專利名稱：：蕓苔屬植物的微彈轟擊轉化法的制作方法蕓莒屬植物的孩i:彈轟擊轉化法發明領域本發明領域涉及植物的遺傳工程，具體地說，涉及蕓苔屬(5mw/cfl)植物的遺傳轉化方法。
背景技術：
：蕓苔屬各品種均可用作植物油、動物詞料、蔬菜和調味料的來源。用作蔬菜生產的蕓苔屬植物包括巻心菜、花椰菜、青花椰菜、羽衣甘藍、球莖甘藍、雪里蕻和蕪菁甘藍。白芥(及/wWfl)的種子被用來生產頗受歡迎的美國調味品黃芥末醬。然而，在全球性基礎上，蕓莒屬品種最重要的經濟用途是由種子獲得的植物油產品。種植用于油品生產的主要蕓苔屬品種是甘蘭型油菜(及"甲w，亦稱歐洲油菜)，其次是芥菜型油菜(及A"cea，亦稱芥菜)和白菜型油菜(5.ra/a,亦稱蕪青)。甘蘭型油菜、芥菜型油菜和白菜型油菜的種子都被稱為油菜籽。所種植的主要用于油品生產的蕓莒屬品種常被稱為含油種子油茱。在北美，一直被用來篩選種子中低水平的芥子酸和芥子油苷的一類含油種子油菜-雙低油菜(canola,亦稱甘蘭型油菜)，是為了生產人類消費用植物油品而種植的主要蕓苔屬植物。雖然低芥子酸油菜籽油，例如甘蘭型油菜油，可能有利于人類消費，但是高芥子酸油菜籽油也是多種工業應用所需要的，包括用于化妝品、潤滑劑、增塑劑和表面活性劑的生產。因為蕓莒屬植物在農業和工業上的重要性，所以植物育種人員正致力于開發農藝性狀改良的新品種。雖然傳統育種方法十分重要，但是最近通過遺傳轉化方法，在栽培蕓苔屬品種中，將重組DNA導入蕓苔屬基因組的研究取得了重大進展。許多經遺傳修飾的蕓苔屬品種已經種植在北美農場主的田間。經遺傳〗務飾而具有除草劑抗性的轉基因甘蘭型油菜品種，迅速獲得橫貫美國和加拿大甘蘭型油菜種植區農業生產者的青睞。轉基因甘蘭型油菜品種在北美取得的重大成功加速了新的甘蘭型油菜轉基因品種的開發。對于甘蘭型油菜和其它蕓苔屬品種，正在開發基于重組DNA的摻入新性狀的新策略，所述新性狀例如抗病、抗蟲、改良種子油組成和改良種子蛋白質組成。所有這些策略都依賴于將重組DNA導入蕓苔屬植物基因組的遺傳轉化方法。最近，蕓苔屬品種最有利的轉化方法包括利用土壤桿菌。雖然基于土壤桿菌的轉化方法為將外源DNA導入植物提供了可靠的方法，但是涉及利用土壤桿菌的植物轉化法存在許多缺點。首先，所有基于土壤桿菌的方法不理想的結果是將至少一個T-DNA邊界序歹ij(T-DNAborder)導入受體植物基因組。雖然T-PNA邊界序列是土壤桿菌將DNA轉移到植物細胞遺傳機制的必不可少的元件，但是T-DNA邊界序列卻不是外源基因在受體植物中表達所必需的。另外，整個植物基因組中多個T-DNA邊界序列的累積可能對植物或其子代產生有害作用。其次，植物組織與土壤桿菌共培養可能減緩從轉化細胞再生出轉化植物。共培養期后，必需從植物組織培養物中清除土^t裏桿菌。必須將高水平的殺細菌劑應用到植物培養物中以殺死土壤桿菌。雖然培養物中所用的殺細菌劑水平一般對植物組織不是致死的，但是培養物中存在的殺細菌劑可能對植物生長產生負面影響，因此減緩轉化植物的再生。第三，在DNA轉移到植物中之前，土壤桿菌中可能發生天然的遺傳過程，例如遺傳重組和DNA重排，這可能對轉移到植物中的DNA片段產生不良作用。這種不良作用可能改變或清除已導入DNA片段的既定遺傳功能。有效但不涉及利用土壤桿菌的蕓苔屬轉化方法是十分需要的。US6,051,756、US6,495,741、US2003/0093840和US2004/0045056記載了用粒子轟擊對幼苗下胚軸的轉化。US6,297,056記載了子葉柄的轉化。US6,515,206和US2003/0200568記載了真葉中質體轉化的用途。Chen和Beversdorf(7T2eorJ/;/.88:187-192(1994))描述了涉及DNA吸漲的小孢子衍生下胚軸的生物射彈轉化方法(biolistictransformationprocedure)。Fukuoka等(尸/a"fCe//ie/o他17:323-328(1998))描述了新生小孢子的生物射彈轉化。最后，Nehlin等(尸/awP/yw'o/.第156巻175-183(2000))描述了預賻育小孢子的瞬時生物射彈轉化，但是沒有報道穩定的轉基因植物。為了滿足當今全球對農業日趨增加的需求，必須加快開發甘蘭型油菜和其它蕓苔屬品種的轉基因新品種的步伐。加快蕓苔屬品種的開發步伐取決于有效可靠的轉化方法以及轉化的蕓苔屬植物有效可靠的再生方法。發明概述本發明提供產生轉基因蕓苔屬植物的方法。該方法包括通過微彈轟擊(microprojectilebombardment)導入DNA構建體。所導入的DNA構建體可編碼蛋白質或者可抑制內源基因。所述方法通過4參入所需農藝性狀而應用于農業、特別是蕓苔屬植物改良品種的開發中。該方法包括通過微彈轟擊將DNA構建體導入能夠再生出穩定轉化的蕓莒屬植物的蕓苔屬細胞中，并且由該細胞再生出這樣的蕓苫屬植物。本發明一方面提供通過粒子轟擊產生轉化的蕓苔屬細胞的方法，該方法包括(a)在轟擊前，將含有細胞的預孵育小孢子衍生的外植體在質壁分離條件下培養約0.5小時至約4小時；(b)通過^L彈轟擊將DNA構建體導入預孵育小孢子衍生的外植體表面上暴露的細胞內，其中外植體處于質壁分離的條件下；和(c)將經過轟擊的預孵育小孢子衍生的外植體在質壁分離的條件下繼續培養約4小時至約20小時，以產生轉化的蕓莒屬細胞。預孵育小孢子衍生的外植體是在轟擊前已培養了介于1天和30天之間的小孢子或由小孢子衍生的任何組織(例如小孢子衍生的胚或小孢子衍生的下胚軸)。質壁分離條件可選自(a)在滲透培養基(osmoticmedium)上培養外植體，和(b)在濕濾紙上培養夕卜植體。外植體可以是預孵育小孢子(pre-incubatedmicrospore)、預將育小孢子衍生胚或預孵育小孢子衍生下胚軸。該方法還包括由轉化細胞再生出轉化植物的步驟，該步驟包括(a)在再生培養基上培養所述小孢子衍生的外植體以產生再生胚或組織；和(b)由所述胚或組織再生出穩定轉化的蕓苔屬植物。本發明一方面提供產生穩定轉化的蕓苔屬植物的方法，該方法包括(a)通過微彈轟擊將DNA構建體導入預孵育的外植體，它可以是小孢子或小孢子衍生胚或小孢子衍生胚的部分；(b)培養預孵育的外植體以產生胚或組織；和(c)由所述胚或組織再生出穩定轉化的蕓苔屬植物。步驟(a)中，在轟擊前，將小孢子在培養基中大約培養2-10天的一段時間，可產生預孵育小孢子。這段時間可約為4-8天，或者7-8天。該方法還包括在轟擊前、轟擊期間及轟擊后誘導預聘育小孢子質壁分離的步驟。例如，質壁分離可按照下列方法誘導(a)在轟擊前、轟擊期間及轟擊后，在滲透培養基上培養預孵育小孢子，或者(b)在轟擊前、轟擊期間及轟擊后，在濕濾紙上培養預孵育小孢子。滲透培養基大約可以含有17%~19%蔗糖以及0.8%-1.6%PhytageFM瓊脂(重量/體積)。預孵育小孢子可在滲透培養基上，在轟擊前大約培養0.5小時至4小時，然后在轟擊后大約培養4小時至20小時。該方法還包括轟擊后的篩選步驟，所述步驟包括將經過轟擊的預孵育小孢子在含有針對DNA構建體編碼基因的選擇劑的培養基上進行培養。例如，選擇劑可選自卡那霉素、G418和草甘膦(glyphosate)。G418的濃度可介于約5mg/L和10mg/L之間。培養基中草甘膦的濃度可介于約O.lmM和0.2mM之間。該方法還可包括在轟擊期間使預孵育小孢子定向以便在轟擊期間使小孢子表面暴露出來的步驟。該方法還可包括在轟擊前收集有存活力并能進行胚發生的預孵育小孢子的步驟。該預孵育小孢子的收集步驟可以是過濾步驟或者是珀可(Percoll⑧)梯度離心的步驟(站可(Percolf)濃度為35-45%)。可用孔徑約15-48pm的篩進行過濾步驟。所述方法的步驟(a)中，可用轟擊因子(bombardmentfactor)進行微彈轟擊，轟擊因子包括約12.5ng-5嗎的所述DNA構建體，每槍金顆粒大約15|ag-100|ig，大小為0.4微米至0.6微米，約2.5MCaCl2和650-900psi爆破盤(rupturedisk)。再生出穩定轉化植物的步驟可包括將經過轟擊的預孵育小孢子在第一液體選擇培養基中培養第一段時間，在第二液體選擇培養基中培養第二段時間，然后將由預將育小孢子獲得的抗性胚或組織轉移到固體培養基上培養第三段時間。第一段時間可約為7天，預孵育小孢子可避光培養。預孵育小孢子或者由預孵育小孢子衍生的組織或胚，可在約240英尺燭光或2,583勒克斯的暗光下，在第二液體選擇培養基中培養約14天。第二液體培養基可為液體NLN-6.5S并且還含有生長調節劑。第二液體選擇培養基中的生長調節劑可包括0.5mg/LNAA和0.05mg/LBAP。此外，第一液體選擇培養基、第二液體選擇培養基或者第一液體選擇培養基及第二液體選擇培養基兩種培養基可含有G418或草甘膦。此外，固體培養基可含有誘導再生的生長調節劑，任選還含有針對DNA構建體編碼基因的選擇劑。固體培養基可為含吲哚乙酸(IAA)、賽苯隆(thidiazuron,TDZ)和硝酸銀(AgN03)的MMW培養基。固體培養基還可含有針對DNA構建體編碼基因的選擇劑。該方法還包括使用染色體加倍劑(chromosomedoublingagent)來產生加倍單倍體轉基因植物。可以在轟擊后1天內給予加倍劑，可給予約7天。如果本發明經過轟擊的外植體是小孢子衍生胚，則該方法可包括(a)在轟擊前，將小孢子衍生胚在滲透培養基上培養約0.5小時至約4小時；(b)通過微彈轟擊將DNA構建體導入小孢子衍生胚在滲透培養基上的暴露面；(c)將經過轟擊的小孢子衍生胚在滲透培養基上繼續培養約4小時至約20小時；(d)在再生培養基上培養所述經過轟擊的小孢子衍生胚以產生再生胚或組織；和(e)由再生胚或組織再生出穩定轉化的蕓苔屬植物。小孢子衍生胚可生長約11天至20天。小孢子衍生胚可生長約為11天至14天。該方法還包括用吸液管收集胚并在步驟(a)之前將胚轉移到濾紙上的步驟。步驟(d)可包括將胚在液體培養基中培養第一段時間，然后在固體培養基上培養第二段時間。第一段時間可約為7-14天。該方法還包括從再生胚切取下胚軸并于再生培養基上培養下胚軸的任選步驟。另外，該方法還包括篩選轉化胚或組織的步驟，所述步驟包括將胚在補充了針對DNA構建體編碼基因的選擇劑的培養基上進行培養。該方法包括使用染色體加倍劑來產生加倍單倍體轉基因植物。如果本發明經過轟擊的外植體是小孢子衍生胚部分，則該方法可包括(a)在轟擊前，將從小孢子衍生胚切取的下胚軸在滲透培養基上培養約0.5小時至約4小時；(b)通過^f效彈轟擊將DNA構建體導入小孢子衍生下胚軸在滲透培養基上的暴露面；(c)將經過轟擊的小孢子衍生下胚軸在滲透培養基上繼續培養約4小時至20小時；(d)在再生培養基上培養所述小孢子衍生下胚軸以產生再生胚或組織；和(e)由所述胚或組織再生出穩定轉化的蕓莒屬植物。可在介于約21天和26天之間從小孢子衍生胚切取小孢子衍生的下胚軸。該方法還包括轟擊前將小孢子衍生下胚軸在細胞分裂誘導培養基上培養約1-20小時的步驟，該培養基中含有植物生長調節劑。步驟(d)可包括將胚在第一固體培養基上培養第一段時間，然后在第二固體培養基上培養第二段時間。第一固體培養基中可含有誘導發芽的植物生長調節劑。第二固體培養基中可不含植物生長調節劑，或者可含有用于枝條形成的植物生長調節劑。該方法還包括篩選轉化胚或組織的步驟，所述步驟包括將胚或組織在補充了針對DNA構建體編碼基因的選擇劑的培養基上進行培養。該方法還包括使用染色體加倍劑來產生加倍單倍體轉基因植物。本發明的另一方面提供用上述任一種方法產生的蕓苔屬細胞或穩定轉化的蕓苔屬植物。所述植物或細胞可選自甘蘭型油菜(石msw'cawapw，亦稱歐洲油菜)、白菜型油菜CBraww'ca亦稱蕪青)、芥菜型油菜(j8raxs7'ca乂w"cea，亦4爾芥菜)、更予甘藍(5ras5/cfl。/eracea)、埃塞俄比亞芥(Bmw/c"car/"ato)和黑齊CSra孤,caw/gra)。本發明還提供所述植物和細胞的子代。發明詳述本發明涉及蕓苔屬植物的轉化方法。該方法用于農業以便開發出農藝性狀改良的轉基因作物。該方法特別應用于將所需性狀導入蕓苔屬植物。這類新的性狀可以是例如除草劑抗性、病原體和昆蟲抗性、改良的種子油組成等。