知的，例如Gupta R et al.，2003，Biotechnol.Appl.Biochem，37，63-71綜述了這些方法。
由于對新的和/或舊脂解酶的變異體，特別是一些適合于工業應用的脂解酶的持續需求，新的能檢測所述酶活性的分析方法也變得必要。
發明概述本發明提供了一種測定脂解酶活性的方法，該方法包括檢測脂解酶與底物間的酶促反應的氣相pH值，其中底物含有位于C1-C10羧酸與醇之間的酯鍵。
另外，本發明提供了一種從多肽文庫中篩選所需脂解酶的方法，該方法包括a)檢測文庫中的多肽與底物間的酶促反應的氣相pH值，其中，該底物包含位于C1-C10羧酸與醇之間的酯鍵b)挑選所需脂解酶發明詳述定義本發明上下文中的術語“多肽”意欲包括寡肽、多肽和類似的蛋白質。
本發明上下文中的術語“親本(parent)”理解為修飾后能產生蛋白變異體的蛋白。親本蛋白可以是天然形成(野生型)的多肽，或者是通過任意合適方法制備的天然存在多肽的變異體。舉例來說，親本蛋白可以是天然存在蛋白的變異體，其可通過取代、化學修飾、缺失或截斷天然存在多肽的一個或多個氨基酸殘基得到修飾，或者通過在天然存在多肽的氨基酸序列上增加或插入一個或多個氨基酸殘基的方式得到修飾。
本發明上下文中的術語“變異體”理解為與親本蛋白相比有一個或多個氨基酸殘基被修飾的蛋白。
本發明上下文中的術語“修飾”或“修改”理解為包括蛋白的化學修飾和編碼蛋白的DNA的遺傳操作。修飾可以是在所需氨基酸處或其內的氨基酸側鏈的置換、取代、缺失和/或插入。因此，術語“修飾的蛋白”理解為包含相對于親本蛋白的修飾的蛋白。
脂解酶/所需脂解酶本發明中的脂解酶/所需脂解酶是指能夠水解酯鍵的脂解酶。舉例來說，這些酶包括諸如三酰甘油脂酶(EC 3.1.1.3)、脂蛋白脂酶(EC 3.1.1.34)、甘油單脂脂酶(EC 3.1.1.23)、溶血磷脂酶和酯酶(EC 3.1.1.1，EC 3.1.1.2)的脂酶。括號中的字符是國際生物化學聯合會酶學委員會(Enzyme Commission of the International Unionof Biochemistry)根據酶的催化活性種類編排的系統分類號。
脂解酶/所需脂解酶可以是原核生物酶，具體而言是細菌酶，比如，來自假單胞菌屬(Pseudomonas)的酶類。這樣的例子有假單胞菌脂酶，例如來自洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(US 5,290,694，pdb file 1OIL)，莢殼假單孢菌(P.glumae)(N Frenkenet al.(1992)，Appl.En-vir.Microbiol.58 3787-3791，pdb files 1TAH和1QGE)，類產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 334 462)和假單孢菌屬的菌株(Pseudomonassp.Strain) SD 705(FERM BP-4772)(WO 95/06720，EP 721 981，WO 96/27002，EP 812 910)的假單胞菌脂酶。莢殼假單孢菌的脂酶序列與粘稠色桿菌(Chromobacterium viscosum)(DE 3908131 A1)的氨基酸序列一致。其它例子有細菌角質酶，例如來自假單胞菌，如門多薩假單孢菌(P.mendocina)(US 5,389,536)或惡臭假單孢菌(P.putida)(WO 88/0936)的細菌角質酶。
可選擇地，脂解酶/所需脂解酶可以是真核生物酶，例如真菌脂解酶，如腐質酶科(Humicola family)和接合菌科(Zygomycetes family)脂解酶，和真菌角質酶。
真菌角質酶的例子有茄病鐮孢(Fusarium solani)pisi角質酶(S.Longhi等，Journal of Molecular Biology，268(4)，779-799(1997))和Humicola insolens(US5,827,719)角質酶。
脂解酶的腐質酶科由來自H.lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶和與該脂肪酶具有50％以上同源性的脂肪酶組成。來自H.lanuginosa(與Thermomyceslanuginosus同義)的脂酶在EP 258 068和EP 305 216中被描述，并且具有US5,869,438的SEQ ID NO2的1-269位顯示的氨基酸序列。