該方法包括將DNA構建體導入蕓莒屬植物細胞基因組并且由該細胞再生出穩定轉化的植物。以下部分將對本文所用的多個術語進行定義和闡明。術語"蕓苔屬細胞"是指來自蕓苔屬植物的細胞，或通過體外培養法產生的細胞及由蕓莒屬植物細胞傳代下來的細胞。術語"體細胞胚"是指由體細胞發育而來的胚。由細胞發育成體細胞胚的發育過程稱為"體細胞胚發生"。這種"體細胞胚"與由合子發育而來的"合子胚"截然不同。術語"小孢子衍生(的)胚"是指由小孢子發育而來的胚。因為它由生殖細胞發育而來，所以這種"小孢子衍生(的)胚"與分別由體細胞和合子發育而來的體細胞胚和合子胚兩者都截然不同。術語"小孢子衍生(的)下胚軸"是指由小孢子發育而來的胚的下胚軸。術語"不定(的)"是指不是起源于植物體通常位置上的植物器官或其它結構。例如，起源于小孢子衍生胚的下胚軸的枝條(shoot)是"不定枝(adventitiousshoot)"。術語"甘蘭型油菜(canola)"是指蕓苔屬植物或得自蕓苔屬植物的油，其中油中芥子酸所占比例必定在2%以下，而且種子固體組分中每克風干不含油固體所含有的以下成分任一種或任何以下成分的混合物必定是小于30微摩爾葡萄糖異硫氰酸3-丁烯酯(3-butenylglucosinolate)、葡萄糖異硫氰酸4-戊烯酯、葡萄糖異硫氰酸2-羥基-3-丁烯酯和葡萄糖異硫氰酸2-羥基-4-戊烯酯。術語"器官發生"是指其中一個細胞或細胞群長出例如枝條、芽或根等器官的發育過程。術語"染色體加倍，，是指細胞中每條染色體都被加倍，導致了細胞的染色體數目加倍。術語"倍性"是指細胞核中整套染色體的數目。"單倍體，，細胞具有一套染色體，而"二倍體"細胞具有兩套染色體。術語"有效量"是指能夠在生物中引起所需效果的物質、化合物或植物生長調節劑的量。一般認為"有效量"可隨例如生物、生物的靶組織、施藥方法、溫度、光照、相對濕度等因素而變化。此外，一般還認為特定物質的"有效量"可通過給予生物一定用量范圍的物質，然后測定哪種或哪些用量引起所需的效果來確定。術語"預孵育小孢子衍生的夕卜植體(pre-incubatedmicrospore-derivedexplant)"是指在轟擊前大約培養了1天至30天之間的小孢子或者由這種小孢子得到的任何組織(例如小孢子衍生胚或小孢子衍生下胚軸)。例如，預孵育小孢子可自從供體植株分離出小孢子起培養約2-10天。例如，預孵育小孢子衍生胚可自從供體植林分離出小孢子起培養約11天至20天。例如，預孵育小孢子衍生下胚軸可自從供體植抹分離出小孢子起培養約21天至26天。術語"子代"是指特定細胞或植物的后代，該細胞或植物包含插入TO植物細胞基因組基因座中的至少一部分轉基因。例如，子代可以是植物結出的種子以及由這些種子生長出的植物。例如，植物子代包括TO、Tl、T2和后代植物結出的種子，以及由這類種子生長出的植物。子代還包括用T0、Tl、T2、T3等植物的花粉通過異花傳粉所結出的種子。例如，子代可以是自交、遠交或回交的結果。子代還可包括由包含至少一部分插入TO植物細胞基因組基因座的轉基因的T0、Tl、T2等植物或細胞衍生的無性繁殖的植物或細胞。例如，包含至少一部分插入TO植物細胞基因組基因座的原始轉基因，通過插條、組織培養、小孢子培養等所產生的植物也視為子代。本發明提供轉化蕓苔屬植物的方法。該方法包括用DNA構建體通過^f鼓彈轟擊轉化蕓苔屬細胞。該方法還包括轉化細胞再生出轉化的蕓苔屬植物。這種轉化的蕓苔屬植物具有摻進其基因組的至少一個拷貝的DNA構建體或其部分。本發明的轉化蕓苔屬植物可以是穩定轉化的蕓苔屬植物。這種轉化的蕓苔屬植物能夠產生至少一個子代，該子代具有至少一拷貝穩定摻進其基因組的本發明DNA構建體或其部分。本發明的細胞可來源于(l)預孵育小孢子，(2)小孢子書f生胚，或者(3)小孢子衍生下胚軸。一般認為這些組織的細胞很有可能是單倍體。如果細胞經歷自發染色體加倍，或者如果細胞受染色體加倍劑作用，則細胞可能是二倍體。單倍體細胞的轉化是有利的，因為所得染色體加倍的轉基因植物是純合的。將目標DNA構建體通過微彈轟擊導入細胞內。已知微彈轟擊的其它術語還包括粒子轟擊、微粒子轟擊、射彈微粒子加速(ballisticparticleacceleration)和生物射彈轉化。一般地講，這些方法包括將目標DNA構建體涂在或者包裹在微粒表面，然后將包被有DNA的微彈遞送到把組織，遞送速度足以允許該粒子穿過細胞壁和細胞膜從而進入植物細胞。參見例如Sanford等，美國專利第4,945,050號；Tomes等,美國專利第5,879,918號;Tomes等，美國專利第5,886,244號;Bidney等，美國專利第5,932,782號；Tomes等(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment(通過孩W舉轟擊指導DNA轉移至完整植物細胞中)"，PlantCell,Tissue,andOrganCulture:Fundamental.Methods,編輯Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)"和McCabe等(1988)所ofec/wo/ogy6:923-926。本發明的方法不依賴于特定的DNA構建體。本發明方法可以采用通過微彈轟擊導入細胞的任何DNA構建體。本發明的DNA構建體可包含至少一個與驅動在植物細胞中進行表達的啟動子操作性連接的目標核苦酸序列。DNA構建體可包含選擇標記基因和至少一個與驅序列。另外，DNA構建體可包含選擇標記基因和至少一個能夠賦予蕓苔屬植物所需性狀的另外的核苦酸序列。本發明的方法另還包括使本發明的轉化細胞再生出穩定轉化的蕓苔屬植物。轉化植物的再生包括在引起轉化細胞生長和發育成轉化植物的條件下培養轉化細胞。轉化細胞或其后代可發育成轉化胚，特別是發育成轉化小孢子衍生胚或體細胞胚，隨后再發育成轉化植物。或者，轉化細胞及其后代可發育成轉化器官，例如不定枝。一般認為由轉化細胞通過不定枝再生出轉化的蕓莒屬植物另可包括不定枝形成之前愈傷組織的形成。這種不定枝可用來通過本領域已知方法產生穩定轉化的蕓苔屬植物。該方法一般包括在有利于在不定枝上形成不定根的培養基和環境下培養不定枝。不定枝生根的方法為本領域所知。本發明的方法不依賴于用于轉化蕓苔屬枝條生根的特定方法。本發明方法可采用本領域已知的不定枝生根的任何方法。一般而言，使不定枝生根可包括將枝條在含有效量的植物生長素(例如吲哚丁酸)的培養基上孵育一段時間，以誘導根系形成。參見例如Moloney等(1989)尸/a"fCW/7epoWj8:238-242和Radke等(1992)尸/a^CW/W印oWs11:499-505。然后可由培養物中取出生根枝條，移栽到土壤或盆栽基質(pottingmedium)中，并放在利于生長、成熟和種子產生的環境條件下。一般認為本發明的轉化胚、轉化不定器官和轉化植物可以是嵌合的。也就是說，這些轉化胚、器官和植物既可包括轉化細胞又可包括非轉化細胞，或者可包括兩種或更多種不同的轉化細胞。一般還認為這些嵌合植物可產生子代植物，該子代植物包含穩定摻進所有體細胞和生殖系細胞基因組的目標DNA構建體或其部分。本發明的方法包括蕓苔屬植物細胞的轉化。細胞可以是單倍體細胞。雖然單倍體細胞一般不產生二倍體植物，但是一般認為單倍體細胞有時可自發產生能夠發育成能育植物的二倍體細胞。必要時，本發明方法可采用染色體加倍劑從而使單倍體細胞的倍性增至兩倍。也就是說，單倍體細胞變成二倍體細胞。這種二倍體細胞可產生穩定轉化的能育蕓苔屬植物。本發明的方法不依賴于特定的染色體加倍遺傳機制。然而，很有可能是發生在例如在有絲分裂期但沒有胞質分裂時的染色體復制而導致染色體加倍。誘導本發明染色體加倍的方法包括給予細胞、優選單倍體細胞有效量的染色體加倍劑。已知增加細胞倍性的任何物質都可用于本發明的方法。染色體加倍劑包括但不限于氟樂靈、秋水仙素、安磺靈(oryzalin)、甲基消草磷和拿草特。根據所需結果，可在將DNA構建體通過微彈轟擊導入細胞前、導入細胞后，或者既在導入前又在導入后，給予組織或其細胞染色體加倍劑。在本發明的某些方法中，在轟擊后給予有效量的染色體加倍劑。由轉化的蕓苔屬細胞再生出的植物稱為T0代或TO植物。通過TO代植物的各種有性雜交所產生的種子稱為Tl子代或Tl代。當Tl種子萌發時，所得植物亦稱T1代。Tl植物或者用Tl花粉雜交所產生的種子稱為T2種子，T2種子產生T2植物。T2植物或者用T2花粉雜交所產生的種子稱為T3種子。T3種子產生T3植物。因此，通過T4、T5、T6等進行傳代。可對T1、T2、T3、T4等的種子和植物進行分析以確保轉基因的成功遺傳。各種有性雜交是可行的。例如，植物可以是自交、遠交或回交。或者，轉基因植物(T0、Tl、T2等)可以無性繁殖，例如按照本領域技術人員已知方法進行克隆、組織培養、插條、小孢子培養等。在本發明的第一個實施方案中，本發明提供轉化蕓苔屬預孵育小孢子并由其再生出穩定轉化的植物的方法。第一個實施方案的方法包括用包被有目標DNA構建體的微彈轟擊預孵育小孢子。通過本領域技術人員已知方法分離出小孢子。例如參見Fukuoka等(1996)P/""f尸/2;^'o/."A.39-47、Keller等(1987)尸rac.7"/"A7a/eyee(iCo"gr.(PlantBreedingandAcclimatizationInstitute,Poznan,Poland),第152-157頁；Swanson等(1987)尸/a"fCW/ie;o^6:94-97和Baillie等(1992)P/a"fCe〃Weporfe11:234-237。小孢子為單倍體。可分離出小孢子，然后在含有高濃度蔗糖(例如17%蔗糖)的培養基中培養2-3天。我們建議使用高濃度的蔗糖以便緊接分離后確保小孢子的完整性。此外，高滲脅迫可能對胚發生誘導產生積極作用(Maraschin等，2005J五x;5o"6:1711-1726和Prem等，20057/"P7加CW/.Dev.所o/.-Plant41:266-273)。然后將小孢子在含有低濃度濕糖(例如10%蔗糖的范圍內)的培養基中培養4-8天，以促進小孢子分裂。因此，2-10天的預孵育期也落在本發明的范圍內。預孵育期后，按富集有生命力和胚發生性小孢子的方式收集預孵育小孢子。例如，這可以通過用孔徑為15-48nm的NitexTM篩進行。孔徑可介于15pm和25pm之間。胚發生性小孢子還可通過珀可(Percolf)梯度離心富集化(Touraev1996尸/a"f9:209-215)。珀可(Percolf)濃度介于35%至45%之間。然后將容納有預孵育小孢子的NitexTM篩在轟擊前、轟擊期間和轟擊后一^爻時間內i文到、滲透處理培養基上。滲透處理引起小孢子輕微的質壁分離以確保它們不致于因轟擊過程而破裂。轟擊期間，小孢子表面可暴露在包被有DNA的轟擊粒子的通道中，以促使該顆粒進入，還能防止培養基的任何突然涌入(即暴露的小孢子表面不埋入培養基中)。滲透處理有利于這一點。例如，可將預孵育小孢子在轟擊前、轟擊期間進行滲透處理1-2小時，并且在轟擊后進行l-24小時。例如，滲透處理可包括將預孵育小孢子放到培養基上，培養基中含有0.8-1.6%的PhytagelTM即瓊脂、17%~19。/。的蔗糖及lg/LMES(2-[7V-嗎啉代]乙磺酸)。還可以在轟擊前、轟擊期間和轟擊后將小孢子(任選過篩)放入培養皿(直徑3.5cm)中進行滲透處理。將用NLN-13S培養基濕潤的一張濾紙(直徑3.2cm)放入培養皿中以防止小孢子脫水。在轟擊后，可將小孢子和篩在含有加倍劑和高濃度蔗糖(例如13%蔗糖)的培養基中大約培養7天。如果目標DNA構建體包含選擇標記基因，則可將經過轟擊的預孵育小孢子轉移到含有用于特定選擇標記基因的合適選擇劑的培養基中。這種轉移可緊隨轟擊后進行或者經一段時間后進行。例如，轉移可在轟擊后零天至約30天之間進行。在篩選階段，預孵育小孢子可以在選擇NLN培養基中進行傳代培養,NLN培養基中可含有低濃度(例如6.5%)的蔗糖和生長調節劑(例如細胞分裂素和植物生長素)。選擇可在光照下進行。然后可監測預孵育小孢子出現的轉化胚和/或不定枝。然后，可將這些轉化胚和/或不定枝在枝條再生培養基中培養，再生培養基中含有MS或B5組分，而且還可在含有或不含植物生長調節劑時含有選擇劑(例如卡那霉素或草甘膦)。再生枝條在含有O.lmg/LGA3的B5培養基中生根。在本發明的第二個實施方案中，提供用包被有目標DNA構建體的微彈轉化來自小孢子衍生胚的細胞的方法。該方法是本領域已知用來由蕓苔屬小孢子產生胚的方法。參見Fukuoka等(1996)尸/aWP/z>^o/.7":39-47和Keller等(1987)TVoc.7rt/"A"op&sedCo"gr.(PlantBreedingandAcclimatizationInstitute,Poznan,Poland)第152-157頁。如同小孢子本身一樣，包含這種細胞的小孢子衍生胚是單倍體。本發明的方法中，整個小孢子衍生胚受到包被有DNA的微彈轟擊。小孢子衍生胚的生長期可超過10天，尺寸約大于1.5mm。小孢子衍生胚的生長期可介于11天和20天之間。胚可以是球形或心形的。出于上述同樣的原因，在轟擊前、轟擊期間及轟擊后，將胚在滲透培養基上進行培養。胚的至少一個表面會在轟擊期間暴露于轟擊粒子的通道(即不接觸培養基)，以利于粒子進入細胞，并且避免培養基突然涌入細胞內。例如，胚可在轟擊前進行滲透處理約4小時，并且在轟擊后進行約20小時(例如過夜)。例如，滲透處理可包括含有17-19%蔗糖和1.5%瓊脂的培養基，用于防止胚細胞在轟擊期間和轟擊后破裂。或者，滲透處理可包括將胚放在具有濕濾紙的培養皿中。然后將胚轉移到再生培養基上。再生培養基中可包括但不限于B5培養基、基于MS的培養基(MS鹽與有機物、2%(重量/體積)蔗糖、0.6%(重量/體積)瓊脂(西格瑪公司(Sigma))，pH5.8)。可切取胚衍生的下胚軸，放在選擇培養基中培養以誘導轉基因枝條。通常，由于頂端分生組織或下胚軸區生長的結果，小孢子衍生胚產生l條不定枝或幾條不定枝。第二和第三實施方案的方法可包括小孢子衍生胚和小孢子衍生下胚軸的不定枝再生。這種方法應用于增加從轉化實驗中再生出轉化植抹的數量。不定枝再生包括從小孢子衍生胚形成多條枝。因此，單個小孢子衍生胚通過轉化可產生多條轉化枝。通常，一般認為由單個小孢子衍生胚中產生的所有轉化枝條都是獨立的轉化體。也就是說，每條轉化枝衍生自獨立的轉化細胞，因此在遺傳上是截然不同的。然而，對于本研究的目的，所有得自各個胚的多重事件都是關聯的。不定枝再生的方法為本領域所知。雖然本發明的方法不依賴于不定枝再生的特定方法，但是該方法可包括使小孢子衍生胚接觸有效量的細胞分裂素以誘導不定枝。可以在給予小孢子衍生胚細胞分裂素后約30天以內實現不定枝再生。可以在給予細胞分裂素約10天以內實現不定枝再生。本發明的第二種再生方法另可包括使小孢子衍生胚接觸有效量的植物生長素。在示例性方法中，在轟擊后，在含有或不含有效量的植物生長素時給予小孢子衍生胚有效量的細胞分裂素，以誘導不定枝再生。如果第二個實施方案方法所用的DNA構建體包含選擇標記基因，則可以緊隨轟擊后或者在轟擊后少于2天至約30天的時間內進行篩選。可以使小孢子衍生胚與有效量的目標DNA構建體選擇標記基因的合適選擇劑接觸，來進行篩選。可將有效量的選擇劑加到培養小孢子^f汙生胚的培養基中。選擇劑可以單用或者與一種或多種其它化合物(例如染色體加倍劑或植物生長調節劑)合用。在本發明第三個實施方案中，提供用于粒子轟擊小孢子衍生下胚軸的方法。如上所述，小孢子是按照本領域技術人員已知方法分離和培養的。培養后大約21天，當胚一般呈魚雷形時，原培養基用新鮮培養基稀釋，將小孢子大約再多培養5天。培養物中大多數的胚在26天后一般處于子葉期。從胚中切取下胚軸切片，在補充了植物生長調節劑的培養基上培養一段時間以誘導細胞分裂。例如，切取的下胚軸可在MMW+4mg/LBAP+0.25mg/LNAA上培養過夜。在轟擊前、轟擊期間和轟擊后，按照上述方法將切取的下胚軸進行滲透處理。另外，將與轟擊路線直接成一直線的下胚軸表面暴露于轟擊粒子通道(即與轟擊路線直接成一直線的下胚軸表面不埋入培養基中)，以利于包被有DNA的粒子進入，并且避免培養基的任何突然涌入。滲透培養基中可含有17-19°/。蔗糖、1.5%瓊脂和lg/LMES。可將下胚軸在滲透培養基上在轟擊前培養4小時，然后在轟擊后再培養過夜。滲透處理后，可將下胚軸轉移至芽誘導培養基(例如MMW+4mg/LBAP+25-100mg/LKAN)中。芽可以是未成熟的枝條、葉、胚或花。然后可將包含不定芽的下胚軸轉移到枝條再生培養基(例如無激素MMW或MMW+0.2mg/LBAP)中。可在轟擊后將選擇劑加到任何培養基中。另外，第一、第二、第三個實施方案的方法可包括在轟擊前或任選轟擊后，將有效量的染色體加倍劑加到培養基中。添加染色體加倍劑并不是所有情況都必需的，因為自發加倍的比率可能較高，尤其在使用小孢子衍生胚和小孢子衍生下胚軸的實施方案中。這種染色體加倍劑和4吏用方法為本領域技術人員所知，有關論述見上文。用途。本發明的植物生長調節劑包括但不限于游離和綴合兩種形式的天然存在的植物生長調節劑。另外，本發明的植物生長調節劑包括這類天然存在的植物生長調節劑的合成類似物和前體。乙酸(IAA)、3-吲哚丁酸(IBA)、a-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸、2，4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)、(4-氯-2-曱基苯氧基)乙酸(MCPA)、4-(4-氯-2-甲基苯氧基)丁酸(MCPB)、2曱4氯丙酸(mecoprop)、2,4-滴丙酸(dicloprop)、二氯喹啉酸、毒莠定、定草酯、二氯皮考啉酸、氟草煙和麥草畏。分裂素、賽苯隆(TDZ)、玉米素、玉米素核苷、磷酸玉米素核苷(zeatinribosidephosphate)、二氫玉米素、異戊基腺噤呤和6-節基腺噤呤(BAP)。本發明的方法可包括作為選擇劑的G418二硫酸鹽(GibcoTM，Fluka公司亦按GeneticinTM銷售)或者作為選擇劑的草甘膦的用途。在轟擊預孵育小孢子后，可先避光然后在低強度的光(例如約240英尺-燭光或2，583勒克斯)下在液體培養基中進行篩選。然而，可以使用本領域技術人員已知的其它選擇劑。例如有卡那霉素(Beck等(1982)19:327-336;Mazodier等(1985)iVwc/".c爿c!'A13:195-205)和其它除草劑如BastaTM和ChlorsulfUronTM等。穩定的轉基因植物可通過聚合酶鏈式反應(PCR)分析和DNA印跡雜交分析得到證實。本文所用術語"DNA構建體"并非將本發明局限于包含DNA的核苷酸構建體。本領域普通技術人員應當理解的是，本文所公開的方法中還使用核苷酸構建體，特別是包含核糖核苷酸和核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸組合的多核苷酸和寡核苷酸。因此，本發明的DNA構建體包括本發明方法所采用的轉化蕓苔屬植物的所有核苷酸構建體，包括但不限于包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其組合的核苷酸構建體。這種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子又包括合成類似物。本發明的DNA構建體還包括所有形式的核苷酸構建體，這些形式包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發夾結構、莖環結構等。此外，一般認為本發明方法可采用能夠在轉化植物中指導表達至少一種蛋白質或至少一種RNA(例如rRNA、tRNA或與至少一部分mRNA互補的反義RNA)的DNA構建體。這種DNA構建體通常由蛋白質編碼序列或與5，和3'轉錄調節區操作性連接的RNA組成。或者，一般還認為本發明方法可采用不能在轉化植物中指導表達蛋白質或RNA的DNA構建體。另外，一般認為本發明方法不依賴于將整個DNA構建體摻入基因組內，只是蕓苔屬植物基因組由于DNA構建體導入蕓莒屬細胞而發生改變。例如，基因組的改變包括基因組中核苷酸的添加、缺失和置換。雖然本發明方法不依賴于核苷酸任何特定數目的添加、缺失或置換，但是一般認為這種添加、缺失或置換包括至少一個核苷酸。本發明的DNA構建體還包括核苷酸構建體，它可用于在生物中使基因組核苦酸序列發生改變或突變的方法，包括但不限于嵌合載體、嵌合突變載體、嵌合修復載體、混合雙鏈體寡核苦酸、自我互補嵌合寡核苦酸(self-complementarychimericoligo皿cleotide)和誘重組性寡核苦堿基(recombinogenicoligonucleobase)。這些核苦酸構建體和使用方法(例如嵌合4務復術(chimeraplasty))為本領域所知。嵌合修復術包括使用這些核苷酸構建體以便在生物體內引起基因組DNA序列的位點專一性變化。參見美國專利號5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984。另參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等(1999)iVoc.Wa".^cadScz..96:8774-8778。另外，本文所用術語"包被有DNA的微彈"并非使本發明的方法局限于包被有DNA的微彈。相反，本文所用術語"包被有DNA的微彈"包括用如上所述的本發明DNA構建體的任一種或多種包被的微彈。本發明的DNA構建體可包括在目標蕓苔屬植物中進行表達的表達盒。表達盒可包括與目標基因操作性連接的5'和3，調節序列。術語"操作性連接(的)"是指調節序列與第二序列之間的功能性連接，其中調節序列影響相應于第二序列的DNA序列轉錄的開始和調節。一般而言，操作性連接是指所連接的核酸序列是相鄰的，而且如果需要便將兩個蛋白編碼區在同一讀框內相鄰地連接在一起。表達盒另可含有至少另一個共轉化到生物中的基因。或者，另外的基因可用多個表達盒提供。本發明提供的這種表達盒具有在調節區的轉錄調節下插入目標基因序列的多個限制位點。表達盒另可含有選擇標記基因。表達盒自5'-3'轉錄方向可包括在植物中起作用的轉錄和翻譯起始區、目標基因和轉錄和翻譯終止區。轉錄起始區即啟動子對于植物宿主可以是天然的(或類似的)或外源的(或異源的)。另外，啟動子可以是天然序列或是合成序列。術語"外源"是指將天然植物不存在的轉錄起始區導入轉錄起始區。本文所用的嵌合基因包含編碼序列及與其操作性連接的轉錄起始區，該轉錄起始區對編碼序列來說是異源的。雖然可優選使用異源啟動子來表達目標基因，但是也可使用天然啟動子序列。這些構建體可改變植物或植物細胞內目標基因的表達水平因此，改變了植物或植物細胞的表型。終止區與轉錄起始區可以是天然的、與操作性連接的目標DNA序列可以是天然的，或者可得自其它來源。根癌農桿菌(A/wwe/a"'era)的Ti-質粒獲得便利的終止區，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區。另可參見Guerineau等(1991)Mo/.262:141-144;Proudfoot(1991)CW/64:671-674;Sanfacon等(1991)(7e"^Dev.5:141-149;Mogen等(1990)尸/"w/Ce〃2:1261畫1272;Munroe等(1990)91:151-158;Ballas等(1989)A^c/e〖c^c!'cfe17:7891-7903和Joshi等(1987)iVwc/e/c4c!Wies.15:9627-9639。適當時，可使基因最優化以增加在轉化植物中的表達。也就是說，可用植物優選的密碼子合成基因以改進表達。有關宿主優選的密碼子使用的論述參見例如Campbell和Gowri(1990)尸/"對尸tyw'o/.92:1-11。本領域可獲得用于合成植物優選基因的方法。參見例如美國專利號5，380，831和5,436,391以及Murray等(1989)iVwc/e/c爿cz'(is17:477-498。