腐質酶科也包括下列脂解酶來自沙門氏柏干酪青霉(Penicillium camembertii)(P25234)的脂酶，來自尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)(EP 130064，WO 98/26057)的脂酶/磷脂酶，來自異孢鐮孢(F.heterosporum)(R87979)的脂酶，來自臭曲霉(Aspergillus foetidus)(W33009)的溶磷脂酶，來自米曲霉(A.oryzae)(JP-A10-155493)的磷脂酶A1，來自米曲霉(D85895)的脂酶，來自黑曲霉(A.niger)(Y09330)的脂酶/阿魏酸酯酶，來自塔賓曲霉(A.tubingensis)(Y09331)的脂酶/阿魏酸酯酶，來自塔賓曲霉(WO 98/45453)的脂酶，來自黑曲霉(WO 98/31790)的溶血磷脂酶，來自茄病鐮孢(F.solanii)的具有6.9的等電點和表觀分子量為30千道爾頓的脂酶(WO 96/18729)。
接合菌家族包括與Rhizomucor miehei(P19515)脂酶具有至少50％同源性的脂酶。該家族也包括來自反射犁頭霉(Absidia reflexa)，A.sporophora，傘枝犁頭霉(A.corymbifera)，A.blakesleeana，A.griseola(在WO 96/13578和WO 97/27276中都有描述)和米根霉(Rhizopus oryzae)(P21811)的脂酶。括號中的字符表示在EMBL，GenBank，GeneSeqp或Swiss-Prot數據庫中的出版號或登記號。
多肽文庫本發明還涉及一種從多肽文庫中篩選所需脂解酶的方法。本發明上下文中的術語“多肽文庫”理解為至少是兩種不同的多肽的集合，即至少含有兩種有一個或多個不同氨基酸位點的多肽，例如，多肽中的氨基酸數目可不同或者某一特定位點的氨基酸可不同。
通常，可以通過在可表達多肽的宿主細胞中導入編碼多肽文庫的核酸序列來制備多肽文庫。由于遺傳密碼簡并性，該文庫中的不同核酸序列的數目可能多于不同多肽的數目。
具體而言上述核酸序列文庫可以編碼親本脂解酶的變異體，即與親本脂解酶相比至少有一個氨基酸位點不同的多肽。因而篩選的方法可以用來篩選親本脂解酶的變異體。這些變異體可以通過例如隨機或定點突變親本脂解酶或其他本領域技術人員公知的方法獲得。因而在一個具體實施方案中，多肽文庫可以是親本脂解酶變異體的文庫。合適的親本脂解酶的例子包括但不限于前面脂解酶部分所提到的。具體而言，親本脂解酶可以是脂酶(Lipolase)，來源于在EP 258 068和EP 305 216中描述的Humicola lanuginos的脂酶，或者是來源于假單胞菌屬或芽孢桿菌屬(Bacillus)的脂酶。
在另一實施方案中，上述核酸序列文庫可以編碼來源于一個或多個不同生物體的多肽。因此該方法可以用來篩選表達脂解酶活性的一個或多個不同生物體。
在另一實施方案中，多肽文庫可以通過合成多肽的途徑獲得。
制備核苷酸序列文庫的方法、將其導入宿主細胞、在宿主細胞中表達上述多肽文庫編碼的多肽，以及合成多肽的方法對本領域技術人員來說是熟知的，這些方法可以在諸如“分子克隆實驗指南”，Sambrook等(1989)，Cold Spring Harborlab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(編輯)；“分子生物學研究方法(Currentprotocols in Molecular Biology)”，John Wiley和Sons，，(1995)；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編輯)；“芽孢桿菌分子生物學方法(Molecular Biological Methodsfor Bacillus)”，John Wiley和Sons，(1990)；“DNA克隆實用入門(DNA CloningA Practical Approach)，卷I和卷II”，D.N.Glover ed.(1985)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”，M.J.Gait ed.(1984)；“核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)”，B.D.Hames & S.J.Higgins編輯(1985)；“轉錄和翻譯(TranscriptionAnd Translation)”，B.D.Hames & S.J.Higgins，編輯(1984)；“動物細胞培養(AnimalCell Culture)”，R.I.Freshney，ed.(1986)；“固定化細胞和酶(mmobilized Cells AndEnzymes)”，IRL出版，(1986)；“分子克隆實踐指南(A Practical Guide To MolecularCloning)”，B.Perbal，(1984)等文獻中找到。
底物本發明中的底物含有位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵。
本發明上下文中的C1-C10羧酸理解為具有一般通式R-COOH的羧酸，這里的R是指具有0-9個碳原子(C-原子)的碳氫化合物。碳氫化合物一般理解為只含有碳和氫的化合物，然而本發明文中的R也可以被替代，例如，被鹵素替代。
R可以是飽和碳氫化合物，即烷烴(alkane)，即只含有單鍵的碳氫化合物，R也可以是不飽和碳氫化合物，即含有一個或多個雙鍵或三鍵的碳氫化合物。含有雙鍵的碳氫化合物也稱作烯烴，而含有三鍵的碳氫化合物也稱作炔烴。在大多數天然存在的底物中，碳氫化合物是烷烴或烯烴。
R可以是直鏈的或支鏈的，也可以是環型的或芳香型的。
本發明中的C1-C10羧酸可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10羧酸，特別是，它可以由2-8個，例如，4-8個碳原子組成。
在本發明的具體實施方案中，C1-C10羧酸的R基團是直鏈的、未被取代的碳氫化合物。像這樣合適的C1-C10羧酸的例子包括但不限于丁酸(CH3(CH2)2COOH)、戊酸(CH3(CH2)3COOH)、己酸(CH3(CH2)4COOH)和辛酸(CH3(CH2)6COOH)或癸酸(CH3(CH2)8COOH)。
通常將包含具有CH3(CxHy)COOH通式的長碳氫鏈的羧酸稱為脂肪酸。脂肪酸由很多不同的脂類組成，這些脂肪酸中的脂通過酯鍵與醇共價相連。這樣的脂類的例子包括但不限于三酰基甘油(也稱為甘油三酯)、蠟、雙半乳糖甘油二酯(digalactosyl diglycerides)和磷脂，這里的三酰基甘油是含有三個脂肪酸和甘油的三酯，蠟是被酯化到長鏈醇上的一種脂肪酸，而磷脂是一種在脂的親水基團含有磷酸基團的脂類。所有這些結構對于本領域技術人來說都是熟知的。雖然很多天然存在的脂類包括具有10個以上的碳原子的烴鏈的羧酸，包括10個或10個以下的碳原子的羧酸的天然存在的脂類也是被知曉的。本發明中的底物可以是脂類，例如，那些上文中所提到的中的一種，具體而言它可以是三酰基甘油。因而本發明中的底物中的醇具體可以是甘油、甘油-3-磷酸、長鏈醇或這些醇的修改型(modified version)。其他可作底物的醇的例子對本領域技術人員而言是熟知的。
本發明中的底物可以是天然形成的底物、合成的底物或加工的底物，例如，某天然形成底物被人工加工所得的底物。本發明上下文中的術語“天然形成的底物”(天然存在的底物，natural occurring substrate)被理解為一種存在于自然界中的化合物。
許多脂類，那些天然形成的和那些被人工加工過的脂類，都包括了不同的甘油三酸酯和脂肪酸(當它們以脂肪酸存在，而不是其他化合物，如甘油三酯，的一部分的形式存在時，有時被描述為游離脂肪酸)的混合物。這些脂類的組合物常通過不同脂肪酸的含量而被描述。在本發明的一個具體實施方案中，底物可以是一種或多種不同甘油三酸酯的混和物，一種或多種脂肪酸的混和物，或是一種或多種不同甘油三酯與一種或多種不同脂肪酸的混和物。具體而言，本發明中的底物可以是包含由一種或多種不同甘油三酯和一種或多種不同脂肪酸混和而成的脂肪或油類，譬如動物脂肪，如乳脂或黃油，或者植物脂肪，如橄欖油。如果底物包括不同甘油三酯和/或脂肪酸混合物，其可能具體是包括0.1-100w/w％之間，如0.5-100w/w％或1-95w/w％或1-85w/w％或1-75w/w％或1-50w/w％或1-25w/w％或5-95w/w％或5-75w/w％或5-50w/w％或5-25w/w％或10-95w/w％或10-75w/w％或10-50w/w％或10-25w/w％或15-95w/w％或15-75w/w％或15-25w/w％或20-95w/w％或20-75w/w％或20-50w/w％或25-95w/w％或25-75w/w％或25-50w/w％或40-100w/w％或40-80w/w％或60-80w/w％或50-100w/w％或50-75w/w％或60-100w/w％或60-80w/w％或70-100w/w％或70-95w/w％或70-80w/w％之間的諸如前文所述之一的C1-C10羧酸的底物。