已知另外的提高細胞宿主基因表達的序列修飾。這些包括消除以下的編碼序列假聚腺苷酸化信號、外顯子-內含子剪接位點信號、轉座子樣重復序列(transposon-likerepeat)和其它已充分表征的可能對基因表達有害的一些序列。可調節序列G-C含量至所給定細胞宿主的平均水平，參照宿主細胞中已知基因的表達計算出平均水平。可能時，對序列進行修飾以避免預計的發夾型二級mRNA結構。另外，基因可經過基因改組以提高表達。例如，對用于實施例中的草甘膦乙酰基轉移酶基因進行基因改組(Castle等(2004)5We"ce304:1151-1154和WO02/36782A2)。表達盒可在表達盒構建體中另含有5，-前導序列。這種前導序列可以起到提高翻譯的作用。翻譯前導序列為本領域所知，包括小RNA病毒前導序列，例如EMCV前導序歹'j(腦心肌炎病毒5，-非編碼區)(Elroy-Stein等(1989)iW^SUSA86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒組前導序列，例如TEV前導序列(煙草蝕斑病毒)(Allison等(1%6)FzVo/ogy154:9-20);MDMV前導序列(玉米矮縮花葉病毒)；Virology154:9-20)和人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Atowre353:90-94);得自苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMVRNA4)(Jobling等(1987)A^w325:622-625);煙草花葉病毒前導序歹'J(TMV)(Gallie等(1989),載于MolecularBiologyofRNA,編輯Cech(Liss，NewYork),第237-256頁)；和玉米褪綠斑駁病毒前導序歹'J(MCMV)(Lommel等(1991)^>o/ogy81:382-385)。另參見Della-Cioppa等(1987)P/a"f尸/yw'o/.84:965-968。還可采用已知的提高翻譯的其它方法，例如內含子等。在制備表達盒時，可以對各種DNA片段進行處理，以便提供正確方向(適當時在合適的讀框內)的DNA序列。為此，可使用銜接子或接頭以連接DNA片段，或者可包括其它操作以提供便利的限制位點、除去過量DNA、除去限制位點等。為此目的，可以包括體外誘變、引物修補、限制、復性、再置換例如轉換和顛換。許多啟動子可用于本發明的實施中。可根據所需結果選擇啟動子。本發明核酸可與用于在蕓苔屬植物中表達的組成型啟動子、組織優選型啟動子或其它啟動子組合。這種組成型啟動子包括例如Rsyn7的核心啟動子(美國專利第6,072,050號)；核心CaMV35S啟動子(Odell等(1985)A^we313:810-812);水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等(1990)尸/a"fCW/2:163-171);遍在蛋白啟動子(Christensen等(1989)尸/a"fMo/.12:619-25632和Christensen等(1992)尸/a"fMo/.B/o/.18:675-689);pEMU(Last等(1991)T7^or.^p/.81:581-588);MAS(Velten等(1984)五MBO丄3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利第5,659,026號)、SCP(WO97/47756Al、WO99/438380);H2b(Rasco-Gaunt等(2003)戶WCW/鄉.21:569-576);SCP1(美國專利號6,677,503Bl)等。其它組成型啟動子包括例如美國專利號5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5，399，680、5,268,463和5,608,142。組織優選型啟動子可用來以提高目標基因在特定植物組織內的表達為目標。組織優選型啟動子包括Yamamoto等(1997)P/awf丄12(2):255-265;Kawamata等(1997)P/a"fCW/P/^w'o/.38(7):792-803;Hanson等(1997)Mo/.Ge"254(3):337-343;Russell等(1997)Tra"sgemc6(2):157-168;Rinehart等(1996)P/cmf尸一Wo/.112(3):1331-1341;VanCamp等(l996)P/a"f尸/z;w'o/.112(2):525-535;Canevascini等(1996)尸/fl"f112(2):513-524;Yamamoto等(1994)戶/"WCe〃尸/2"z'o/.35(5):773-778;Lam(1994)7asi/to尸ro6/.CW/D(^w.20:181-196;Orozco等(1993)尸/a"fMof所o/.23(6):1129-1138;Matsuoka等(1993)PracA^/.4cac/.USA90(20):9586-9590和Guevara-Garcia等(l993)P/a"f/4(3):495-505。必要時，可對這種啟動子進行修飾以用于弱表達。"種子優選型"啟動子包括"種子發育"啟動子(在種子發育期間優先起作用的啟動子，例如種子^藏蛋白啟動子)以及"種子萌發性"啟動子(在種子萌發期間優先起作用的啟動子)。參見Thompson等(1989)歷oEw《"10:108。這類種子優選型啟動子包括但不限于Ciml(細胞分裂素誘導信息(cytokinin-inducedmessage));cZ19Bl(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-l-磷酸合酶)和celA(纖維素合酶)(參見美國專利第6,225,529號)。對于雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于以下啟動子豆類P-菜豆蛋白(Chandrasekharan等，2003尸/a"f/33:853-866)、油菜籽蛋白(napin)、卩-伴大豆J求蛋白(J3-conglycinin)(Chamberland等1992尸/a"fA/o/.所o/.19:937-949)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。表型的各種變化受到關注，包括改進植物的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機制、提高非生物脅迫耐受性等。可通過在植物中提供異源產物表達或增加內源產物表達而獲得這些結果。或者，可通過減少植物中一種或多種內源產物、特別是酶或輔因子的表達，而獲得這樣的結果。這些改變導致轉化植物的表型發生改變。目標基因或目標核苷酸序列反映出參與農作物開發方的市場和利益。目標農作物和市場發生變化，而且由于發展中國家面向全^^市場開放，新的農作物和技術也將涌現。另外，正如我們所了解的農藝性狀和特性(例如產量和雜種優勢)得到改進，用于轉化的基因選擇也將因此而改變。目標基因的總體范疇包括例如參與信息的基因(例如鋅指)、參與通信的基因(例如酶)和參與持家的基因(例如熱休克蛋白)。轉基因更具體的范疇包括例如編碼以下重要性狀的基因農藝、抗蟲、抗病、抗除草劑、不育、谷粒和商品性狀。目標基因一般包括參與油、淀粉、糖或營養物代謝的基因以及影響谷粒大小、蔗糖負載等的基因。除采用傳統育種方法外，可以通過本發明的方法從遺傳上改變農藝方面的重要性狀，例如油、淀粉和蛋白質含量。所述改變包括增加油酸、飽和與不飽和油的含量、增加賴氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸，還包括淀粉改性。Hordothionin蛋白質修飾參見美國專利號5,9卯,389、5,885,801、5，885，802和5,703,409。另一個實例是由大豆2S白蛋白基因編碼的富含賴氨酸和/或疏的種子蛋白，參見美國專利第5,850,801號，以及得自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制物，參見Williamson等(1987)Bur.J.165:99-106。可以通過定點誘變來制備編碼序列的衍生物，以提高所編碼的多肽中預選氨基酸的水平。例如，大麥高賴氨酸多肽(BHL)編碼基因得自大麥胰凝乳蛋白酶抑制物(WO98/20133)。其它蛋白質包括例如得自向曰葵種子的富含甲硫氨酸的植物蛋白(Lilley等(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs(人類食物和動物詞料應用植物蛋白質世界大會會議錄)，編輯Applewhite(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois),第497-502頁)；玉米(Pedersen等(1986)/歷o/.C/zem.261:6279;Kirihara等(1988)71:359);和7JC稻(Musumura等(1989)尸/a^Mo/.所o/.12:123)。其它農藝學上重要的基因編碼膠乳(latex)、Floury2、生長因子、種子貯藏因子和轉錄因子。抗蟲基因可編碼對產量造成極大損失的害蟲的抗性，例如根蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等。這樣的基因包括例如蘇云金芽孢桿菌(Sac/〃w毒性蛋白基因(美國專利號5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5，593，881和Geiser等(1986)48:109);凝集素基因(VanDamme等(1994)尸/a"fMo/.所o/.24:825;Ahman等2000WO0001223)等。抗病性狀編碼基因包括解毒基因，例如抗串珠鐮孢菌素基因(美國專利第5,792,931號)；減毒(avr)和抗病(R)基因(Jones等(1994)5Wewce266:789;Martin等(1993)5We"ce262:1432和Mindrinos等(1994)Ce〃78:1089)等。賦予核盤菌屬(5Wera"m'a)抗性的基因已被導入向曰葵和蕓苔屬中(美國專利號6,441,275Bl)。在組成型啟動子下的內切殼多糖酶基因4皮導入甘蘭型油菜C8rasWca"apwvar.。/ez/era)近交系中。轉化植物的子代在田間試驗中用三種不同的真菌病原體(Cy/fm^ospon'wmcowcewrfcwm、黑脛莖點霉(i^oma"wgam)、4亥盤菌(5Wera"m'asc/era"'orww))攻擊。與非轉基因母本才直物相比，該才直物顯示對病害的耐受性增強(Grison等(1996)7VWwe5/otec/wo/ogy14:643-646)。有關另外的抗病性基因的論述參見Stewart和Broadway,2005(US6927322);Salmeron等2003(US6528702)及Chye和Zhao2002(US20030097682)。除草劑抗性性狀可包括發揮抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑抗性、特別是磺酰脲型除草劑(例如因含有突變而導致這種抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，特別是S4和/或Hra突變)抗性的編碼基因；起著抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑(例如膦絲菌素或Basta"抗性的編碼基因(例如Zw"基因)，或者是本領域已知的這類基因。ALS-基因突變型編碼除草劑氯磺隆抗性(Swanson等(1989)7Tzeor々^/78:525-530，EP0257993Bl)。草甘膦乙酰基轉移酶(GAT)基因賦予草甘膦抗性(Castle等(2004)5t/e"ce304:1151-1154)。表達盒中還可編碼不育基因，為物理去雄提供替代方法。用于這種方法的基因的實例包括雄性組織優選型基因和具有雄性不育表型(例如抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白)的基因，參見美國專利第5,962,769號(Albertsen等，1999)和Barnase(Block和Debrouwer(1993)尸/a"to189:218-225)。其它基因包括酶和雄性或雌性配子體發育毒性化合物的編碼基因。種子品質反映在性狀中，例如油的水平和類型、飽和與不飽和狀況、必需氨基酸的質量和數量以及纖維素的水平。例如在美國專利號5，990，389、5,885,801、5,885,802和5,703,409中，描述了對于所需目的的蛋白質修飾。還可將商業性狀編碼在一個或多個基因上，這可增加例如淀^^分以用于乙醇生產，或者進行蛋白質表達。轉化植物的其它重要商業用途是生產聚合物和生物塑料(bioplastics)，例如參見美國專利第5,602,321號。基因例如R-酮硫解酶、PHB酶(聚羥基丁酸合酶)和乙酰乙酰輔酶A還原酶(參見Schubert等(1988)5ac/eWo/.170:5837-5847)促進聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達。外源產物包括植物酶和植物產物以及來自包括原核生物和其它真核生物在內的其它來源的產物。這些產物包括酶、輔因子、激素等。可以增加蛋白質水平，特別是增加具有改進的氨基酸分布使得植物營養價值提高的修飾蛋白質。這可通過表達這類氨基酸含量提高的蛋白質來實現。一4t認為本發明的DNA構建體可包含與目標基因的至少部分信使RNA(mRNA)互補的反義構建體。構建反義核苷酸使之與相應的mRNA雜交。可以對反義序列進行修飾，只要該序列與相應的mRNA雜交并且千擾相應的mRNA的表達。按這種方式，可以使用與互補序列的序列同一性為70°/。、80%或85°/。或以上的反義構建體。此外，反義核苷酸部分可用來破壞靶基因的表達。一般而言，可以使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸或以上的序列。通常，這種反義構建體將與驅動在植物中表達的啟動子操作性地連接。本發明的DNA構建體還可用于有義抑制方法(sensesuppressionmethod)以抑制4直物內源基因的表達。以有義方向(senseorientationyf吏用核苷酸序列來抑制基因在植物中表達的方法為本領域所知。該方法一般包括用DNA構建體來轉化植物，所述構建體包含可驅動在植物中進行表達的啟動子及與其操作性連接的至少部分與內源基因轉錄物相應的核普酸序列。通常，這種核苷酸序列與內源基因轉錄物的序列具有相當大的序列同一性，例如序列同一性大于約65%、85%或95%。參見美國專利號5,283,184和5,034,323。一般而言，表達盒可包含用于篩選轉化細胞的選擇標記基因。選擇標記基因用于篩選轉化細胞或組織。標記基因包括抗生素抗性編碼基因，例如新霉素磷酸轉移酶II(NPTII)和潮霉素磷酸轉移酶(HPT)的編碼基因。還可以使用賦予除草劑化合物抗性的基因，除草劑化合物例如草甘膦乙酰基轉移酶、草銨膦(glufosinateammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮類和2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。一般參見Yarranton(1992)Cwr.C^'rt.B^fec/z.3:506-511;Christopherson等(1992)TVoc.89:6314-6318;Yao等(1992)CW/71:63-72;Reznikoff(1992)Mo/.MfcroWo/.6:2419-2422;Barkley等(1980)，栽于TheOperon，笫177-220頁；Hu等(1987)Ce〃48:555-566;Brown等(1987)Ce//49:603-612;Figge等(1988)Ce〃52:713-722;Deuschle等(1989)尸rac.Ato/.^c^/.6W."5^86:5400-5404;Fuerst等(1989)尸rac.A^/.力cad5W.86:2549-2553;Deuschle等(1990)5We"ce248:480-483;Gossen(1993),博士論文，UniversityofHeidelberg;Reines等(1993)/Voc.A^/.爿cad.90:1917-1921;Labow等(19卯)Mo/.Ce〃.所o/.10:3343-3356;Zambretti等(1992)A/fl"Jc<^.<Sc/.t/S」89:3952-3956;Baim等(1991)iVoc.爿ca^.5W.f/SJ88:5072-5076;Wyborski等(1991)iVwc/e/cv4czV^ias.19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7b;/c^Mo/.5Vrwc10:143-162;Degenkolb等(1991)」"">m.cro6.C/^woAer.35:1591-1595;Kleinschnidt等(1988)所oc/z麵勿27:1094-1104;Bonin(1993)，博士論文，UniversityofHeidelberg;Gossen等(1992)乂cad89:5547-5551;Oliva等(1992)^""/m.mZ).C/zewo/Zzer.36:913-919;Hlavka等(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,第78巻(Springer-Verlag,Berlin);G川等(1988)A^wre334:721-724。另夕卜，表達盒可包含篩選標記基因(screenablemarkergene)，例如(3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)編碼基因(Jefferson等(1卯6)/Voc.A^/.爿cac/.5W.83:8447-8451;Jefferson等(1987)￡M506:3901-3907)或綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因(Chalfie等(1994)5We""263:802-805)。以上所列的選擇標記基因和篩選標記基因并不是限制性的。任何選擇和/或篩選標記基因都可用于本發明。本發明的蕓苔屬植物包括但不限于埃塞俄比亞芥CBmw/cac"r"ato)、齊菜型油菜(5ra肌'caj'w"cea)、甘蘭型油菜(Bra加'ca"ap—、瑞典蕪菁CSraw/co！"a/wsvar.ra/i/^ra)、黑芥(5ra加'c"m'gra)、野甘藍(5ras^/cao/eracea)、習習衣甘藍(萬rosw'cao/eraceav"r.ace//za/a)、中國Zof，.s,結球嫩莖花椰茱)、巻心菜(Bnxw/cflo/erace"var.c一toto)、抱子甘藍(5ra肌'cao/eramvor.gemm^ra)、球莖甘藍(萬ra肌'coo/eracea亦稱白菜型油菜CBmw/cacaw/esW《))、小白菜(5rawj/cara/asw6s/7.c/n."em/力和大白菜(5rosw'ca在本發明的某些實施方案中，本發明的蕓苔屬植物是油料種子蕓苔屬植物。這些油料種子蕓苔屬植物用于油品生產，包括但不限于芥菜型油菜、甘蘭型油菜和白菜型油菜。蕓苔屬植物可以是甘蘭型油菜植物。這種甘蘭型油菜植物是精選的油料種子蕓苔屬植物(白菜型油菜、甘蘭型油菜和芥菜型油茱)，其種子中含有低水平的芥子酸和低水平的芥子油苦。甘蘭型油菜油中芥子酸所占比例必定在2%以下，而且種子的固體組分中每克風干不含油固體所含有的以下成分任一種或任何以下成分的混合物必定是小于30微摩爾葡萄糖異硫氰酸3-丁烯酯、葡萄糖異硫氰酸4-戊烯酯、葡萄糖異疏氰酸2-羥基-3-丁烯酯和葡萄糖異硫氰酸2-羥基-4-戊烯酯。這種甘蘭型油菜植物的種子有利于提取食用油。實驗小孢子衍生胚實驗1-2描述了用小孢子衍生胚作為靶組織所進行的研究工作。按照本領域技術人員已知方法(例如參見Swanson等，1987)分離出小孢子，將小孢子在NLN培養基(對于本發明所使用的所有培養基的組分，可參見小標題為"培養基配方，，的部分)中大約培養11-14天。然而，可將小孢子衍生胚培養11-20天。胚由小孢子產生，肉眼可觀察到。小孢子衍生胚的大'J、一般〈lmm,胚為球形或心形。收集小孢子衍生胚以富集有生命力的胚。例如，這可以用吸液管并將胚轉移到濾紙或濾膜(例如GelmanTM濾膜(產品目錄號60110))上來進行。濾紙或濾膜孔徑可為0.8nm。將胚和濾膜在滲透培養基上進行培養，例如，滲透培養基中可含有17-19%蔗糖+0.8-1°/。瓊脂+lg/LMES,pH6.0。在轟擊前、轟擊期間和轟擊后，對胚進行滲透處理。例如，在轟擊前對胚進行滲透處理4小時。在轟擊中使用的DNA構建體是PHP18644。PHP18644和所用的其它載體見表9。接照本領域技術人員已知方法進行轟擊，每份制備物用大約10ng-5pgDNA，每槍約0.4-1.0微米、15pg-300iig的金顆粒，CaC丄2濃度為0.5M-2.5M,爆破盤為650psi、900psi或1100psi。轟擊后，將胚在滲透培養基上培養4小時至20小時(大致過夜)，然后轉移到液體NLN培養基中。將經過轟擊的胚隨后培養7-14天。將經過轟擊的胚或者從生長3-4周的胚中切取的下胚軸，從液體NLN培養基轉移到固體選擇培養基MMW+IAA+TDZ+K25-50(胚)或MMW+BAP+K25-50(下胚軸)中以誘導發芽。切取抗性再生芽，放在MMW-H+K50-100上進行培養，再生出植林。實驗1:各種^!t盤對用小孢子衍生胚的GUS瞬時表達的影響本實驗的目的是篩選不同的爆破盤以確定可以導致最大轉化效率的爆破盤。A部分將生長了14天的小孢子衍生胚在含有17%蔗糖、lg/LMES和10g/L瓊脂的滲透培養基(pH6.0)上預孵育4小時。小孢子衍生胚用沉積在金顆粒上的PHP18644轟擊(10(Hig/槍)。在轟擊后，將經過轟擊的胚在含有17%蔗糖、lg/LMES和10g/L瓊脂的滲透培養基(pH6.0)上培養4小時，然后在NLN培養基中培養。對450psi、650psi和900psi爆《皮盤進^f亍了測試。用本領域技術人員已知的GUS分析，通過分析經過轟擊的胚來測定瞬時轉化效率。GUS分析的結果見表1。在本實驗中爆破盤900psi產生GUS表達細胞的數目最多。表1:栽培種和爆破盤對用小孢子衍生胚的GUS瞬時表達的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>NLN-13S中培養2-3周。將胚或從胚切取的下胚軸在芽再生培養基MMW+IAA+TDZ+卡那霉素(50mg/L)(胚)或MMW+BAP+卡那霉素(50mg/L)(對于下胚軸)中進行培養。表2表示用不同的爆破盤強度形成抗性枝條的結果。在實驗的B部分中，使用650psi、900psi或1100psi爆破盤未發現顯著差異。650psi和900psi爆破盤最易使用，因為只需要較少時間就能獲得使盤破裂的壓力。因此，將650psi和900psi爆破盤用于隨后的實驗當中。表2還表示由經過轟擊的胚切取的下胚軸節段形成抗性枝條。表2:爆破盤對由經過轟擊的小孢子衍生胚產生抗性芽的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實驗2.