測定pH值氣相pH值可以通過任何已知的pH值檢測方法進行測定。在一個具體實施方案中，pH值指示劑被用來測定pH值，這里的術語“pH值指示劑”理解為能檢測pH值的任何方法。比如，pH值指示劑可以是一種在某一pH值下變色和/或發熒光的化合物。通常，由于不同的pH值指示劑只能在特定的pH值范圍內指示pH值，選擇的pH值指示劑常常依賴于被檢測的特定pH值。為本領域技術人員所熟知的在某一特定pH值時變色的pH值指示劑化合物的例子包括但不限于龍膽紫(Crystal Violet)、甲酚紅、百里酚藍、藻紅B、2，4-二硝基酚、溴酚藍、甲基橙、溴甲酚綠(Bromcresol Green)、甲基紅、溴甲酚紫(Bromcresol Purple)、茜素(Alizarin)、溴百里酚藍(Bromthymol Blue)、酚紅、間硝基苯酚(m-nitrophenol)、o-甲酚酞(o-Cresolphtalein)、酚酞(Phenolphthalein)、百里酚酞(Thymolphthalein)、茜素黃(Alizarin Yellow)R和Oregon綠(Oregon Green)羧酸(分子探針)。另外，也可使用商業用pH值指示劑，它們能通過顏色和/或熒光指示寬范圍的pH值。
由于C1-C10羧酸的酸性，它們的釋放通常將降低氣相pH值。因而在所述酸進入pH值指示劑之前，根據其氣相pH值，pH值指示劑將能具體測得或指示0-14之間的pH值，例如pH2-12，pH3-12，pH3-10，pH3-9，pH4-12，pH4-10，pH5-12，pH5-10，pH5-8，pH6-12，pH6-10或pH6-8。在本發明的一個具體實施方案中，pH值指示劑可以是溴甲酚綠。
然而，其他pH值指示劑也視作可以使用，其包括但不限于熒光pH值指示劑。
利用pH值指示劑檢測氣相pH值可以通過例如視覺或pH值指示劑的自動檢測方法完成。pH值指示劑可以存在于例如液體介質或固體介質或膠質(如瓊脂糖)中。本領域技術人員熟知檢測吸光率或熒光的方法。
本發明的方法本發明的一個實施方案涉及一種測定脂解酶活性的方法，該方法包括檢測脂解酶與底物間酶促反應的氣相pH值，其中底物含有位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵。
本發明的發明者發現脂解酶與與底物間酶促反應的氣相pH值可用于檢測脂解酶的活性，其中底物含有位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵。脂解酶能水解底物的酯鍵，從而能使C1-C10羧酸從底物中釋放出來。由于脂解酶的性質，大多數測定其活性的分析方法需在室溫或稍高的溫度環境下進行，例如10-80℃。在此溫度環境下C1-C10的汽化壓力才能足夠使至少一部分釋放的C1-C10羧酸成為氣相。本發明的發明者發現釋放的C1-C10羧酸或一部分進入氣相中的羧酸可以通過檢測氣相pH值而檢測到，并且該pH值的大小與脂解酶的活性相關。釋放的C1-C10羧酸對氣相pH值的影響理所當然地依賴于反應發生前氣相pH值的大小，然而，由于C1-C10羧酸是一種酸，所以相對于反應發生前的氣相pH值，其通常將降低其氣相pH值。
本發明還涉及到在多肽文庫中篩選所需脂解酶的方法，方法包括a)檢測文庫多肽與底物發生的酶促反應的氣相pH值，其中底物含有一個位于C1-C10羧酸與醇間的酯鍵b)挑選所需脂解酶用于挑選所需脂解酶的標準通常是根據檢測所需脂解酶與其底物間的酶促反應的氣相pH值。舉例來說，可以根據實際的pH值，也可通過比較檢測得的pH值與對照的氣相pH值的不同來挑選。因而具體可以根據酶與底物反應導致氣相pH值的變化來挑選目的脂解酶。對照可以是例如酶促反應發生前的氣相pH值，或也可以是已知脂解酶的酶促反應的氣相pH值，該已知脂解酶的酶促反應的反應條件與被用來篩選多肽文庫的酶促反應相同。例如，如果文庫表示親本脂解酶變異體，就可以用親本脂解酶與底物的酶促反應的pH值作為對照來挑選某變異體(所需脂解酶)，其變異體和底物發生酶促反應的氣相pH值與通過親本脂解酶產生的pH值是不同的。具體而言就是可以有目的性的挑選變異體(所需脂解酶)，其反應的氣相pH值會高于或低于親本脂解酶反應的pH值。
其他對照可以根據挑選所需脂解酶的標準來選擇使用。
當該方法用于檢測脂解酶的活性時，對照同樣需要用到。比如，可以使用一種所謂的內部標準，例如，通過將被測脂解酶生成的pH值與已知脂解酶生成的pH值比較，使校正分析-再分析偏差(assay-assay variations)成為可能，這是一個本領域技術人員很熟悉的問題。這樣的對照也可以用于從多肽文庫中篩選所需脂解酶。