經過轟擊的小孢子衍生胚在固體卡那霉素選擇培養基中產生抗性枝條以及通過聚合酶鏈式反應(PCR)分析證實卡那霉素抗性植林本實驗的目的是證實由經過轟擊的小孢子衍生胚產生卡那霉素抗性植抹。所用的構建體是PHP18644，栽培種為46A65。通過轟擊小孢子衍生胚產生卡那霉素抗性枝條。該枝條再生出卡那霉素抗性植抹。用得自西格瑪公司(Sigma)的REDExtract-N-AMPTM植物PCR試劑盒，按照本領域技術人員已知方法分析卡那霉素抗性植林。從14林卡那霉素抗性植株中提取DNA，通過PCR對nptII基因進行分析。表3表明14抹植抹中有12抹存在nptll基因。因此，通過轟擊小孢子衍生胚獲得了穩定的轉基因植林。表3.檢測由經過轟擊的小孢子衍生胚再生出的卡那霉素抗性植抹的nptll基因<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>小孢子衍生的下胚軸實驗3-7描述了用小孢子衍生下胚軸所進行的研究工作。按照本領域技術人員已知方法分離出小孢子，在NLN培養基中培養21-28天(Swanson等，1987)。當胚大小約為3-5mm時，從由小孢子產生的胚上切取下胚軸。將栽培種46A65的小孢子在NLN培養基中培養約21天。在第21天，更換NLN培養基，并用新鮮的NLN培養基稀釋(1:20),將胚再多培養5天。從胚上切取下胚軸，放在MMW+BAP(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)上預處理過夜。將下胚軸轉移到滲透培養基(例如17%蔗糖+1%瓊脂+^/1^]^￡8,pH6.0)上4小時，然后進行轟擊。轟擊所用的DNA構建體是PHP18644。轟擊后，將下胚軸在滲透培養基上大約培養4小時至20小時(例如過夜)。然后，將經過轟擊的下胚軸在MMW+BAP(4mg/L)+卡那霉素(25-50mg/L)上培養以誘導發芽。將再生芽在MMW+卡那霉素(50-100mg/L)或MMW+BAP(0.2mg/L)+卡那霉素(50-100mg/L)上培養，再生出植林。為了測試蔗糖濃度的影響、金顆粒的用量和爆破盤對轉化頻率的影響，進行了下面的實驗。實驗3:滲透培養基中的蔗糖濃度對小孢子衍生下胚軸瞬時GUS表達的影響本實驗的目的是找出滲透培養基中蔗糖的合適濃度(蔗糖+1%瓊脂+lg/LMES,pH6.0)以產生最大轉化效率。對蔗糖濃度15%、17%、19%和21%的測試見表4。結果表明，用19%蔗糖產生的瞬時轉化細胞的數目最多。表4.滲透培養基中的蔗糖濃度對小孢子衍生下胚軸瞬時GUS表達的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實驗4.測定每槍所用金的含量對小孢子衍生下胚軸的瞬時GUS表達的影響本實驗的目的是確定每次轟擊金顆粒的最佳用量。所用的構建體是PHP18644。表5表示用100pg金/槍、200jag金/槍和300iig金/槍的結果。三次實驗的結果不一致。在余下的實驗中使用100(ig金顆粒/槍。表5.每次轟擊時金顆粒的用量對用小孢子衍生下胚軸的GUS瞬時表達的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>本實驗的目的是篩選爆破盤以確定在50mg/L卡那霉素中產生抗性芽數目最多的爆破盤。所用的構建體是PHP18644。表7表示使用450psi、650psi和900psi爆破盤的結果。在本實驗中爆破盤450psi、650psi和900psi之間不存在顯著差異。表7.爆破盤強度對用小孢子衍生下胚軸作為轟擊組織產生卡那霉素抗性枝條的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實驗7.對卡那霉素抗性植林進行GUS分析的結果本實驗的目的是通過GUS分析確定卡那霉素抗性植林的轉基因狀態。表8表示通過GUS分析對7株卡那霉素抗性植林進行分析。6抹植林為陽性。這就證實通過轟擊小孢子衍生下胚軸產生了穩定的轉基因植抹。表8.通過GUS分析確定得自小孢子衍生下胚軸的卡那霉素抗性植林的轉基因狀態<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>預孵育小孢子實驗8-17描述了用預孵育小孢子進行的研究工作。將小孢子在NLN-17S/10S中培養2-10天。最好將小孢子培養5-7天。肉眼無法觀察到胚。用NitexTM篩(孔徑15-36inm)或珀可(Percolf)(35-45o/o)梯度離心收集胚發生性小孢子，使之保持生命力和胚發生性。預將育小孢子被用作受轟擊材料。可以使用通過小孢子培養能夠再生的任何蕓苔屬品系。將小孢子在NLN-17S中于31.5。C培養l-3天，然后在NLN-10S中于25。C培養4-5天。用于轟擊的構建體是PHP18644、PHP21965、PHP22024、PHP22021和PHP23560(參見表9)。構建體可以是完整的質粒或者僅是表達盒。例如，PHP22024既可是表達盒又可是完整質粒。預孵育小孢子用孔徑為15|am-36pm的篩進行過濾。所收集的小孢子用于轟擊。將小孢子裝入15pm或20pm篩的兩層濾紙上，在1分鐘內干燥。將小孢子和篩轉移到含有B5組分、lg/LMES和0.8-1.6%脫乙酰吉蘭糖膠、15-21%蔗糖的滲透培養基(pH6.0)上。轟擊前，將小孢子在滲透培養基上處理至少1小時。預孵育小孢子每份制備物用12.5ng-5pgDNA、每槍15-100ngAu顆粒、2.5MCaCl2和650-900psi爆破盤進行轟擊。在轟擊期間將預孵育小孢子表面暴露在包被有DNA的轟擊顆粒的通道(即該表面不埋入培養基中)。轟擊后，將經過轟擊的小孢子在滲透培養基中培養至少4小時。將容納小孢子的一個或兩個篩在5mlNLN-13S(含或不含草甘膦/板)中避光培養約7天。7天后，每個板被消耗的培養基用10mlNLN-6.5S更換，或者將被消耗的培養基稀釋以使各板蔑糖濃度為6.5%。如果選擇標記基因是NPTII基因，則將NAA、BAP和G418加到培養基中。如果選擇標記基因是GAT，則在培養基中加入草甘膦。將胚在這種含有6.5。/。蔗糖的培養基中，在約240英尺-燭光或2,583勒克斯的暗光下進行培養。G418的終濃度為10mg/L,草甘膦的濃度為O.lmM或0.2mM。任選將加倍劑加到培養基中。培養2-3周后記錄抗性胚。利用預孵育小孢子將PHP18644和GAT(草甘膦乙酰基轉移酶)構建體(參見表9)用于轉化實驗。從細菌中分離出GAT基因，見Castle等(2004)5Wewce304:1151-1154。將該基因進行11輪改組以提高草甘膦乙酰基轉移酶的表達水平。每輪改組都有1個到若干個變異體。PHP18644還含有GUS標記基因。所用構建體見表9。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>有關該方案的詳述，可參見下列實施例中標注為"方案"的部分。實驗8:采用遺傳霉素(Geneticin)(G418)(SigmaG8168)繪出篩選殺死曲線本實驗的目的是確定殺死非轉基因小孢子的G418濃度。在本項實驗前，在固體培養基上而不是在液體培養基中進行篩選。利用液體篩選蕓苔屬轉基因細胞是新的方法。在液體培養基中進行篩選是有利的，原因至少有下列幾點(a)允許早期進行篩選，從而免除隨后轉移外植體的需要，(b)使篩選更純，因為當外植體在液體培養基中時，外植體一般較小，而且液體使得外植體的所有表面都暴露于選擇劑中，(c)降低了嵌合的頻率，和(d)需要的選擇劑含量較低，因此降低了對研究人員和環境的毒性。對不同濃度卡那霉素對生長在液體培養基中的胚的影響進行了試驗。結果顯示，10mg/L卡那霉素足以漂白未經過轟擊的胚并抑制未經過轟擊胚的生長。然而，10mg/L和20mg/L的卡那霉素無法抑制經過轟擊胚的生長，雖然該胚的顏色呈淺綠色和紫色。因此，難以將轉基因組織或胚與非轉基因組織或胚區別開來。在NLN加上6.5°/。蔗糖的培養基中用5-10mg/LG418替換卡那霉素，使篩選更純。表IO表示5-10mg/LG418足以將轉化細胞與未轉化細胞區別開來。表IO.G418對胚生長和存活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實驗9:預孵育小孢子經過轟擊后，隨即在含有G418或草甘膦的液體培養基中篩選，產生G418和草甘膦抗性組織和抗性芽本實驗的目的是通過轟擊培養了多達11天的預孵育小孢子，在補充了10mg/LG418或O.lmM和0.2mM草甘膦的液體培養基中篩選出抗性組織和抗性芽，從而獲得轉基因植抹。在第一批實驗中，將生長了7天、8天、9天和11天的預孵育小孢子用PHP18644轟擊。將兩種生長調節劑NAA(0.5mg/L)和BAP(0.05mg/L)加到含有10mg/LG418的選擇培養基中以改進細胞生長條件。將抗性小孢子轉移并培養在選擇培養基MMW+IAA+TDZ+AgNO35+C+K100中以謙導抗性芽并證實抗性。因此，篩選始于含有G418的液體培養基，并在使用卡那霉素的固體培養基中完成。在第二批實驗中，將生長了3天、4天和5天的預孵育小孢子用PHP23560轟擊。將草甘膦加到液體和固體培養基中進行篩選。實驗結果見表ll。數據表明轟擊預孵育小孢子后，用G418或草甘膦在液體培養基中進行篩選產生了抗性芽和PCR陽性枝條。表ll.預孵育期對抗性芽產生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實驗IO.測定轟擊后滲透培養基對抗性胚產生的影響本實驗的目的是測定轟擊后將經過轟擊的組織在滲透培養基上培養是否提高轉化效率。表12表明轟擊后將經過轟擊的預孵育小孢子在滲透培養基上培養4小時，比轟擊后未隨即培養在滲透培養基上的經過轟擊的預孵育小孢子產生數量較多的轉基因部分。滲透處理后，將經過轟擊的預孵育小孢子培養在液體NLN培養基中。表12.轟擊后滲透培養對抗性胚產生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實驗12.草甘膦抗性胚的篩選用PHP22021和PHP22024轟擊預孵育小孢子后在含有O.lmM和0.2mM草甘膦的液體培養基NLN-6.5S中進行篩選本實驗的目的是比較草甘膦濃度對篩選效率的影響。表15表示用O.lmM或0.2mM兩種濃度的草甘膦可以鑒定出抗性胚。產生了正常胚和異常胚。盡管用O.lmM和0.2mM兩種濃度的草甘膦都可以鑒定出轉基因胚，但是用0.2mM篩選得到的假陽性結果較少。它更加有效并且免除了額外的轉移。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實驗13.測定滲透培養基中的蔗糖濃度對抗性胚產生的影響本實驗的目的是找出滲透培養基中蔗糖的最佳濃度。采用17S/10S方案將小孢子培養4-7天。所用的構建體是PHP23560，DNA濃度為28ng/制備物。爆破盤為900psi。將經過轟擊的小孢子在含有加倍劑和0.2mM草甘膦的NLN-13S中避光培養7-10天。培養物用不含草甘膦的NLN-0S至含有O.lmM草甘膦的NLN-6.5S進行稀釋。經稀釋的培養物在光下孵育2-3周。用15%、17%和19%蔗糖產生的綠色胚(正常和異常)數目無顯著差異。重復實驗見表16。本實驗的結果顯示4次實驗中17%蔗糖濃度獲得的結果與19%蔗糖濃度的相似。表16.滲透培養基中的蔗糖濃度對抗性胚產生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實驗14.測定滲透處理時間對抗性胚產生的影響本實驗的目的是測定在滲透培養基中培養4小時或20小時是否導致數目更多的轉基因事件。所用的構建體是PHP21965。將小孢子預孵育6-7天，然后用25|aMNitexTM篩收集。隨后將收集到的小孢子加到孔徑為20pm的NitexTM篩中。轟擊后，將經過轟擊的小孢子和NitexTM篩在滲透培養基B5+lg/LMES+190g/L蔗糖+12g/L脫乙酰吉蘭糖膠(pH5.8-6.0)上培養4小時或20小時。表17顯示處理小孢子4小時產生的抗性胚數與處理小孢子20小時的相當。表17.滲透處理時間對抗性胚產生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實驗15.測定;^L盤強度對抗性胚產生的影響本實驗的目的是比較650psi和900psi爆破盤強度對抗性胚產生的影響。構建體PHP23560用于轟擊。共進行了9次實驗，以對650psi和900psi強度的爆破盤進行比較。650psi和900psi強度的爆破盤之間未發現顯著差異(表18)。爆破盤650psi比900psi爆破盤易于使用，因為只需要較少時間便可達到氦氣壓力。表18.爆破盤強度對抗性胚產生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實驗16.PCR分析證實通過轟擊預孵育小孢子產生轉基因植林在33次轉化實驗中，用PCR分析證實125抹抗性植抹呈陽性。平均每次實驗產生3.8抹轉基因植抹(表19)。PHP22024和PHP22021的數據包括用DNA表達盒和完整質粒兩種情況所得出的數據。例如，在PHP22024下所列的13次實驗中，9次是用質粒進行的，而4次是用表達盒進行的。GAT陽性植株的數目分別為55和34。表19.抗性植林的PCR分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實驗17.GAT轉基因植林的轉基因拷貝數分析被鑒定為草甘膦抗性的轉基因(T1)植抹用DNA印跡雜交分析法進行分析。用十六烷基三曱基溴化銨(CTAB)緩沖液提取植物基因組DNA(Rogers等，(1994)尸/a"fMo/ecw/w所o/ogyMa"wa/，第二版，1:1-8)。DNA樣品用Bamffl或PstI消化。雜交探針是GAT基因。按照Rajasekaran等人的方法((2000)尸/a"fCe〃19:539曙545)進行雜交。對于每次消化，采用雜交印跡，由數目最多的條帶確定GAT基因拷貝數。例如，如果對于一次事件從BamHI和PstI印跡只產生一個條帶，則表明該事件具有1個拷貝的GAT基因。42次事件的結果顯示H次事件(或40%)僅有1個拷貝的GAT基因(表20)。表20:GAT轉基因植林的轉基因拷貝數分析<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>本說明書中所提及的所有出版物和專利申請代表著本發明所屬領域技術人員的水平，并且通過引用結合到本文中。雖然為了清楚理解本發明，本發明之前已通過示例和實施例進行了一些詳述，但是顯而易見的是，可以在所附權利要求的范圍內進行某些變動和修改。方案預孵育小孢子的產生按照本領域技術人員已知方法培養小孢子，例如參見Fukuoka等(1996)尸/W"/:W-47;Keller等(1987)尸toc.7"/"f./ape化edCowgr.(PlantBreedingandAcclimatizationInstitute,Poznan,Poland)第152-157頁，Swanson等(1987)尸/爐Ce〃i印oW6:94-97和Baillie等(1992)戶/a"fCW/"e;ows11:234-237。詳細方法如下在對小孢子培養敏感和再生敏感的蕓莒屬品種(例如46A65、Westar或Topas)在單核小孢子期收集大約400個芽。將芽放入5%次氯酸鈉溶液(100%商用漂白溶液)中消毒，并放置15-20分鐘。將芽放入無菌水中5分鐘以漂凈漂白液。重復該步驟多兩次。取芽放入攪拌杯中，加入20-25mlB5-W后低速攪拌8秒鐘。將內容物通過2個嵌套44|imNitex過濾器過濾到50ml離心管中。用20-25mlB5-W洗滌過濾器，蓋上離心管，以約1,000轉/分鐘(rpm)離心6分鐘。傾析出B5-W,加入45mlB5-W，離心，再傾析，加入45mlB5-W后離心，共重復洗滌4次。小孢子接種前，采用血細胞計數器用NLN-17S調節小孢子密度至IOO，OOO個小孢子/ml。將小孢子懸液按6ml/板接種到9cm板上。將各板(大約40個)在31.5。C下培養2-3天，然后在NLN-10S中培養。將各板在25。C下再培養3-4天。粒子轟擊粒子轟擊方法為本領域技術人員所知。購買粒子槍時會提供詳細的說明書和步驟。例如，參見生物射彈PDS-1000/He粒子遞送系統(BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem)指南。更多文獻可參見Sanford等，美國專利第4,945,050號;Tomes等，美國專利第5,879,918號；Tomes等，美國專利第5,886,244號；Bidney等，美國專利第5,932,782號；Tomes等(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment(通過樣史彈轟擊指導DNA轉移到完整植物細胞內)，，，栽于PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,編輯Gamborg禾口Phillips(Springer隱Verlag,Berlin)和McCabe等(1988)5/ofec/z"o/ogv6:923-926。詳細步驟如下金顆粒的等分使用直徑為0.6微米的250mg金顆粒。加入lOOOjilEtOH并用超聲處理5-8秒鐘。將金懸液分為兩管(各500|11)(Fisher05-541-27)。離心(13,000rpm)1分鐘，用吸液管吸出EtOH。用lml無菌蒸餾水洗滌三次。金沉淀用lOOOplEtOH洗滌，用吸液管吸出EtOH。向各管中加入800plEtOH,使金顆粒懸浮。將16只管(Fisher05-541-27)稱重。將100pl金懸液等分至各管中。離心30秒鐘，用吸液管吸出EtOH。干燥1小時，將管/金稱重以計算各管中的金重量。向各管加入無菌水調節金濃度至3mg/50nl。用吸液管吸取-釋放使金顆粒懸浮，進行超聲處理(3秒鐘)。將金懸液按50pl/管(3mg/管)等分到新的1.5ml管中。保存于-20。C冰箱內。將DNA包,皮在金顆粒上每槍金顆粒的量為100ng/槍(3mg/30槍)。將3pgDNA/bp/制備質粒DNA、50|alCaCl2(2.5M，等分成小體積)、20fal亞精胺(0.1M，游離堿，等分為小體積)加到金顆粒等量管中。加入每一種成分后用吸液管吸打30-50次。在渦旋振蕩器中振蕩3分鐘。以10,000rpm離心10秒鐘，棄去上清液。緩慢加入200^1100%EtOH，放置在冰浴中10分鐘，棄去上清液。用200^1100%EtOH緩慢洗滌兩次，棄去洗滌液。加入150pl100%EtOH。用10p吸液管頭使金沉淀懸浮。將金顆粒充分懸浮。超聲處理3!/2dips以使小沉淀破碎。將巨載體盤(macro-carrierdisc)放入70%EtOH中消毒最少10分鐘。轉移到100%EtOH后在超凈工作臺中干燥。將5^1包被有DNA的金顆粒懸液加到無菌巨栽體盤的中央并干燥至少0.5小時。生物射彈槍操作可通過將孩吏載體發射裝配件(microcarrierlaunchassemblypart)、巨載體固定器、爆破保持蓋(ruptureretainingcap)、巨載體、培養皿固定器和終止屏(stoppingscreen)浸泡在70%EtOH中(或用70%EtOH噴灑)15分鐘并在超凈工作臺上進行干燥滅菌，或者可通過高壓滅菌進行滅菌。可將爆破盤放入50%異丙醇中消毒10-30秒鐘。噴灑70。/。EtOH對槍膛(chamber)消毒。建立大于爆破盤的氦氣壓力。裝填帶有蓋和微載體發射組件的爆破盤，并裝配到槍膛中。將微載體發射組件放在頂部下第一個槽中。將樣品安置在培一固定器的第三槽上。關閉槍膛。將基因槍的真空開關設在VAC位置。一旦達到真空水平，或者超過27英寸Hg,便將真空開關設在HOLD位置。按下FIRE開關不放直到爆破。迅速松開點火開關，將VACUUM轉到VENT位置。釋放真空后，取出樣品和微載體發射組件。重復直到完成對所有樣品的轟擊。預孵育小孢子的轟擊與篩選采用NLN-17S/10S方案培養小孢子6-8天。用孔徑為25pm的Nitex尼龍篩收集小孢子。將小孢子轉移到一塊Nitex尼龍篩上，用額外的培養基滲入濾紙。將小孢子和Nitex轉移到滲透培養基(B5+17%蔗糖+lg/LMES+0.8。/。脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.0)上，處理至少1小時。用爆破盤650psi或卯0psi轟擊樣品。使樣品留在滲透培養基上至少4小時。將小孢子和Nitex轉移到NLN-13S中。加入染色體加倍劑。培養基不含選擇劑(nptll選擇)或含有0.1-0.2mM草甘膦(GAT選擇)。各板(9cm)裝有5ml培養基和一塊小孢子/Nitex。將經過轟擊的小孢子于25。C避光培養7天。如果用叩tll基因作為選擇標記，則將原培養基更換為10mlNLN-6.5S與最終濃度的NAA0.5BAP0.05+G418(10mg/L)，或者如果用gat基因作為選擇標記，則加入5mlNLN-0S與草甘膦0.1-0.2mM。在光下培養2周。植物再生將綠色胚或組織在含有25mg/L卡那霉素或O.lmM草甘膦的MMW+IAA2+TDZ0.5+STS6中培養4周(STS6為濃度為6|iM的疏代辟u酸銀)。分離出再生芽，在MMW+BAP0.2或B5+GA與50mg/L卡那霉素或O.lmM草甘膦中進行培養。切取枝條并轉移至含有25mg/L卡那霉素或B5+GA與O.lmM草甘膦的生根培養基1/2MMW+l。/。蔗糖+IBA2中。將抗性植林移栽到土壤中以及PCR分析當根充分發育后，將抗性植林移栽到36區淺苗床(36-ce11flat)的土壤中。為了保持濕度，在頂部加蓋，為時l周或者直到枝條自身在土壤中伸展。用得自西格瑪公司(Sigma)的PCR試劑盒(REDExtract-N-Amp植物PCR試劑盒)，通過PCR分析測定轉基因。須將轉基因植抹標注為"轉基因"或"GMO"。GUS分析GUS分析為本領域技術人員所知。該方案可參照多種參考文獻，例如WuH,McCormacAC,ElliottMC,ChenDF(1998)Agrobacterium-mediatedstabletransformationofcellsuspensionculturesofbarley(//orafew附vw/gare)(土i裏4干菌介導的大麥(Z/orafew附vw/gaz-e)纟田月包懸'液培養物的穩、定4I^匕)。Ce〃77^"ea"dCw/m"54:161-171。GAT和NPTII基因的PCR分析PCR分析為本領域技術人員所知。該方案可參照多種參考文獻。例如，按照以下文獻進行nptll基因的PCR分析BroothaertsW,WiersmaPA,LaneWD((2001)MultiplexPCRcombiningtransgeneandS-allelecontrolprimerstosimultaneouslyconfirmcultivaridentityandtransformationinapple(結合轉基因和S-等位基因控制引物的多重聚合酶鏈式反應以同時證實蘋果栽培種的特性和轉化)，CW/20:349-353)。按照SigmaTM技術公才艮代碼(TechnicalBulletinCode)MB-850并應用REDExtract-N-AmpTM植物PCR試劑盒提取植物DNA。對于GAT基因擴增，溫度循環為95。C,2分鐘；(94°C，30秒鐘；64°C，30秒鐘；72°C,30秒鐘)共35次循環；75°C,5秒鐘，或者對于nptll基因，為95°C,2分鐘；(95°C，15秒鐘；60°C,30秒鐘；72°C，30秒鐘)共35次循環；75°C，5秒鐘。產物大小GAT4604和4618:317bp;GAT4621:255bp;NPTII:700bp。PCR反應<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>DNA印跡雜交分析DNA印跡雜交分析為本領域4支術人員所知。