接下來的部分是為了概括本發明的所有方法，引用“酶促反應”是為了涵蓋本發明的脂解酶與本發明的底物的酶促反應，以及本發明中多肽文庫中的多肽與本發明的底物間的酶促反應，然而，上述文庫可以含有不與本發明中的底物反應的多肽。
本發明中的酶促反應可以在液體溶液中進行。然而，在本發明的一個具體實施方案中，酶促反應可以在織物上發生。本發明上下文中所述的氣相理解為與酶促反應發生相相接觸的氣相。舉例來說，如果酶促反應在液體溶液中發生，那么本發明所述的氣相是與液體溶液相接觸的氣相，而如果酶促反應在織物上發生，氣相就是與織物相接觸的氣相。如果酶促反應是在封閉的容器中發生的，氣相當然通過容器來界定，然而，本發明的酶促反應也可以在開放的容器中進行。如果能使酶促反應在開放容器中進行，那么從酶促反應中釋放出的C1-C10羧酸就能與pH值指示劑發生反應。如前所述，在一個具體的實施方案中pH值指示劑可以在液體介質、固體介質或膠體介質(例如瓊脂糖)中存在。在該實施方案中，本發明的脂解酶與底物發生酶促反應釋放的C1-C10羧酸進入到上述酶促反應發生相之上的氣相中，隨后再進入到含有pH值指示劑的相(例如瓊脂糖)中。
pH值可以在酶促反應過程中隨時被檢測，例如可以在酶促反應達到平衡前進行檢測，和/或在釋放的C1-C0羧酸在發生了/發生酶促反應的相例如液相，與氣相之間達到平衡之前進行檢測。測量酶活性時，原則上是測量酶與底物發生的酶促反應的反應速率。因而當本發明方法中使用對照，并且在酶促反應在達到平衡前檢測pH值時，理所當然重要的是，脂解酶/所需脂解酶和底物間的酶促反應與對照和底物間的酶促反應是同時發生的。
實際上，pH值指示劑可以從酶促反應一開始就存在于氣相中，經過一段時間后再讀取pH值指示劑，其可以再與對照的pH值相比較。
如果酶促反應在溶液中發生，該溶液可以包含其它成分，例如鹽類、pH穩定劑、去污劑等等，這些成分可以保持脂解酶/所需脂解酶的最佳活性。
脂解酶或多肽文庫與底物間的酶促反應可以在任何合適的容器中進行，例如搖瓶、微量滴定板(如24孔/板、96孔/板、384孔/板、1536孔/板或每板孔數更多的滴定板)或納升無孔隔間(nanoliter well-less compartment)。使用微量滴定板的優勢在于它通常易于檢測自動化，這一點在篩選多肽文庫的過程中是特別有用的。
在本發明的一個具體實施方案中，脂解酶與底物間的酶促反應在一容器中進行，該容器與含有pH值指示劑的第二容器相連。例如，酶促反應在一微量滴定板上進行，而pH值指示劑在另一微量滴定板上，該滴定板倒置在發生酶促反應的滴定板上。隨后便可以通過對含有pH值指示劑的微量滴定板的底部(底部朝上)的目測或自動檢測來測定氣相pH值。
本發明所述的方法可以通過多種方式得到使用，比如，如果脂解酶或多肽文庫是被宿主細胞所表達的，那么用這些細胞的培養基肉湯作為脂解酶/多肽文庫的來源。然而，“純的”脂解酶的脂解活性也可以通過本發明中的方法來檢測，其中術語“純的”意在涵蓋只包含小部分其它成分的脂解酶樣品，例如至少含40w/w％、50w/w％、60w/w％、70w/w％、80w/w％、90w/w％、95w/w％或95w/w％的脂解酶的樣品。
在一個具體的實施方案中，脂解酶或多肽文庫與本發明的底物間的酶促反應，可以在織物上發生。因而本發明所述的方法在酶促反應之前可包括以下步驟i)將脂解酶或多肽文庫與織物接觸ii)可選地漂洗織物如果織物被漂洗，本發明的脂解酶或多肽文庫與底物間的酶促反應在一個實施方案中可以通過在步驟i)或步驟ii)之后將脂解酶或多肽文庫與該酶相接觸而實現。在另一實施方案中，酶促反應可以這樣實現將本發明的底物與織物相接觸，任選地漂洗織物，然后將其與脂解酶或多肽文庫接觸。因而，在一個具體實施方案中，本發明的方法在酶促反應之前可以包括下列步驟i)將脂解酶或多肽文庫與織物相接觸，其中在該織物與脂解酶或多肽文庫的接觸前，該織物已與底物接觸并可選地進行了漂冼，其中所述底物含有位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵ii)可選地漂洗織物在本發明的一個具體實施方案中，該方法的實施可以通過使織物上存在不含位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵的底物，例如豬油。然后可以將織物與脂解酶接觸，可選地隨后進行漂洗。織物上殘留的脂解酶的量可以這樣測量將存在于織物上的所述脂解酶與含有位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵的底物反應，并按以上文所述方法檢測該酶促反應的氣相pH值。然后，該pH值可以用來衡量織物上的脂解酶的活性。
在一個具體實施方案中，通過使織物接觸含有去污劑和脂解酶或多肽文庫的溶液，使脂解酶或多肽文庫接觸織物。這一過程尤其可以在類似于洗滌衣物的條件下完成，例如，如WO02/42740中所述的，在機械應力的存在下進行。
許多C1-C10羧酸具有大多人認為難聞的氣味。因此，本發明的方法也可用來檢測由于脂解酶與包含位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵的底物之間的酶促反應而釋放到氣相中的難聞氣味。當脂解酶用于去污劑中時，洗滌后的衣物不會釋放出難聞氣味是特別有用的。因而本發明的方法特別可以用于篩選脂解酶，例如相比于特定的對照酶，與底物發生反應時釋放更多或更少的C1-C10羧酸的脂解酶。
織物在本發明的上下文中，術語“織物”包括織品(fabrics)、服裝(garments)和紗線(yarns)。
織品可以是由絲線通過編織、針織或無紡方法構造的。編織和針織要求紗線作為給料，而非織造物則是由絲線通過隨機連結(random bonding)得到的(紙張可以被認為是無紡的)。在本文中，術語“織品”還意在包括纖維以及其他類型的加工織品。
編織品(woven fabric)是在織機上于縱向伸展的經紗(wrap yams)之間編織緯紗(“filling”或weft yarns)而構造的。為了潤滑和保護經紗在編織時緯紗高速地插入時免遭磨損，必須在編織前為經紗上膠漿。緯紗可以以“一上一下”(平紋編織)或“一上兩下”(斜紋編織)的方式或其他任意多種排列方式通過經紗來編織。強度、質地和圖案不僅和紗線的類型/品質有關，而且和編織的類型有關。通常，女裝(dresses)、襯衫、褲子、床單、毛巾、帷簾(draperies)等等都是由編織品制造的。
針織是通過聯結紗線的聯鎖線圈而形成織品。編織是由兩種紗線構造的并有許多“端頭”(ends)，與之相反，針織物則是由單股連續的紗線制造的。就象編織那樣，有許多不同的方式把紗線圈繞在一起，而最終織品的特性都依賴于紗線和針織的類型。內衣褲、毛衣、短襪、運動衫、汗衫等等通常來源于針織品。
無紡織品(non-woven)是片狀織品，是通過機械、熱、化學或溶劑介導的過程連接和/或聯鎖纖維與纖絲(filaments)而制造的。生成的織品可以是網狀結構(web-like structure)、片層(laminates)或膜(films)的形式。典型例子是一次性嬰兒尿布、手巾、擦拭用品(wipes)、外科大褂、“環保(environmental friendly)”型時裝所用纖維、過濾介質、被褥、屋面材料、二維織物襯里和許多其它物品。
用于本發明的織物可以是任何已知的織物(編織的、針織的、或無紡的)。具體而言，織物可以是含纖維素的或纖維質(celluosic)的織物，例如棉、粘膠纖維、人造絲、苧麻布、亞麻、lyocell(例如，由Courtaulds Fibers生產的Tencel)、或它們的混合物，或者，它可以是合成織物，例如聚酯、聚酰胺、或尼龍或這些物質的混合物，或者含纖維素或纖維質的纖維與合成纖維的混合物的織物。另一個合適織物的例子是包含其它天然纖維的織物，例如毛料、絲或它們的混合物、或者它們與上述的一種或多種纖維的混合物的織物。纖維混合物的例子包括但不限于粘膠纖維/棉混合物、lyocell/棉混合物、粘膠纖維/毛料混合物，lyocell/毛料混合物、棉/毛料混合物；亞麻(亞麻布)、苧麻及其他基于纖維質纖維的織品，包括所有纖維質纖維同其他的纖維，例如毛料、聚酰胺、丙烯酸類纖維與聚酯纖維的混合物，例如棉/聚酯混合物、粘膠纖維/棉/聚酯混合物、毛料/棉/聚酯混合物、亞麻/棉混合物等等。術語“毛料”是指任何商業使用的動物毛產品，例如，來自綿羊、駱駝、兔子、山羊、美洲駝的毛料，和著名的美利奴(merino)羊毛、設得蘭(Shetland)羊毛、開斯米(cashmere)羊毛、阿爾帕卡(alpaca)毛、馬海毛(mohair)等等，并包括了毛纖維與動物毛。這些織物可以是經漂白的、染色或非染色的。術語“聚酯”是指聚(對苯二甲酸亞乙酯)，它通過縮合合成，熔融抽絲，可能還被切段分級、可能還與其他纖維類型混合，再紡成紗線。紗線染色并且針織成布匹或者被制成地毯，或者紗線織成織品并染色。
酶結合或粘附于織物的能力不但取決于特定的酶，而且取決于織物的類型。例如，在漂洗期間，通常從聚酯制成的織物上去除脂解酶要比從棉紗制成的織物上去除脂解酶來得更困難，因為相比于較親水的材料，脂解酶傾向于更穩固地結合并粘附于疏水性材料。
漂洗在本發明的上下文中，術語“漂洗”應理解為用水基溶液與織品接觸，接著除去所述溶液，其中術語“水基溶液”應理解為最多包含20w/v％非水成分的溶液，例如最多10w/v％或5w/v％或3w/v％或2w/v％或1w/v％或0.5w/v％的非水成分。這些非水成分的例子將在下文給出。