參見例如Rajasekarran等(2002)尸/a"fCe〃/e/.19:539-545。培養基配方MMWMS鹽和有才幾物(Murashige和Skoog1962T^yw'o/.尸/aw^15:473-479)蔗糖(3%)MES(2g/L)西格瑪公司的瓊脂#1296(0.6%)pH5.8MMW+IAA+TDZ+AgN03+GlyMMWIAA(2mg/L)TDZ(0.5mg/L)硝酸銀(5mg/L)草甘膦(O.lmM)MMW+BAP+Kan25-50MMWBAP(4mg/L)卡那審素(25-50mg/L)MMW+kan50-100MMW卡那霉素(50-100mg/L)B5B5維生素和礦物質(Gamborg等(1968)五x;.Ce〃"".50:151-158)蔗糖(2%)西格瑪7>司的瓊脂(0.6%)pH5.8B5+GA+GlyB5GA3(0.1mg/L)草甘膦(O.lmM)B5-WB5(無瓊脂)蔗糖(130g/L)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>各成分參見Lichter(1982)ZP/7a"ze"p/^/0/105:427-434,其中不含馬鈴薯培養液和植物生長調節劑。培養基pH為6.0。NLN畫17S，NLN國10S，NLN-6.5SNLN含有17。/。、10%或6.5°/。嚴糖用于預孵育小孢子的滲透培養基B5蔑糖170g/LMES(1g/L)植物凝膠(Phytagel)(8-16g/L)pH:6.0生才艮培養基(1/2MMW+1%蔗糖+2IBA)1/2MMW蔗糖(10g/L)IBA(2mg/L)*商品名引用的參考文獻1.Ahmen等(2000)W00001223。2.Albertsen等(1999)US5,962,769。3.Allison等(1986)F/ro/ogy154:9-20。4.Baillie等(1992)Ce〃ie/om11:234-237。5.Baim等(1991)/VocAto/.爿cadSd.USA88:5072-5076。6.Ballas等(1989)iVwc/e!'c爿cMy及m.17:7891-7903。7.Barkley等(1980)載于TheOperon，第177-220頁。8.Block和Debrouwer(1993)尸/a"to189:218-225。9.Beck等(1982)19:327-336。10.Beetham等(1999)Pwc.TVa".Jco^.USA96:8774-8778。11Bidney等，美國專利第5,932,782號。12.Bonon(1993),博士論文，UniversityofHeidelberg。13.Brown等(1987)Ce//49:603-612。14.Campbell和Gowri(19卯)戶/a"fi^"/o/.92:1-11。15.Canevascini等(l996)尸/a"/7V^zW112(2):513-524。16.Castle等(2004)腸"ce304:1151-1154。17.Chalfie等(1994)Sc/e"ce263:802-805。18.Chamberland等(l992)尸/a"/Mo/.5!o/.19:937-949。19.Chandrasekharan等(2003)尸/a"/J33:853-866。20.Chen和Beversdorf(1994)7Tzeor".^p;/.88:187-192。21.Christensen等(1989)尸/fl"fMo/.歷o/.12:619-25632。22.Christensen等(l992)P/a"/Mo/.歷o/.18:675-689。23.Christopherson等(1992)Prac.Ato/,爿cadUSA89:6314-6318。24.Chye和Zhao(2003)US20030097682。25.Degenkolb等(1991)爿""w/cro6.CTzewo^er35:1591-1595。26.Della陽Cioppa等(1987)戶/fl"f尸/^wo/.84:965-968。27.Deuschle等(1989)Pwc.v4cW.USA86:5400-5404。28.Deuschle等(1990)248:480-483。29.Elroy-Stein等(1989)iVoc.AW/.Jo^.Sd.USA86:6126-6130。30.Figge等(1988)Ce〃52:713-722。31.Fuerst等(1989)A^/.^cc^5W.USA86:2549-255332.Fukuoka等(1996)P/^/o/.Ill:39-47。33.Fukuoka等(1998)P/a"rCd/iepor"17:323-328。34.Gallie等(1989),載于MolecularBiologyofRNA，編輯Cech(Liss,NewYork),第237-256頁。35.Geiser等(1986)48:109。36.Gill等(1988)iVa加re334:721-724。37.Gossen等(1992)iVoc.A^/爿cadSc/.USA89:5547-5551。38.Gossen(1993),博士論文，UniversityofHeidelberg。39.Guerineau等(1991)Mo/.Ge".262:141-144。40.Guevara-Garcia等(1993)尸/aW4(3):495-505。41.Hanson等(1997)Mo/.Ge"254(3):337-343。42.Hillenand-Wissman(1989)7b;nhMo/,S^wc.10:143-162。43.Hlavka等(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,第78巻，(Springer-Verlag,Berlin)。44.Hu等(1987)Ce〃48:555-566。45.Jefferson等(l986)iVoc.Ato/.」cad5W.f75L483:8447-8451。46.Jefferson等(1987)6:3901-3卯7。47.Jobling等(l987)Atowen622-625。48.Jones等(1994)266:789。49.Joshi等(1987)M/c/dcJc/flf15:9627-9639。50.Kawamata等(l997)尸/a"/Ce〃^/zj^/o/.38(7):792-803。51.Keller等(1987)iVoc./加WapejeedCo"gr(PlantBreedingandAcclimatizationInstitute,Poznan，Poland),第152-157頁。52.Kirihara等(1988)Ge"e71:359。53.Kleinschnidt等(1988)所oc/e脂;y^y27:1094-1104。54.Labow等(1990)Mo/,Ce〃.歷o/.70:WW-335(5。55.Lam(1994)te/toiVoWCW/D晚r20:181-196。56.Last等(1991)77eor^;p/.81:581-588。57.Lilley等(1989)/VoceW"gso/AeCowgre^o"iVofe/wC/"7/zfl"ow//w附a"Foofifrawd爿w'wa/Feedlsfw^(人類食4勿和動4勿々司灃+應用植物蛋白質世界大會會議錄)，編輯Applewhite(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois),第497-502頁。58.Lommel等(1991)Wro/ogy81:382-385。59.Macejak等(1991)iVa^"e353:90-94。60.Maraschin等，200556:1711-1726。61.Martin等(1993)Scz.ewce262:1432。62.Matsuoka等(1993)/VociVa".爿cad5W.USA卯(20:9586-9590)。63.Mazodier等(1985)iVwc/e/cJc/A13:195-205。64.McCabe等(1998)說o/ec/mo/ogy6:923-926。65.McElroy等(1990)P/"WCe〃2:163-171。66.Mindrinos等(1994)Ce〃78:1089。67.Mogen等(1990)Ce〃2:1261-1272。68.Moloney等(1989)尸/a加Ce//ie/oWj8:238-242。69.Mu腦e等(19卯)Ge"e91:151-158。70.Murray等(1989)iVwc/e/c爿c^7:477-498。71.Musumura等(1989)尸/朋/Mo/.歷o/.12:123。72.Nehlin等(2000)P/fl^P;^w'o/,第156巻175-183。73.Odell等(1985)Atow"313:810-812。74.Oliva等(1992)顛/w/cro6.C7zewo//zer.36:913-919。75.Orozco等(1993)Mo/.5/。/.23(6):1129-1138。76.Pedersen等(1986)/說o/.261:6279。77.Prem等，2005,/"W/roCe〃.Dev.5/o/.-Plant41:266-273。78.Proudfoot(1991)CW/64:671-674。79.Radke等(1992)尸/aWCe//11:499-505。80.Rajasekarran等(2002)P/a"fCe〃及e/)oWj19:539-545。81.Rasco國Gaunt等(2003)尸/a"fCe〃21:569-576。82.Reines等(1993)Ato/.爿cadUSA卯1917-1921。83.Reznikoff(1992)Mo/.M/cro6w/.6:2419-2422。84.Rinehart等(1996)尸/a"/尸/^fo/.112(3):1331-1341。85.Russell等(1997)7Varagemc6(2):157-168。86.Salmeron等(2003)US6528702。87.Sanfacon等(1991)Dev.5:141-149。88.Sanford等，美國專利第4,945,050號。89.Schubert等(1988)Sor"eno/.170:5837-5847。90.Stewart和Broadway(2005)US6927322。91.Swanson等(1987)戶/a"/Ce〃7e;o";y6:94-97。92.Swanson等(1989)7Tzeor^;/78:525-530。93.Thompson等(l989)歷0￡<3^10:108。94.Tomes等，美國專利第5,879,918號。95.Tomes等，美國專利第5,886,244號。96.Tomes等(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCallsviaMicroprojectileBombardment(通過孩i彈轟擊指導DNA轉移到完整才直物細胞內)",載于戶/a"/1Ce〃，Hwwe,CVga"Cw/rt/re:Fundamental.Methods,編輯Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)。97.Touraev(1996)Se;c尸/a"f9:209-215。98.VanCamp等(1996)P/a"fP/^wo/.112(2):525-535。99.VanDamme等(l994)尸/a"fAfo/.5/o/.24:825。100.Velten等(1984)J.3:2723-2730。101.Williamson等(1987)5wr.J!165:99-106。102.Wyborski等(199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