由于本發明所述的方法可以用來模擬洗衣過程，漂洗就可以特別地模擬在洗滌衣物期間的漂洗條件。通常，衣物是用水漂洗的；然而水的組成依賴于水的來源而變化，例如它可能是河水、泉水或地下水。此外，水源的地理位置可以影響其成份。
給定水源的水硬度(總硬度)取決于其堿土金屬鈣、鎂、鍶和鋇的鹽的含量。由于通常鍶和鋇在水中僅僅微量存在，所以水的硬度定義為鈣離子(Ca2+)和鎂離子(Mg2+)的含量。表述水的硬度的習慣做法是將水硬度的表示僅與鈣關聯，也就是說將鎂離子的含量也表示為鈣含量。經常用于硬度的實際測量單位是所謂的德國度，其定義如下1°dH＝10mg/lCaO。
“硬”水是那些包含高濃度的碳酸鈣及其他礦物質的水。
“軟”水是那些包含低濃度的碳酸鈣及其他礦物質的水。
那些存在于用來漂洗的水基溶液中的其它組分的實例包括但不限于緩沖液，特別是pH值在4-10之間的緩沖液、鹽類、軟化劑和少量的去污劑。如果織物和酶/多肽文庫已經在去污劑存在下進行了接觸，例如通過織物的“洗滌”，則特別可能存在少量的去污劑。適宜的緩沖液的實例包括但不限于如下表格1所述。
表格1

除如上所述的Ca2+和Mg2+離子之外，存在于水基溶液中的鹽類或離子的實例包括但不限于NaCl、KCl、鍶和鋇。
在洗滌中為了改善衣物的手感和清新度并減少靜電積累，軟化劑常常被使用(參見例如Levinson MI，1999，Journal of Surfactants and Detergents，2，223-235)。軟化劑中的主要成分之一是陽離子表面活性劑(tensides或surfactants)，例如二氨基胺(diamidoamine)、雙酯季銨鹽(diester quaternary)或基于三乙醇胺的esterquat，然而，它也可以包含其它成分例如芳香劑、防腐劑、緩沖液、染料、熒光增白劑、酶、染料穩定劑、紫外線吸收劑、氯清除劑和/或電解質(參見例如Levinson MI，1999，Journal of Surfactants and Detergents，2，223-235)。
容器本發明還涉及了包含至少兩個部分的容器，其中一個部分包含一個pH值指示劑，另一個部分適于容納液體。所述容器可以具有任意物理形式并可以由任意材料制成。特別地，容器可以具有這樣的物理(physical)形式，使得可以從容器外部讀出由pH值指示劑所指示的pH值，例如，包含pH值指示劑的容器的那一部分可以特別地由透明材料制成。在一個具體實施方案中，所述容器也具有這樣的物理形式，使得可以自動讀取pH值指示劑所指示的pH值，例如通過使用可以根據所選pH值指示劑來測量吸光率或熒光的裝置。在一個具體實施方案中，所述容器可以包含多個容器，每個容器包括兩個部分，其中一部分包含一pH值指示劑而另一部分適于容納液體。更具體地，所述的多個容器可以具有這樣的物理形狀兩個微量滴定板置于彼此頂部，其中一個滴定板倒置(upside down)另一個使得各個板的孔彼此相對。如果該容器包含多個容器，那么可以特別使用防止氣體從一個容器進入另一個容器的手段。例如，可以將材料片置于容器的兩個部分之間，其中所述材料具有與每一單獨的容器相對應的孔洞。可以如實施例中的描述其中一片石蠟封口膜置于第一微量滴定板上，所述石蠟封口膜包含孔洞，所述孔洞與微量滴定板的各孔口互相連通，然后將第二微量滴定板微量滴定板倒置于第一微量滴定板上，使得第一和第二微量滴定板的孔口相互接通。如此，第一微量滴定板的各個孔口將和第二微量滴定板的孔口接通，同時第一微量滴定板的孔口之間的區域與第二微量滴定板的類似區域之間將被石蠟封口膜所封堵。
但是，其它形狀的容器與/和其它材料制成的容器也可以被應用。
材料與方法脂解酶Lipolase是來源于在EP 258068和EP305216中描述的Humicola lanuginosa的脂肪酶。Lipex是Lipolase的變體并已在WO 0060063中描述。
培養基SC＝合成的完全培養基方法微洗滌(Micro-laundry)把被豬油或黃油污染的織物樣品沖壓進96孔微量滴定板的孔中。每個孔中施加150μl的去污劑(100mM的L-精氨酸)。將10μl的表達要測定的酶的酵母細胞上清液(已于微量滴定板上SC培養基中生長3-4天)加入到每個孔中，接著將微量滴定板在30℃，500rpm下保溫20分鐘。用洗板器除去洗滌水，接著如下所述樣品漂洗。
漂洗在用不同的酶濃度進行微洗滌(Micro-laundry)試驗(如上所述)后，使用硬度為15°dH的人工制得的水(參見材料與方法部分)漂洗存在于微孔中的織物樣品。
漂洗過程這樣進行加入180微升硬度為15°dH的水，將板置于300rpm的定軌振蕩器上5分鐘，然后除去漂洗水。這個漂洗過程總共重復3次。在最終除去漂洗水之后，向孔中加入脂肪酶底物，用于測定存在于各個織物樣品上的脂肪酶活性。
酸堿指示板(溴甲酚綠-瓊脂糖)將1克瓊脂糖(Gibco BRL，Life technologies)溶于100ml 0.1mM的四硼酸二鈉十水合物(#0268 JT Baker，Mallinckrodt Baker，Deventer，Holland)。
在微波爐中略微加熱溶液直到全部的瓊脂糖被融化。在冷卻到55℃后，在0.1mM的硼酸鈉中加入溴甲酚綠直到終濃度為0.006％。
制備兩種不同的帶溴甲酚綠-瓊脂糖的板a)聚苯乙烯微孔板(標準尺寸96孔的微量滴定板)的每個孔中加80微升b)小容量微批量板(microbatch plate)的每個孔中加15微升將這些板送到分光光度計，在614nm處測量板上每個孔的吸光率，從而讀取pH值。
在614nm處的高吸光率表明pH值沒有變化，而在614nm處的低吸光率表明pH值已下降，也就是說更為酸性。
由于在洗滌及漂洗后已清洗的織物還可包含極少量的脂肪酶，它能夠降解同樣還存在于織物上的黃油，使之變成脂肪酸。這些脂肪酸中的一部分是有揮發性的，將從織物上蒸發，通過洗滌板的孔進入對面包含溴甲酚綠-瓊脂糖的板(pH值指示板)。這些游離脂肪酸將進入緩沖液，并且由于它的酸性將降低pH值，從而指示劑將相應變化。
實施例實施例1用不同脂肪酶洗滌的織物樣品的短鏈脂肪酸釋放的測定將被黃油和蘇丹紅沾染的織物樣品置于96孔微量滴定板的孔中。用Lipase，Lipex，Var3或Var5以0，0.12，0.25，0.5，1或2ppm的酶濃度按照微洗滌試驗(如上所述)洗滌樣品，接著如上所述漂洗。這個漂洗過程總共重復3次。在漂洗水最終除去之后，在該包含經過洗滌和漂洗的織物樣品的96孔板的頂端放置石蠟封口膜，該石蠟封口膜具有與每個孔的開口相對應的洞。
將一包含80微升溴甲酚綠-瓊脂糖/孔(a)的pH值指示板，和一包含15微升溴甲酚綠-瓊脂糖/孔的板，各自倒置于包含經過洗滌和漂洗的織物樣品的96孔板的頂端。這些板這樣放置，使得帶96洞的石蠟封口膜成為織物板和指示板之間的滲漏密封。這樣的板夾層結構(plate sandwich)以大約2公斤的重量裝配來保持很好的密封，所以任何蒸發的化合物都被垂直方向地傳到指示板上的垂直孔，而不被水平地傳到其它指示孔。在室溫下保溫18小時后，在分光光度計中測定有溴甲酚綠-瓊脂糖的孔在614nm處的吸光率。結果如下顯示在表2中。
表2

這些結果表明Var3和Var5兩者比Lipolase和Lipex更多地降低了氣相pH。
在類似的方案中用氣相色譜法測定釋放的C1-C10羧酸數值，顯示了類似上述的結果。
權利要求
1.測定脂解酶活性的方法，其包含測定脂解酶與底物間的酶促反應的氣相pH值，其中底物包含位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵。
2.從多肽文庫篩選所需脂解酶的方法，其包含a)測定文庫的多肽與底物間的酶促反應的氣相pH值，其中底物包含位于C1-C10羧酸和醇之間的酯鍵；b)選擇所需的脂解酶。
3.根據前述任一項權利要求的方法，其中C1-C10羧酸選自丁酸、戊酸、己酸和辛酸。
4.根據前述任一項權利要求的方法，其中醇是丙三醇。
5.根據權利要求4的方法，其中底物是甘油三酯。
6.根據前述任一項權利要求的方法，其中底物是甘油三酯和脂肪酸的混合物，例如乳脂、黃油、橄欖油。
7.根據前述任一項權利要求的方法，其中脂解酶或所需脂解酶是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
8.根據前述任一項權利要求的方法，其中底物存在于織物上。
9.根據前述任一項權利要求的方法，其中在酶促反應之前，所述方法包含以下步驟i)將脂解酶或多肽文庫與織物接觸，和ii)可選地漂洗織物。
10.包含至少兩個部分的容器，其中一個部分包含pH值指示劑，其它部分適于容納液體。
全文摘要
本發明涉及一種測定脂解酶活性的方法，其包括測定脂解酶與底物間的酶促反應的氣相pH值，其中底物包含位于C1－C10羧酸和醇之間的酯鍵。此外，還涉及一種從多肽文庫中篩選所需脂解酶的方法，在所述方法中包括了文庫檢測。
文檔編號C12Q1/44GK1965077SQ200580018643
公開日2007年5月16日 申請日期2005年6月7日 優先權日2004年6月7日
發明者馬茨·E·比約恩瓦德, 格諾特·阿貝爾 申請人:諾維信公司